Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

spontan aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturarak yendi her kalbin başlatan kalbin doğal kalp pili olarak Sinoatriyal düğüm miyositler (SAMs) hareket. Bu kalp pili APs çok sayıda membran akımları ve hücre içi kalsiyum bisiklet koordineli etkinliğini yansıtır. Ancak SAMs spontan pacemaker aktivitesi sürücü kesin mekanizmalar halen mevcuttur. Akut izole SAMs deneyler kalp kalp vurusu moleküler temelini incelemek için önemli bir hazırlık vardır. Ancak, belirsiz anatomi, karmaşık mikrodisseksiyon ve titiz enzimatik sindirim koşulları akut izole SAMs yaygın kullanımını engellemiştir. Buna ek olarak, yöntemler, protein ekspresyon çalışmaları için SAM uzun dönemli kültür izin vermek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Burada erişkin farelerden SAM izolasyonu için adım adım protokolü ve video gösterimi sağlar. Bir yöntem olup, aynı zamanda in vitro ve in expressi yetişkin fare SAMs muhafaza etmek için gösterilmiştirAdenoviral enfeksiyon yoluyla ekzojen proteinlerin ilgili. Akut izole edilmiş ve bu yöntemlerle elde kültürlenmiş SAMs elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları çeşitli için uygundur.

Kalp pili, kalbin sinoatriyal düğüm miyositler (sinoatriyal miyositler, "SAMs") her kalp atışı başlatmak için miyokardın yayılması spontan ritmik aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturur. Birçok türlerden akut izole SAMs kullanarak deneyler pacemaker aktivitesi oluşturulmasına katkıda mekanizmaların aydınlatılması için gerekli olmuştur. SAMs morfolojisi, fonksiyon ve protein ifade bakımından atriyal ve ventriküler miyokardın kendi muadilleri önemli ölçüde farklılık çok özel kardiyomiyositlerde vardır. SAMs spontan AP damgasını sonraki AP ^1,2 tetiklemek için eşik membran potansiyeli sürücüler diyastol sırasında bir spontan depolarizasyon olduğunu. Bu, "kalp pili potansiyeli" farklı "komik Geçerli" (I _f) de dahil olmak üzere membran akımları, T ve L-tipi kalsiyum akımları ve sodyum-kalsiyum değiştirici Curr koordineli aktivitesine bağlısarkoplazmik retikulum ^3,4 Ca ²⁺ salınımı tarafından yönlendirilen ent (I _NCX).

akut izole fare SAMs kalp vurusu çalışmaları için önemli bir deneysel hazırlık iken fare SAN belirsiz anatomi ve küçük boyutlu bir nüanslı mikrodiseksiyon ve kombine enzimatik ve mekanik gerektirdiğinden, farelerden alınan SAMs izolasyonu benimsemeye zor bir yöntem olabilir hücre ayrışma dikkat optimizasyon gerektirir.

Biz burada başarılı yama kelepçe kayıtları ^5-8 yetişkin farelerin SAMs izole etmek için kullanılan bir protokol ayrıntılı bir video gösteri sunar. Bildiğimiz kadarıyla, başka bir kaynaktan temin böyle bir görsel gösteri var. Buna ek olarak, yeni bir yöntem olup, burada gösterilmiştir erişkin farelerden böylece genetik olarak kodlanmış proteinlerin giriş izin, birkaç gün, in vitro olarak korunabilir SAMs izoleAdenoviral enfeksiyon ⁹ vasıtasıyla haberci moleküllerin veya RNAi.

Tüm hayvan prosedürleri Colorado Anschutz Tıbbi Campus Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır protokollere uygun olarak yapıldı. Standart protokol aşağıda yaşı 2-3 ay erkek C57BL / 6J fareler kullanılarak optimize edilmiştir.

1. Deneylerin Advance Çözüm Stoklar ve Malzemeleri hazırlayın

NOT: Gerekli ekipman ve malzeme malzemeleri Tablo bakın.

1. Komple Tyrode, Düşük Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} Tyrode en Modifiye Kraft-Brühe (KB) Çözüm ve Sığır Serum Albumin (BSA) Çözüm: Tablo 1'de gösterildiği gibi 1 L aşağıdaki çözümlerden her hazırlayın. Kullanım ultra saf tüm çözümler için deiyonize su süzülür. en fazla altı ay boyunca 20 ° C'de her biri 50 ml'lik miktarlar halinde solüsyonu ve mağaza bölün. hemen deneyler önce bireysel alikotları çözülme ve bir haftaya kadar 4 de için saklamak6 ° C.
2. Ultra saf süzülmüş deiyonize edilmiş su (Tablo 1) NaCI _ve CaCl2 çözülmesiyle, 10 mM NaCl ve 1.8 mM _CaCl2 İntibak çözeltisinin 50 ml hazırlayın. altı aya kadar oda sıcaklığında saklayınız.
3. mikrofüj tüplerine pipetleme elastaz 4.75 enzim aktivitesi birimi (U) alikotları hazırlayın. en fazla üç ay süreyle 4 ° C'de saklayın.
4. Mikrofuge'de tüpler içine pipetleme kollajenaz-proteaz enzim karışımının (ultra saf H ₂ O) 375 mg alikotları hazırlayın. üç aya kadar -20 ° C'de saklayın.
5. (Şekil 1Aiv ve Şekil 1C ~ 1.5 mm nihai açılış çap) ve ayrışma için bir (~ 2 mm çap; Şekil 1Aiii ve Şekil 1C) iki yangın cilalı Pasteur pipet, doku transferi için bir hazırlayın.
   1. Skor Pasteur, bir cam kesici ile pipetler ve istenen boyuttan biraz daha büyük bir açıklık üretmek için skor boyunca oturtun. Ateşkalın cilalı duvar ve istenen çapta bir açılış üretmek için Bunsen beki üzerinde Kısık ateşte ~ 30-60 saniye boyunca her pipet kesik ucunu -Lehçe. yangın cilalı açılış herhangi bir çatlak veya pürüzlü kenarlara serbest olduğundan emin olun.
6. Ekleyerek iki diseksiyon yemekleri hazırlamak ~ 25 ml silikon elastomer her 100 mm Petri kabı üreticinin talimatlarına (Şekil 1Ai ve Şekil 1B) göre karışık. 48 saat oda sıcaklığında bekletilmelidir.
7. Kültür için sadece: ml'lik 25-50 hazırlamak her Kaplama Orta ve Tablo 2'de göre Kültür Orta Mağaza iki haftaya kadar 4 ° C..

2. hazırlayın Çözümleri Hücre İzolasyon günü Kullanılacak

NOT: Aşağıdaki tutarlar bir fareden sinoatriyal miyositler izolasyonu için vardır.

1. Ekle 2.5 Düşük Ca mi ²⁺ üç küçük, yuvarlak tabanlı kültür tüpü her bir / Mg2 ⁺ Tyrode (pH 6.9)s. 35 ± 1 ° C su banyosunda yerleştirin borular.
2. Düşük Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} Tyrode için büyük bir yuvarlak dipli bir kültür tüp 2.5 ml ekleyin. Bu tüp, 1 kısım (4.75 U) elastaz ve bir kısım (375 ug), kolajenaz-proteaz enzimi karışımını ekleyin. karıştırmak için girdap. 35 ± 1 ° C su banyosunda yer tüpü.
3. Üç ilave küçük, yuvarlak dipli bir kültür tüpleri ve ek büyük, yuvarlak tabanlı kültür tüpüne KB aracı maddesi içinde 2.5 ml. 35 ± 1 ° C su banyosunda yerleştirin borular.
4. büyük bir yuvarlak tabanlı kültür tüpü BSA çözeltisi ~ 7 ml ekleyin. Oda sıcaklığında bu tüp tutun.
5. 50 ml'lik bir cam kaba (Şekil 1Aii) tam Tyrode çözeltisi 20-40 ml yerleştirin. karıştırmak için 10 USP / ml heparin, girdap ekleyin ve 35 ± 1 ° C su banyosunda beher yerleştirin.

Kültür Hücreler (Akut İzole Hücreler için bu adımlar atla) 3. Ek Çözümler ve Materyalleri hazırlayın

1. steril doku kültürü kaputu, 24 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde fare başına iki adet 12 mm yuvarlak cam lameller üzerine yerleştirin.
   NOT: Kuyular sonraki viral enfeksiyonlar için hacmini sınırlamaya yarar uygun bir boyut, çünkü 24 plaka kullanılır.
2. Pipet, her lamel üzerine steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltilmiş fare laminin bir 100 ng / ml çözelti, yaklaşık 200 ul.
3. 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde izolasyon (en az 1 saat) boyunca laminin ile lamelleri inkübe edin.
4. Pre-sıcak Kaplama Orta ve kültür ortamında 37 ° C (Kademe 1.7 ve Tablo 3'ten).

4. Sinoatriyal Düğüm İzolasyon

1. Kimyasal davlumbaz, iki odacık kutusunun bir odasında bir fare koyun ve diğer odasına bir pamuklu çubukla aracılığıyla tanıtıldı ~ 200 ul sıvı izofluran ile uyutmak. Bir ayak tutam (genellikle 30-60 sn ~ içinde) anestezi onaylayın. euthanizeservikal dislokasyon ile fare.
   Not: Boş 1 ml pipet ucu kutusu, iki odacık kutusunu oluşturmak için kullanılabilir; doğrudan temas fare önlemek için izofluran için ayrı bir bölme oluşturmak için kutuya ters raf çevirin.
2. Dış dokusu forseps (Şekil 1Aviii) ve diseksiyon makas (Şekil 1Avix) kullanarak göğüs boşluğuna maruz makas ve transect göğüs kafesine göğüs kürk çıkarın. ~ 2 ml Heparin bir transfer pipet kullanarak komple Tyrode en ısındı ile göğüs boşluğunu yıkayın.
   NOT: Gerektiğinde hazırlık kurumasına izin vermeyin, deniz göğüs boşluğunu devam edin.
3. Bir mikroskop altında dikkatle akciğerleri kaldırmak ve iç makas (Şekil 1Avi) ve diseksiyon forseps (Şekil 1Avii) kullanarak timüs.
4. yavaşça iç diseksiyon forseps ile kalbin apeks tutarken dikkatli inferior vena kava ve a kestiİç makas ile orta göğüs boşluğunda kalp kaldırmak için. Silikon diseksiyon yemekleri birine kalbini aktarın ve ~ 4 ml Komple Tyrode transfer pipet kullanarak heparinize ısıtılan ile yıkanmak.
5. Orient kalp posterior damarları görünür ve deneycinin soldaki hayvanın deneycinin sağda sağ atrium ve sol atrium ile yukarı bakacak olduğunu. odaklı sonra, silikon diseksiyon çanak içine apeks ile iğneleyerek kalbi hareketsiz.
6. Ventriküller ve kulakçıklar (ventriküllerin yukarıda açık halka) arasındaki oluk bulun.
7. İç diseksiyon makas kullanarak, kulakçıklar daha ventriküllere yakın tutarak oluk bir kesi yapmak. Ek ısındı heparinize Komple Tyrode olarak kulakçıklar ve vanalar net bir görüş sağlamak için gerekli en oluk ve kesi yıkayın. ventriküllerden gelen atrial ayırmak için oluk boyunca kesmeye devam.
8. İkinci silikon diseksiyon çanak atriyal doku transferi ve ~ 3 ml Komple Tyrode en heparinize ısıtılan ile yıkanmak.
9. Orient hayvanın sağ atrium deneycinin solda şimdi doku böylece, ve sol atrium sağ açık.
   NOT: Sol atriyum koyu kırmızı tonu daha sahipken sağ atrium, daha şeffaftır.
10. yavaşça hazırlık germe, alt ve üst vena kava inferior ve sağ ve sol atriyal uzantıları aracılığıyla doku sabitleyin. hazırlık (sinoatriyal düğüm oldukça hassas ve kolayca zarar görebilir olarak, atriyal duvar oyulmuş için dikkatli olun) net bir görüş sağlamak için kalan yağ veya diğer doku çıkarın.
11. ana toplardamarlar aracılığıyla keserek atriyum ön duvarını açın. İnteratriyal septum görselleştirmek için gerekli işaretçilerine yeniden konumlandırmak.
12. Sol atrium kaldırmak için septumun boyunca kesilir. nazikçe germe, hazırlık yeniden pin.
13. t kaldırsağ kulakçık o ve atriyal apendiks çevreleyen koyu turuncu çizgi olarak görünür kristalarında terminalisin boyunca keserek sinoatriyal düğüm özgür.
14. düğüm doku yeniden pin ve üç eşit büyüklükteki şerit üretmek için (krista terminalisin dik) yanal kesti.

5. Sinoatriyal Düğüm Sindirim

1. Dar ateş cilalı bir pipet (Şekil 1Aiv) kullanılarak, düşük Ca 2.5 mL içeren üç küçük, yuvarlak dipli tüp, ilk olarak sinoatriyal düğüm dokusunun üç şerit aktarma ^{2 +} / Mg2 ⁺ Tyrode 35 ± 1 ° 'de C su banyosu. 5 dakika boyunca inkübe edin.
2. 2.5 ml düşük Ca içeren ikinci küçük, yuvarlak dipli tüp doku transferi şeritleri ²⁺ aynı dar pipet kullanarak / Mg ²⁺ Tyrode en 35 ± 1 ° C su banyosunda. Nazik tüp dönen ya da hafifçe dar pipet ile pipetleme doku şeritleri yıkayın. Do not invertüp t.
3. 2.5 ml düşük Ca içeren üçüncü küçük, yuvarlak dipli tüp doku transferi şeritler ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode en ve adım 5.2'de açıklanan yıkama adımı tekrarlayın.
4. Düşük Ca 2.5 ml su ihtiva eden büyük bir yuvarlak tabanlı tüp içine aktarın şeritleri ^{2 +} / Mg2 ⁺ Tyrode 35 ° C su banyosu içinde enzimler (elastaz artı kolajenaz-proteaz karışımı) ile. Her üç doku şeritleri mevcut olduğundan emin olun. 35 ± 1 ° C'de 10-15 dakika inkübe edilir. tüp hafifçe dönen her 5 dakikada bir karıştırın. tüp ters etmeyin.

6. Sinoatriyal Düğüm miyosit Ayrılma

1. enzim sindirimi takiben yavaşça 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB çözeltisi içeren ilk küçük, yuvarlak dipli tüp, doku şerit aktarma dar yangın parlatılmış pipet kullanın. tüp hafifçe dönen dokuyu yıkayın.
   Not: Doku şeritleri biraz saydam görünür ve inci de bir araya gelme olabilirnoktasıdır. hücreleri kaybetmemek için enzimatik sindirim sonra çok nazikçe anlaştım.
2. 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB ihtiva eden ikinci bir küçük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. yıkamak için hafifçe karıştırılır.
3. 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB ihtiva eden üçüncü bir küçük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. yıkamak için hafifçe karıştırılır.
4. 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB içeren büyük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın.
5. Bakımı, yaklaşık 0.5-1 Hz 5-10 dakika sabit toz haline getirilerek büyük yuvarlak dipli tüp içinde hücreleri ayırmak, büyük yangın cilalı pipet (Şekil 1Aiii ve Şekil 1C) kullanarak batmış ayrışma tüp tutmak için 35 ± 1 ° C su banyosu çözeltiye baloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için.
   Not: tritürasyon süresi ayrışma pipet çapı ve pipetleme kuvvetine bağlı olarak değişir. doku parçaları t kalan böylece Zaman ayarlanabilir olmalıdıro ayrışma sonunda, ince şeffaf ve incecik görünür. Doku herhangi bir renk elde tutarsa, ayrışma eksik olması muhtemeldir. Frekans (0.5-1 Hz) elle tespit edilir.
6. Su banyosu ayrışmış SAMs ihtiva eden yuvarlak tabanlı tüp çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye.

7. Sinoatriyal Düğüm Kalsiyum yeniden adaptasyon (oda sıcaklığında gerçekleştirilir)

Not: SAMs kültürü deneyleri için tahsis edilmiş, aşağıdaki bölümde prosedürü steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır. SAMs akut deneyler için kullanılacak ise, steril bir ortamda aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için gerek yoktur.

1. NaCI / _CaCl2 adaptasyon çözeltisi (Tablo 2) 75 ul ekle. karıştırmak ve 5 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
2. NaCI / _CaCl2 adaptasyon çözeltisi 160 ul ekle. karıştırmak ve 5 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
3. BSA sol 390 ul ekleyinKatkı (Tablo 2). karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
4. BSA çözeltisi, 1.25 ml ilave edilir. karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
5. BSA çözeltisi 4.37 ml ilave edilir. karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
   Not: kalsiyum nihai konsantrasyon 1.8 mM olacaktır.
6. Kalsiyum yeniden adaptasyonu sonra 3 dakika boyunca ~ 2,000 x g'de 10 dakika ~ ya da santrifüjleme ile yerçekimi ile yerleşmeye izin vererek SAMs toplar.
   1. akut izole hücreler için, hafifçe yaklaşık 2 ml'lik bir hacme hücreleri bırakarak çıkarın ve bir cam Pasteur pipet kullanılarak süpernatan, yaklaşık 5 ml atın. yama kelepçe kayıtları için 8 ° 'ye kadar saat oda sıcaklığında bu hücreleri saklayın.
   2. kültürlenmiş hücreler için, steril bir cam Pasteur pipet kullanılarak mümkün süpernatan kadar çıkarın. Önceden ısıtılmış 1 ml içinde süspanse hücre topağı (37 ° C) Kaplama Orta (Tablo 2).

Sinoatriyal Myo 8. Kaplama ve Kültürlenfositler (akut olarak izole edilmiş hücreleri için yap)

1. Pasteur pipeti ile Adım 3,3 lamelleri gelen laminin çözüm çıkarın. Hemen (adım 3), her bir laminin kaplı lamel üzerine 500 ul (~ 50-100 hücre) tohum.
   Not: Kontraktil inhibitörü 2,3-bütandion monoxime (DGM), hücrelerin ⁹ yıpratma neden kasılmasını önlemek için kaplama ve kültür ortamı dahildir.
2. Inkübatör yeni ekilmiş SAMs ihtiva eden 24 oyuklu plaka geri dönün ve% 95 hava /% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de muhafaza. Hücreler kaplama medyada 4-6 saat (Tablo 2) lamelleri uymak için izin verin.
3. Yavaşça steril bir Pasteur pipeti kullanarak Kaplama Orta kaldırın. Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür Orta oyuk başına 500 ul (Tablo 2) ile değiştirin.

Yetişkin Sinoatriyal miyosit Kültürlerin 9. adenoviral İletimi (Akut İzole Hücreler için atla)

1. ce sayısını tahminhemen büyütme için düzeltme, bir mikroskop altında bir görüş alanı hücreleri sayılarak adenovirüs uygulamadan önce lamel başına rf. tüm hücreleri değil, sadece SAMs güvenin.
2. Ortama 199 adenovirüs seyreltilir ve 1-10 ul bu uygulama, hücre başına 100, viral birimlerinin enfeksiyonun nihai çok sayıda (İB) elde etmek için gerekli olan şekilde, viral titresi için seyreltme ayarlayın. doğrudan kaplamalı SAM üzerine damla damla adenoviral solüsyonu ekleyin.
3. virüs içeren ortam gece boyunca (~ 12-14 saat) kuluçkaya bırakılır. Sonra taze kültür ortamı ile değiş tokuş. istenilen protein ifadesi elde edilene kadar, kültür ortamı, her 48 saat değişen inkübatör hücreleri korumak.

Akut İzole veya Kültür SAMs 10. Fonksiyonel Değerlendirme

NOT: Aşağıdaki protokol spontan AP ve ben hem kayıt delikli yama tekniği amfoterisin kullanılarak izole SAMs fonksiyonel değerlendirmelerin bir örnektir _{aynı hücreden f (referans ⁹ bakınız).}

1. Tablo 3'te tarif edildiği gibi bir kayıt çözelti hazırlayın.
2. kayıt gününde taze DMSO içinde 20 mg / ml amfoterisin B bir stok çözelti hazırlayın. Oda sıcaklığında stok tutmak ve ışıktan korumak. 200 ug bir son konsantrasyona kadar, hücre içi çözelti içerisinde bir grup amfoterisin B stokunu / kullanımdan hemen önce ml. Buz üzerinde nihai bir pipet çözeltisi muhafaza etmek ve ışıktan koruyunuz.
   Not: deneyler için amfoterisin içeren pipet çözeltisi, en az 1 dakika boyunca hücre içi çözeltisi ve vorteks içine stok çözeltisinin bir tam kısmı seyreltilmesiyle saat taze hazırlanmalıdır.
3. bir kısım transfer akut SAM hücre süspansiyonu veya 35 ± 1 ° C 'de Tyrode çözeltisini ihtiva eden bir kayıt odasına kültürlenmiş SAMs taşıyan cam lamel bir fragmanını ayrıştırılır. en az 2 dakika önce elektrofizyolojik recordin için Tyrode çözeltisi ile hücrelerin serpmekGS kültür ortamından geri kalan herhangi bir artık BDM kaldırın.
   NOT: Spontan kasılmalar hemen Tyrode çözümü transfer üzerine belirgin olmalıdır. Kayıt için SAMs spontan kasılma aktivitesi, karakteristik morfolojisi (örneğin., Şekil 2), şeritlerin eksikliği HCN4 proteininin ekspresyonu, bir _ön akımın varlığı, membran kapasitans <50 pF ve kendiliğinden APS gibi özelliklerin bir kombinasyonu ile tespit edilebilir bir diyastolik depolarizasyon fazı ve yavaş upstroke içeren dalga ile.
4. 1.5-3.0 M? Dirençleri ile borosilikat cam pipetler kullanılarak, hücre içi çözelti ile ucu doldurmak 10-30 saniye daldırma tarafından amfoterisin yetersizdi. Sonra amfoterisin içeren çözelti ile pipet geri doldurun. Bir GΩ hücre bağlı mühür mümkün olduğunca çabuk alınmalıdır. mühür oluşumu zor ise, uç-dolgu süresini artırın.
   NOT: Erişim direnci sürekli olmalıdırHücre-conta takılı oluşumu takip izlenir ve kayıtları sadece <10 M? istikrarlı bir erişim direncini alındıktan sonra başlanmalıdır.
5. spontan AP kaydetmek için, hiçbir geçerli enjeksiyonu ile hızlı akım kelepçe moduna amplifikatörün.
   Not: ^Daha önce ¹⁰ belirtildiği gibi, ateşleme hızı kararlı hale APS kaydederken 1 nM izoproterenol hücre dışı Tyrode çözeltisi dahildir.

Burada anlatılan protokoller daha önce farklı yama kelepçe çalışmalarının ^5-8 çeşitli için uygundur yetişkin farelerin kendiliğinden aktif SAMs izole etmek istihdam edilmiştir. Buna ek olarak, Protokoller, bir hafta süreyle kültür içinde muhafaza edilebilir izole SAM izin verir. Kültürlenmiş hücreler içine gene aktarılması adenoviral enfeksiyon ⁹ vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bu bölümde sunulan sonuçlar önceki çalışmalarından elde ve akut izole ve kültürlü SAMs özellikleri örnek olarak burada gösterilir.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, kendiliğinden aktif SAMs fazla 6 gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. kültürlenmiş hücreler önemli ortalama uzunluk, genişlik değişim, kesit alanı, veya kültür membran kapasitans, akut bir şekilde izole SAM verilene benzer bir genel morfolojisi muhafazaHücreler akut izole hücreler (- E Şekil 2B) karşılaştırıldı. kültür içinde, zaman içinde uygulanabilir SAM sayısı aşınma Ancak oluştu. Bu nedenle, deney tasarımı geniş gerçekleştirmede gerektiriyorsa kültürleri çok hayvandan alınan hücrelerden hazırlanabilir önerilir.

yetişkin farelerin sinoatriyal miyositlerin kültürü için protokol geliştirilmesinde önemli bir hedef yetişkin SAMs yerli hücresel bağlamında eksojen proteinlerin ifadesini sağlayacak bir sistem oluşturmak oldu. Protein ekspresyonu Bu tür bir örnek, hücreleri durumunda, Şekil 3 'de gösterilmiştir, floresan markör proteinler GFP ve MCherry ifade virüs ile birlikte enfekte edilmiştir. Protein ekspresyonu adenoviral enfeksiyon, 24 saat içinde açıkça belirgin olduğu bulundu, ve 48 saat (Şekil 3) içinde test proteinleri için maksimum olmuştur. 100 viral İçişleri Bakanlığı neredeyse% 100 inf sonuçlandıHücresel toksisite kanıtı ection verim. Bunun aksine, lipid bazlı reaktifler kullanılarak transfeksiyon da 72 saat sonra ^9, yetişkin SAM herhangi tespit gen aktarımı elde edilememişti.

Patch-kelepçe elektrofizyoloji üzerinden fonksiyonel karakterizasyonu hem akut izole ve kültürlü SAMs. Şekil 4A değerlendirilmesi için kritik amfoterisin delikli yama kayıt yapılandırmasını kullanarak akut izole veya kültür SAMs kaydedilen spontan aksiyon potansiyelleri tipik akım kelepçe kayıtları gösterir. Aksiyon potansiyeli dalga akut izole ve kültürlü SAMs benzerdi ve ortalama AP ateş oranı (Şekil 4B) hiçbir fark yoktu.

Ben _f sinoatriyal düğüm immunositokimyasal belirteç olarak kullanılan SAMs ve ben _f üreten HCN4 kanallarının bir özelliğidir. dolayısıyla pryama kelepçe kayıtları I _f esence hücreleri aslında SAMs içinde olduğu fikrini desteklemek için kullanılabilir. Kendiliğinden aktif akut ve kültürlenmiş SAM hepsi burada da, -120 mV'ye 1 sn voltaj aşamasına karşılık olarak bir _F> 100 Pa sergilemişlerdir. Burada gösterilen temsili sonuçlar için, hücreler, -60 ° C ile -160 3 sn hiperpolarize kademeye ile tahlil edilmiştir K ⁺ akımları (Tablo 3) ve _f etkinleşmenin voltaja bağımlılığı engellemek için 1 mM BaCl ₂ içeren Tyrode çözeltisi ile perfüze edilmiştir -50 mV tutma potansiyelinden mV olarak daha önce ^5-8 tarif var. akım yoğunluğu -50 mV bir tutma potansiyelinden -150 mV'ye hiperpolarize 3 sn test darbelerinin yanıt olarak değerlendirildi. _F I aktivasyon voltaj bağımlılığı ya da akut izole ve kültürlü SAMs (Şekil 4 arasında akım yoğunluğu _f I ya anlamlı bir fark saptanmadıC - D). Bireysel SAMs _f Bunlar kendiliğinden AP co-kayıtları ve ben 2 dk ilk yıkama dahil olmak üzere toplam yaklaşık 9 dakika (mevcut kelepçe modunda spontan AP 30-60 saniye, 2 dk çözüm değişikliği gerektirir ve yaklaşık 5 dk için I _f) aktivasyonu voltaj bağımlılığı tanımlamak için yeterli gerilim kelepçe verileri toplar. Dolayısıyla Şekil 4C'de gösterilen veriler, hücre hazırlama sağlamlığını örnekler.

Şekil 1: Fare SAM izolasyonu ve ayrılması için tahlil (A) -L silikon elastomer vulkanize 25 ml ihtiva eden iki adet 10 cm petri tabaklarına konulur... Her yemeğin dokusu hareketsiz tutmak için 6-10 küçük diseksiyon pimleri ile yüklü olarak gelir. Ii. 100 ml'lik beher 35 & Komple Tyrode en tutmak için# 176;... C su banyosu iii Geniş (~ 2 mm çapında), yangın cilalı ayrışma pipet iv Dar (~ 1.5 mm çap) Tam Tyrode en ile birlikte deniz hazırlanması için yangın cilalı transferi pipet v Plastik transferi pipet... iç doku manipülasyonu için heparin. vi. iç kesim işlemleri için mikro makas açılış Kendinden. vii. İnce forseps (uç boyutu 0.06 x 0.02 mm). viii. doku forseps, 5.5, dış doku manipülasyonu için 1 x 2 diş. ix. kavisli iris makas dış kesme işlemleri için 4.3. Diseksiyon çanak yerleştirilen küçük diseksiyon işaretçilerine vurgulayarak (B) Close-up fotoğraf. Yakın çekim fotoğraf mekanik öğütüldükten (sağda). Için yangın cilalı dar transfer pipet (solda) ve yangın cilalı geniş ağızlı bir pipet vurgulayarak (C) tıklayınız daha büyük bir versio görmek içinBu rakamın n.

. Şekil 2: Akut izole ve kültürlü SAMs morfolojik olarak ayırt edilemez A:. Temsilci SAMs Parlak alan görüntüleri ya hemen izolasyon (akut) veya sonra 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat, ya da in vitro 6 gün sonra B - D : Ortalama (± SEM) maksimum uzunluğu, akut 48 saat karşı izole kültür SAMs E genişlik ve kesit alanı:. (± SEM) Ortalama akut izole veya kültür SAMs gerilim-kelepçe kayıtları membran kapasitans. Tüm karşılaştırmalar anlamlı değildir: p> 0.05 vs akut. Referans ⁹ uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. EGFP (yeşil) ve mCherry (kırmızı) eksprese eden adenovirüs için 100 MOl'de enfekte edilmiştir kültürlenmiş SAMs Parlak alan ve Örnek kültürlenmiş SAM bölgesinin epifluorescent görüntüleri eksojen protein adenoviral sentezleme, ya 24 ya da 48 saat sonra çift ​​enfeksiyon. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Referans ⁹ çoğaltılamaz.

Şekil 4: 1 nM izoproterenol içeren Tyrode çözeltisi içinde akut izole (siyah) Örnek akımı kelepçe kayıtları veya kültür (gri) SAM. Kültürlenmiş SAMs A elektrofizyolojik karakterizasyon. Ölçek çubukları: 40 mV, 100 milisaniye B:. Ortalama (± SEM) anlıkakut izole frekansı ateş (siyah, n = 6) veya 48 saat kültüre (gri; n = 14) SAMs C:. I normalize (± SEM) ortalama iletkenlik-voltaj ilişkileri akut izole _f (siyah, n = 8) veya kültür (gri; n = 14) SAMs Insets.:. 10 mV artışlarla -60 ila -160 mV 3 sn hiperpolarizan testi bakliyat tarafından ortaya çıkarılan akut (siyah) ya da kültür (gri) SAMs temsili akım aileleri D: Ortalama ( ± SEM) akut (izole siyah -150 mV ben _f akım yoğunluğu; n = 7) ve (kültürlü gri; n = 8) SAMs. Referans ⁹ uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1:. Disosiyasyon çözümleri sinoatriyal düğüm miyosit ayrışma kullanılan çözümlerin kompozisyonlar. Konsantrasyonları belirtilen yerler dışında mM verilmiştir.

Tablo 2: Kaplama ve kültür çözümleri sinoatriyal düğüm miyosit kaplama ve kültürü için kullanılan çözümlerin kompozisyonlar..

Tablo 3: Elektrofizyoloji kayıt çözümleri dışı kompozisyonları sinoatriyal düğüm miyositlerden amfoterisin delikli yama kayıtları için kullanılan (Tyrode) ve hücre içi (PP) çözümleri..

Bu kağıt yetişkin farelerin tamamen farklılaşmış sinoatriyal düğüm miyosit izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller sunar. yalıtım protokolü güvenilir anında elektrofizyolojik analizi ya da sonraki kültür ya da uygun kendiliğinden aktif fare SAMs üretir. Benzer protokolleri (örneğin, ^{11,12,10,13-17} referanslara bakın) birçok diğer gruplar tarafından rapor edilmiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak yetişkin fare SAMs muhafaza edilmesi için protokol karakteristik morfolojisi, spontan aktivite ve hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri korur ve proteinlerin ⁹ adenoviral sağlamaya imkan verir.

modifikasyon ve protokollerin sorun giderme için, bir kaç kritik adımlar dikkat edilmelidir. İlk kritik bir faktör belirli bir HAZIRLIK izole önemli ölçüde sayısı ve SAM kalitesini değiştirebilir sindirici enzimler (1.4 adım) aktivitesinde önemli bir partiden partiye değişkenlik olantirme. Bu değişkenlik, tipik olarak, hücre sayısı ve sağlık en üst düzeye çıkarmak için çok spesifik optimizasyon, burada konsantrasyonu ve uygulama zamanı (genellikle paralel olarak yapılabilir) birçok preparasyonların boyunca braketi olmalıdır gerektirir elastaz için geçerlidir. Çeşitli türlerden SAM izolasyonu için bazı protokoller yerine, bu protokolde kolajenaz-proteaz enzimi karışımının tek tek kolajenaz ve proteaz enzimlerini kullanmaktadır. Bununla birlikte, bu enzimlerin her biri için çok partiye değişkenlik eş optimizasyonu tekrar tur gerektiren oldukça yüksek (elastaz benzer) 'dir. Enzim harman birçok genelinde daha tutarlılık sağlar ve daha az optimizasyon adımları gerektirir.

SAM izolasyon gidermek için kritik ikinci ve açık olmayan bir faktör yangın cilalı cam ayrışma pipet (Şekil 1C) bütünlüğüdür. pipet jant keskin kenarları, çatlak ya da birikmiş c içeriyorsaellular enkaz, mekanik toz haline getirme adımı kalsiyum toksisite sonuçlanan hücrelerine zarar verebilir. yangın cilalı ayrışma pipet düzenli kullanım 2 ay en az her veya hücre verim ve kalite birkaç hazırlıkları boyunca belirgin azaldığı herhangi bir zamanda değiştirilmesi gerekir.

zamanlama ve mekanik ayrışma kuvvet izolasyon protokolü gidermek için üçüncü bir kritik bir adımdır. tritürasyon yavaş (yaklaşık 0.5-1 Hz) ancak 5-10 dakika güçlü türbülans gerektirir. Daha hızlı oranları ve azaltılmış süreleri de kullanılabilir, ancak baloncuklarının oluşumunu ya da çözelti içinde köpük üreten önlemek için önemlidir. sinoatriyal düğüm örnekleri tamamen ayrışmış edildiğinde, kalan doku şeritleri renkli incecik beyaz görünmelidir; ince pembe-ish boyama eksik öğütme gösterir. 200-400x'te büyütmede bakıldığında, optimum hazırlanan numunelerden hücreler, hücre memb ise yumuşak hücre zarları vardijeste-ya da aşırı toz haline numunelerden ranes bir kraterli ve çizgili bir görünüme sahiptir. Sağlıklı hücrelerde, kasılmalar hücrelerin uçlarının öncelikle olarak ince seğirmesi görülür. kasılma dalgaları balling-up önce, kısa bir süre için şiddetle sözleşme görülebilir hasarlı hücrelerin bir göstergesidir. Bir kırık ayrışma pipet gibi hücre hasarının en yaygın nedenidir. dijeste-veya düşük-tritüre edilmiş örneklerde, hücre kümeleri olarak mevcut olan ya da bunun yerine tek hücre agregatlar ve sözleşme SAM önemli sayıda kalan doku parçaları görülebilir.

Her kullanıcı ayrı ayrı ayrışma optimize etmek gerekir. enzimatik sindirim ve mekanik ayrışma iki kere ayarlanması gerekir rağmen, ayrışma zamanı değiştirirken başlangıçta sabit enzimatik sindirim zaman tutmak için tavsiye edilir. Ek ince ayar a tanımak için kullanıcının yeteneğini esas dayanırtoz haline tamamlanmasından sonra kalan doku parçalarının ppearance - adet tutam ve beyazımsı, o zaman toz haline getirme durdurulmalıdır. Optimizasyon farelerin yaş, cinsiyet, ya da zorlanma farklılıkları eşlik sinoatriyal düğüm varyasyonları karşılamak için de gereklidir. Örneğin, daha yaşlı hayvanlarda ⁷ hücreleri ayrışma enzimatik sindirim ve mekanik ayrılma sürelerine hem de azaltılması gerekmektedir. belki 5-10 başarıyla yama-kenetlenmiş, iyi bir gün oturumunda deneyleri bağlı olabilen genel bir kılavuz, bir 2-3 aylık erkek C57BL / 6 fare verimleri kabaca 50-200 canlı SAMs tipik bir hazırlık olarak . Verim yaşlı farelerin ⁷ kullanıldığında önemli ölçüde (% 30), daha düşüktür.

kültür protokolü başarısı birkaç önemli adımlar dayanır. Yukarıda ele alındığı gibi en önemlisi, birincil hücre kültürünün başarısı, yüksek kaliteli bir ayrışma gerektirir. Bu inci önerilirakut izole hücre hazırlama kültüre hücreleri korumak için çalışmadan önce optimize edilebilir. kültürlenmiş hücreler için ikinci bir kritik faktör, elektrofizyolojik kayıtları için hücrelerin seçiminde yatmaktadır. En iyi sonuçlar için, kayıt için seçilmiş kültürlenmiş SAMs hemen BDM içeren kültür ortamının yıkanması sırasında spontan kontraksiyonları göstermelidir. BDM yıkama-out sırasında spontan kasılma yavaş başlangıçlı sağlıksız hücrelerin bir işaretidir.

SAM kültür sistemi bazı sınırlamalar, fare SAN en önemlisi çok küçük boyutu var. Burada gösterilen yöntemler elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları için yeterli hücre sayıları için izin verirken, doku sınırlı miktarda kültürlü SAMs biyokimyasal analizler engellemektedir. tekniğin bir başka sınırlaması SAMs geri miyozin ATPase inhibitörü BDM mevcudiyetinde kültürlenmiş olmasıdır. BDM dahil olmak üzere diğer hücresel etkileri vardır, çünkü bu potansiyel endişeSpesifik olmayan fosfataz aktivitesi, kardiyak transkripsiyon inhibisyonu ¹⁹ faktörleri ve sodyum kanallarının, kalsiyum kanalları ve riyanodin reseptörleri ²⁰ inhibisyonu. Ancak, veri BDM burada tahlil SAM morfolojik ve elektrofizyolojik özellikleri üzerinde çok az etkisi olduğunu göstermektedir.

Gelecekteki uygulamalarda, burada açıklanan yöntemler, daha büyük memelilerde SAM kültürleri hazırlamak için kolayca adapte edilebilir gibi görünmektedir. adenoviral gen transferi ile birlikte, bu kültürler büyük hayvan modellerinde kalp vurusu genetik manipülasyonlar izin verebilir. ilgi konusu proteinleri tanıtmak yeteneği aynı zamanda genetik olarak kodlanmış raportör moleküller SAM hücre içi sinyal yollarını araştırmak için kullanılabilecek gelecek uygulamalar için içerir.

None.

We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.