طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

وأظهرت أساليب لعزل myocytes العقدة الجيبية الأذينية (صواريخ سام) من فئران بالغة لالمشبك التصحيح الكهربية أو التصوير الدراسات. الخلايا المعزولة يمكن استخدامها مباشرة أو يمكن حافظت في الثقافة للسماح التعبير عن البروتينات المثيرة للاهتمام، مثل صحفيين المشفرة وراثيا.

myocytes العقدة الجيبية الأذينية (صواريخ سام) تكون بمثابة منظم ضربات القلب الطبيعية للقلب، والشروع في قلب كل فوز عن طريق توليد إمكانات العمل عفوية (الجزائرية). وتعكس هذه الصورة المتقدم جهاز تنظيم ضربات القلب والنشاط المنسق العديد من التيارات الغشاء والدراجات الكالسيوم داخل الخلايا. إلا أن الآليات الدقيقة التي تدفع النشاط تنظيم ضربات القلب عفوية في صواريخ سام لا تزال بعيدة المنال. تماما صواريخ سام معزولة هي إعداد ضروري لتجارب لتشريح الأساس الجزيئي للpacemaking القلب. ومع ذلك، فإن التشريح غير واضحة، تسليخ مجهري معقد، وصعب ظروف الهضم الأنزيمية حالت دون انتشار استخدام صواريخ سام معزولة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، كانت الطرق غير متوفرة حتى وقت قريب للسماح الثقافة على المدى الطويل من صواريخ سام للدراسات تعبير البروتين. هنا نقدم خطوة بخطوة بروتوكول والفيديو مظاهرة لعزل صواريخ سام من فئران بالغة. ويتجلى طريقة أيضا للحفاظ على الكبار الماوس صواريخ سام في المختبر وexpressiعلى البروتينات الخارجية عن طريق عدوى الفيروسة الغدانية. معزولة تماما وصواريخ سام مثقف أعدت عن طريق هذه الأساليب هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات الكهربية والتصوير.

myocytes جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية للقلب (myocytes الجيبية الأذينية، "صواريخ سام") تولد عفوية، إمكانات العمل إيقاعي (الجزائرية) التي تنتشر من خلال عضلة القلب للشروع في كل نبضة قلب. وكانت التجارب باستخدام صواريخ سام معزولة تماما من العديد من الأنواع ضروري لتوضيح الآليات التي تساهم في توليد النشاط تنظيم ضربات القلب. صواريخ سام هي العضلية درجة عالية من التخصص التي تختلف كثيرا عن نظرائهم في الأذين والبطين عضلة القلب من حيث التشكل، وظيفة، والتعبير البروتين. السمة المميزة لنقاط وصول عفوية في صواريخ سام هو الاستقطاب عفوية أثناء انبساط الذي يدفع غشاء المحتملة لعتبة لتحريك AP المقبل ^1،2. هذا "إمكانية تنظيم ضربات القلب" تعتمد على النشاط المنسق لكثير من التيارات المختلفة غشاء بما في ذلك "مضحك الحالية" _(و أنا)، تي و L-نوع التيارات الكالسيوم، والصوديوم والكالسيوم المبادلات داءوالأنف والحنجرة (أنا _NCX)، الذي يحركه إطلاق الكالسيوم ²⁺ من شبكية الهيولى العضلية ^3،4.

في حين الماوس معزولة تماما صواريخ سام تشكل إعداد التجريبية أساسيا لدراسة pacemaking، وعزل من صواريخ سام من الفئران يمكن أن تكون وسيلة صعبة اعتماد لتشريح غير واضحة وصغر حجم SAN الماوس يتطلب تسليخ مجهري دقيق والأنزيمية جنبا إلى جنب والميكانيكية تفكك الخلايا يتطلب تحسين دقيق.

ونحن نقدم هنا مظاهرة الفيديو مفصلة من البروتوكول الذي تم استخدامه بنجاح لعزل صواريخ سام من فئران بالغة للتسجيلات المشبك التصحيح ^8/5. على حد علمنا، ليس هناك مثل هذه التظاهرة البصرية المتاحة من أي مصدر آخر. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الطريقة الجديدة التي عزلت صواريخ سام من فئران بالغة لا يمكن الحفاظ عليه في المختبر لعدة أيام، مما يسمح إدخال البروتينات، المشفرة وراثياجزيئات مراسل أو رني عبر عدوى الفيروسة الغدانية ^9.

تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كولورادو آنشوتز الحرم الجامعي الطبية. أدناه وقد تم تحسين بروتوكول قياسي باستخدام الذكور C57BL / 6J الفئران من 2-3 أشهر من العمر.

1. إعداد الأرصدة واللوازم الحل مقدما من التجارب

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى مواد الجدول للمعدات والتجهيزات اللازمة.

1. إعداد 1 لتر كل الحلول التالية كما هو مبين في الجدول رقم 1:، منخفضة الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ²⁺ في تايرود، معدلة كرافت Brühe (KB) الحل، والأبقار مصل الزلال (BSA) الحل الكامل تايرود. استخدام عالى النقاء تصفية الماء منزوع الأيونات لجميع الحلول. تقسيم كل الحل في 50 مل قسامات وتخزينها في 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. ذوبان الجليد قسامات الفردية فورا قبل التجارب، وتخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد في 46؛ C.
2. تجهيز 50 مل من 10 ملي كلوريد الصوديوم و 1.8 ملي CaCl ₂ الحل التكيف عن طريق إذابة كلوريد الصوديوم وCaCl ₂ في عالى النقاء تصفية الماء منزوع الأيونات (الجدول 1). تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ستة أشهر.
3. إعداد 4.75 وحدة نشاط انزيم (U) قسامات الإيلاستاز قبل pipetting في أنابيب microfuge. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
4. إعداد 375 ميكروغرام قسامات (في عالى النقاء H ₂ O) من بين كولاجيناز الأنزيم البروتيني الانزيم مزيج من قبل pipetting في أنابيب microfuge. مخزن في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
5. إعداد اثنين ماصات مصقول النار باستور، واحدة للنقل الأنسجة (~ 1.5 مم افتتاح النهائي؛ الشكل 1Aiv والشكل 1C) واحد للانفصال (~ 2 مم، الشكل 1Aiii والشكل 1C).
   1. النتيجة باستور ماصات مع قطع الزجاج والمفاجئة على طول النتيجة لإنتاج افتتاح أكبر قليلا من الحجم المطلوب. نار-polish نهاية قطع كل ماصة لل~ 30-60 ثانية على نار هادئة على موقد بنسن لإنتاج الحائط المصقول سميكة وافتتاح القطر المطلوب. ضمان فتح النار مصقول خال من أي شقوق أو حواف خشنة.
6. إعداد طبقين تشريح عن طريق إضافة ~ 25 مل سيليكون المطاط الصناعي المختلط وفقا لتوجيهات المصنع إلى كل طبق بيتري 100 مم (الشكل 1Ai والشكل 1B). السماح لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.
7. للثقافة فقط: إعداد 25-50 مل لكل منهما تصفيح المتوسطة والثقافة المتوسطة حسب الجدول 2 مخزن لمدة تصل إلى أسبوعين في 4 درجات مئوية.

2. إعداد حلول لاستخدامها في يوم من عزل الخلايا

ملاحظة: المبالغ التالية لعزل myocytes الجيبية الأذينية من الماوس واحد.

1. إضافة 2.5 مل من انخفاض الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ²⁺ تايرود (درجة الحموضة 6.9) إلى كل من الثلاثة، أنبوب صغير الثقافة القاع المستديرةالصورة. أنابيب مكان في حمام الماء 35 ± 1 درجة مئوية.
2. إضافة 2.5 مل من انخفاض الكالسيوم ²⁺ / إلى القاع مستديرة أنبوب ثقافة واسعة المغنيسيوم ²⁺ تايرود واحد. لهذا الأنبوب، إضافة 1 قسامة (4.75 U) الإيلاستاز وقسامة واحد (375 ميكروغرام)، كولاجيناز الأنزيم البروتيني الانزيم مزيج. دوامة لخلط. أنبوب مكان في 35 ± 1 ° C حمام الماء.
3. إضافة 2.5 مل من KB متوسطة إلى ثلاثة، وأنابيب ثقافة إضافية صغيرة ذهابا والقاع واسع، أنبوب الثقافة القاع مستديرة واحدة إضافية. أنابيب مكان في حمام الماء 35 ± 1 درجة مئوية.
4. إضافة ~ 7 مل من محلول BSA إلى أنبوب الثقافة القاع واحد كبير. الحفاظ على هذا الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
5. وضع 20-40 مل من الحل الكامل تايرود في دورق 50 مل (الشكل 1Aii). إضافة 10 جامعة جنوب المحيط الهادئ / الهيبارين مل، دوامة خلط، ووضع الدورق في حمام درجة مئوية الماء 35 ± 1.

3. إعداد حلول ومواد إضافية للخلايا المزروعة (تخطي هذه الخطوات لخلايا معزولة تماما)

1. في العقيمة هود زراعة الأنسجة، ووضع اثنين 12 مم coverslips الزجاج جولة في الماوس في الآبار الفردية من 24 لوحة جيدا.
   ملاحظة: يتم استخدام لوحة 24 جيدا لأن الآبار هي حجم مناسب، والذي يعمل على الحد من حجم للعدوى الفيروسية لاحقة.
2. ماصة ما يقرب من 200 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل حل من laminin الماوس المخفف في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) على كل ساترة.
3. احتضان coverslips مع laminin لمدة العزلة (على الأقل 1 ساعة) في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
4. قبل الحار تصفيح المتوسطة والثقافة المتوسطة (من الخطوة 1.7 و الجدول 3) إلى 37 درجة مئوية.

عزل 4. الجيبية الأذينية عقدة

1. في غطاء الدخان الكيميائية، ضع الماوس في غرفة واحدة من مربع من مجلسين وتخدير مع ~ 200 ميكرولتر الأيزوفلورين السائل أدخلت عن طريق مسحة القطن في غرفة أخرى. تأكيد التخدير (عادة في غضون ~ 30-60 ثانية) مع قليل أخمص قدميه. الموت ببطءالماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
   ملاحظة: فارغة 1 مل مربع ماصة يمكن استخدامها لتشكيل مربع من مجلسين. تحويل رف رأسا على عقب في مربع لإنشاء حجرة منفصلة للالأيزوفلورين لمنع الماوس من الاتصال بها مباشرة.
2. إزالة الفراء من الصدر مع مقص وضلع القطع قفص لفضح تجويف الصدر باستخدام ملقط الخارجية الأنسجة (الشكل 1Aviii) ومقص تشريح (الشكل 1Avix). يستحم تجويف الصدر مع ~ 2 مل تحسنت كاملة في تايرود مع الهيبارين باستخدام ماصة نقل.
   ملاحظة: مواصلة الاستحمام تجويف الصدر عند الضرورة، لا تسمح للإعداد لتجف.
3. تشريح تحت المجهر، وإزالة بعناية الرئتين والغدة الصعترية باستخدام مقص الداخلية (الشكل 1Avi) وملقط تشريح (الشكل 1Avii).
4. في حين عقد بلطف قمة القلب مع ملقط تشريح الداخلية، وقطع بعناية الوريد الأجوف السفلي ولأورتا مع مقص الداخلية لإزالة القلب من تجويف الصدر. نقل القلب إلى واحد من الأطباق تشريح سيليكون والاستحمام مع ~ 4 مل تحسنت heparinized كامل في تايرود باستخدام ماصة نقل.
5. المشرق قلب مثل أن السفن الخلفي مرئية ومواجهة، مع الأذين الأيمن الحيوان على حق مجرب والأذين الأيسر على اليسار المجرب ل. مرة واحدة المنحى، لشل حركة القلب التي تعلق خلال قمة في طبق سيليكون تشريح.
6. تحديد موقع الأخدود بين البطينين والأذينين (حلقة واضحة فوق البطينين).
7. باستخدام مقص تشريح الداخلية، إجراء شق في الأخدود، وحفظ أقرب إلى البطينين من الأذينين. تدفق الأخدود وشق مع وحسب الحاجة إضافي حرارة تايرود الكامل heparinized للسماح لرؤية واضحة للالأذينين والصمامات. مواصلة قطع على طول الأخدود للفصل بين الأذينين من البطينين.
8. نقل الأنسجة الأذيني إلى ثاني طبق سيليكون تشريح ويستحم مع ~ 3 مل تحسنت heparinized كامل تايرود.
9. الشرق الأنسجة بحيث الأذين الأيمن الحيوان هو الآن على اليسار المجرب، ووالأذين الأيسر هو على حق.
   ملاحظة: إن الأذين الأيمن هو أكثر شفافية، بينما الأذين الأيسر لديه أكثر من لهجة حمراء داكنة.
10. دبوس الأنسجة من خلال الأجوف الأجوف السفلي والعلوي والحق والزوائد الأذين الأيسر، وتمتد إعداد بلطف. إزالة أي نوع من الأنسجة الدهنية أو غيرها المتبقية للسماح لرؤية واضحة للإعداد (نكون حذرين حتى لا يقتطع الجدار الأذيني، كما العقدة الجيبية الأذينية حساسة جدا ويمكن أن تتلف بسهولة).
11. فتح الجدار الأمامي للالأذينين من خلال قطع الأجوف الوريد. إعادة وضع الدبابيس وضرورية لتصور الحاجز بين الأذينين.
12. قطع على طول الحاجز بين الأذينين لإزالة الأذين الأيسر. إعادة يعلقون إعداد، وتمتد بلطف.
13. إزالة رانه الحق الأذيني أطرافهم وتحرير العقدة الجيبية الأذينية عن طريق قطع على طول الانتهائي للأعراف، والذي يظهر على شكل خط برتقالي غامق المطلة على أطرافهم الأذيني.
14. إعادة دبوس النسيج العقدي وقطع عليه أفقيا (عمودي على الانتهائي للعرف) لإنتاج ثلاث شرائح متساوية الحجم.

5. الجيبية الأذينية عقدة الهضم

1. باستخدام الضيقة النار مصقول ماصة (الشكل 1Aiv)، ونقل شرائط ثلاثة من نسيج العقدة الجيبية الأذينية في أول ثلاثة، أنبوب القاع مستديرة صغيرة تحتوي على 2.5 مل من انخفاض الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ²⁺ في تايرود في 35 ± 1 ° حمام ماء C. احتضان لمدة 5 دقائق.
2. شرائح الأنسجة نقل إلى صغير، أنبوب أسفل الجولة الثانية تحتوي على 2.5 مل منخفضة الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ²⁺ في تايرود في درجة حمام مئوية الماء 35 ± 1، وذلك باستخدام نفس ماصة الضيقة. تغسل شرائح الأنسجة التي كتبها طيف يحوم أنبوب أو من قبل pipetting بلطف مع ماصة الضيقة. لا إنفرر الأنبوب.
3. شرائح الأنسجة نقل إلى صغير، أنبوب أسفل الجولة الثالثة تحتوي على 2.5 مل منخفضة الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ²⁺ تايرود، وكرر الخطوة غسل موضح في الخطوة 5.2.
4. شرائط نقل في أنبوب القاع مستديرة كبيرة تحتوي على 2.5 مل من انخفاض الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ²⁺ تايرود مع الأنزيمات (الإيلاستاز بالإضافة إلى مزيج-كولاجيناز الأنزيم البروتيني) في حمام ماء C ° 35. التأكد من أن جميع شرائح الأنسجة الثلاثة موجودة. احتضان لمدة 10-15 دقيقة في 35 ± 1 درجة مئوية. خلط كل 5 دقائق بواسطة يحوم بلطف الأنبوب. لا عكس الأنبوب.

6. الجيبية الأذينية عقدة العضلية التفكك

1. بعد انزيم الهضم، واستخدام ماصة النار مصقول الضيقة لنقل بلطف شرائح الأنسجة لأول أنبوب القاع مستديرة صغيرة تحتوي على 2.5 مل KB حل في 35 ± 1 درجة مئوية. غسل الأنسجة عن طريق يحوم بلطف الأنبوب.
   ملاحظة: سوف شرائح الأنسجة تظهر شفافة إلى حد ما ويمكن أن تتجمع معا في الهو نقطة. التعامل بلطف شديد بعد الهضم الأنزيمي لتجنب فقدان الخلايا.
2. نقل الأنسجة لأنبوب القاع مستديرة صغيرة الثاني تحتوي على 2.5 مل KB في 35 ± 1 درجة مئوية. دوامة بلطف لغسل.
3. نقل الأنسجة لأنبوب القاع مستديرة صغيرة ثالث يحتوي على 2.5 مل KB في 35 ± 1 درجة مئوية. دوامة بلطف لغسل.
4. نقل الأنسجة ل، أنبوب القاع مستديرة كبيرة تحتوي على 2.5 مل KB في 35 ± 1 درجة مئوية.
5. باستخدام ماصة أكبر مصقول النار (الشكل 1Aiii والشكل 1C)، فصل الخلايا في الأنبوب القاع المستديرة واسع من قبل سحن ثابتا عند حوالي 0.5-1 هرتز لمدة 5-10 دقيقة، مع الحرص على الحفاظ على أنبوب تفارق غارقة في 35 ± 1 ° C حمام الماء، وتجنب إدخال فقاعات في الحل.
   ملاحظة: سحن الوقت يختلف مع قطر ماصة التفكك وقوة pipetting ل. ينبغي تعديل الوقت بحيث قطع الأنسجة المتبقية في تيانه نهاية التفكك تظهر رقيقة وشفافة وناعم. إذا تحتفظ الأنسجة أي لون، ومن المرجح أن تكون ناقصة التفكك. يتم تحديد التردد (0.5-1 هرتز) باليد.
6. إزالة أنبوب القاع المستديرة التي تحتوي على فصل صواريخ سام من الحمام المائي وتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.

7. الجيبية الأذينية عقدة الكالسيوم إعادة التكيف (أجريت في درجة حرارة الغرفة)

ملاحظة: للحصول على صواريخ سام متجهة للتجارب زراعة، يجب أن يتم تنفيذ الإجراءات المذكورة في المقطع التالي في نسيج الثقافة هود العقيمة. إذا صواريخ سام هي لاستخدامها في التجارب الحادة، ليست هناك حاجة لتنفيذ هذه الخطوات في بيئة معقمة.

1. إضافة 75 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم / CaCl حل التكيف ₂ (الجدول 2). دوامة بلطف لمزج واحتضان لمدة 5 دقائق.
2. إضافة 160 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم / CaCl حل ₂ التكيف. دوامة بلطف لمزج واحتضان لمدة 5 دقائق.
3. إضافة 390 ميكرولتر من سول BSAution (الجدول 2). دوامة بلطف لمزج واحتضان لمدة 4 دقائق.
4. إضافة 1.25 مل من محلول BSA. دوامة بلطف لمزج واحتضان لمدة 4 دقائق.
5. إضافة 4.37 مل من محلول BSA. دوامة بلطف لمزج واحتضان لمدة 4 دقائق.
   ملاحظة: إن تركيز النهائي من الكالسيوم يكون 1.8 مم.
6. بعد الكالسيوم إعادة التكيف، وجمع صواريخ سام عن طريق السماح لتسوية عن طريق الجاذبية الخاصة ب ~ 10 دقيقة أو عن طريق الطرد المركزي في ~ 2000 x ج لمدة 3 دقائق.
   1. لخلايا معزولة تماما، وإزالة بلطف وتجاهل حوالي 5 مل من طاف باستخدام ماصة باستير الزجاج، وترك الخلايا في حجم ~ 2 مل. تخزين هذه الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ~ 8 ساعات للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح.
   2. لالخلايا المستزرعة، وإزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن باستخدام معقم ماصة باستير الزجاج. Resuspend بيليه خلية في 1 مل قبل تحسنت (37 ° C) الطلاء المتوسطة (الجدول 2).

8. والطلاء وثقافة الجيبية الأذينية ميوcytes (التخطي للخلايا معزولة تماما)

1. إزالة حل laminin من coverslips من الخطوة 3.3 مع ماصة باستور. البذور على الفور 500 ميكرولتر (~ 50-100 الخلايا) على كل ساترة المغلفة laminin (من الخطوة 3).
   ملاحظة: مقلص المانع 2،3 butanedione monoxime (بي دي إم) يتم تضمين في وسائل الإعلام والطلاء والثقافة لمنع الانكماش، والذي يسبب استنزاف الخلايا ^9.
2. عودة لوحة 24 أيضا تحتوي على صواريخ سام المصنف حديثا إلى الحاضنة والحفاظ على 37 درجة مئوية في جو من 95٪ الهواء / 5٪ CO _2. يسمح للخلايا التمسك coverslips لمدة 4-6 ساعة في وسائل الإعلام الطلاء (الجدول 2).
3. إزالة بلطف تصفيح المتوسطة باستخدام ماصة باستير العقيمة. استبدال 500 ميكرولتر لكل بئر من قبل تحسنت (37 ° C) الثقافة المتوسطة (الجدول 2).

9. تنبيغ الفيروسة الغدانية الثقافات العضلية الجيبية الأذينية الكبار (التخطي للخلايا معزولة تماما)

1. تقدير عدد مLLS في ساترة على الفور قبل تطبيق اتش عن طريق عد الخلايا في مجال الرؤية تحت المجهر، وتعديل للتضخم. عدد جميع الخلايا، وليس مجرد صواريخ سام.
2. تمييع اتش في متوسط ​​199 و ضبط تخفيف لعيار الفيروسية ذلك مطلوب أن تطبيق 1-10 ميكرولتر لتحقيق تعدد النهائي من العدوى (وزارة الداخلية) 100 وحدة الفيروسية لكل خلية. إضافة حل الفيروسة الغدانية بطريقة قطرة قطرة مباشرة على صواريخ سام مطلي.
3. احتضان الخلايا مع ليلة وضحاها المتوسطة التي تحتوي على فيروس (~ 12-14 ساعة). ثم تبادل مع مستنبت الطازجة. الحفاظ على الخلايا في الحاضنة، وتغيير ثقافة المتوسط ​​كل 48 ساعة، حتى يتم الحصول على التعبير البروتين المطلوب.

10. تقييم الوظيفي للتماما معزولة أو مثقف صواريخ سام

ملاحظة: بروتوكول التالي مثال المقررة الوظيفية للصواريخ سام معزول باستخدام تقنية أمفوتيريسين مثقبة التصحيح لتسجيل كل نقاط وصول عفوية وأنا _{و من نفس الخلية (انظر المرجع ^9).}

1. إعداد حلول تسجيل كما هو موضح في الجدول رقم 3.
2. إعداد محلول المخزون من 20 ملغ / مل الأمفوتريسين-B في DMSO جديدة في يوم تسجيل. الحفاظ على المخزون في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء. تمييع الأسهم أمفوتيريسين-B في محلول داخل الخلايا إلى تركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل فقط قبل الاستخدام. الحفاظ على حل ماصة النهائي على الجليد وحماية من ضوء.
   ملاحظة: الحل ماصة التي تحتوي على أمفوتيريسين للتجارب ينبغي إعداد جديدة كل ساعة عن طريق تمييع قسامة من الحل الأسهم إلى حل داخل الخلايا وvortexing لمدة 1 دقيقة على الأقل.
3. نقل قسامة من فصلها تماما SAM تعليق خلية أو جزء من ساترة الزجاج تحمل مثقف صواريخ سام إلى غرفة تسجيل تحتوي على حل تايرود في 35 ± 1 درجة مئوية. يروي الخلايا مع حل تايرود لمدة 2 دقيقة على الأقل قبل recordin الكهربيةع لإزالة أي بي دي إم المتبقية المتبقية من مستنبت.
   ملاحظة: يجب تقلصات عفوية يكون واضحا على الفور عقب نقله إلى الحل تايرود. صواريخ سام لتسجيل يمكن تحديدها من خلال مجموعة من المزايا بما في ذلك النشاط مقلص عفوية، مورفولوجيا مميزة (على سبيل المثال، الشكل 2)، عدم وجود التصدعات والتعبير عن بروتين HCN4، ووجود أنا _و الحالية، غشاء السعة <50 الجبهة الوطنية، وعفوية الجزائرية مع الطول الموجي والتي تشمل مرحلة الاستقطاب الانبساطي وupstroke بطيئة.
4. استخدام ماصات البورسليكات الزجاج مع المقاومة من 1،5-3،0 MΩ، وملء طرف مع حل داخل الخلايا تفتقر أمفوتيريسين عن طريق غمس لمدة 10-30 ثانية. ثم ظهر ملء ماصة مع الحل التي تحتوي على أمفوتيريسين. وينبغي الحصول على الخلية المرفقة ختم GΩ في أسرع وقت ممكن. إذا تشكيل ختم صعب، وزيادة وقت بلاغ التعبئة.
   ملاحظة: يجب أن تكون المقاومة وصول مستمررصدت بعد تشكيل ختم الخلية المرفقة، ويجب أن تبدأ التسجيلات إلا بعد الحصول على المقاومة وصول مستقرة من <10 MΩ.
5. لتسجيل نقاط وصول عفوية، والتحول مكبر للصوت لوضع المشبك الحالي سريع مع أي حقن الحالي.
   يتم تضمين 1 نانومتر ايزوبروتيرينول في الحل تايرود خارج الخلية عند تسجيل نقاط وصول لتحقيق الاستقرار في معدل إطلاق النار، كما ذكرت سابقا ^10: ملاحظة.

البروتوكولات وصفها هنا استخدمت سابقا لعزل نشط بشكل عفوي صواريخ سام من الفئران الكبار التي هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات المشبك التصحيح مختلف ^5-8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البروتوكولات تسمح للصواريخ سام المعزولة التي لا يمكن الحفاظ عليه في الثقافة لمدة تصل إلى واحد. نقل الجينات إلى الخلايا المستزرعة ويمكن تحقيق ذلك عن طريق عدوى الفيروسة الغدانية ^9. النتائج المعروضة في هذا القسم مستمدة من عملنا السابق، وهي واردة هنا كأمثلة على خصائص صواريخ سام معزولة تماما ومثقف.

كما هو مبين في الشكل 2، ونشط بشكل عفوي صواريخ سام لا يمكن الحفاظ عليه في الثقافة لمدة تصل إلى 6 أيام. والخلايا المستزرعة احتفاظ التشكل العام مشابه جدا لتلك التي صواريخ سام معزولة تماما، مع عدم وجود تغييرات كبيرة في طول متوسط، عرض، مساحة المقطع العرضي، أو غشاء السعة من مثقفخلايا مقارنة مع خلايا معزولة تماما (الشكل 2B - E). كان هناك لكن الاستنزاف عدد من صواريخ سام قابلة للحياة على مر الزمن في الثقافة. وبالتالي، فمن المستحسن أن يكون مستعدا الثقافات من الخلايا المجمعة من الحيوانات متعددة إذا كان التصميم التجريبي يتطلب مجموعات البيانات واسعة النطاق.

وكان الهدف الرئيسي في تطوير بروتوكول للثقافة myocytes الجيبية الأذينية من فئران بالغة لخلق نظام من شأنه أن يسمح للتعبير عن البروتينات الخارجية في سياق الخلوي الأصلي الكبار صواريخ سام. ويرد مثال لهذا النوع من التعبير البروتين في الشكل (3) لحالة الخلايا شارك المصابة بفيروسات معربا عن البروتينات علامة فلوري GFP وmCherry. وجدنا أن البروتين التعبير كان جليا خلال 24 ساعة من العدوى الفيروسة الغدانية، وكان الحد الأقصى للبروتينات اختبار خلال 48 ساعة (الشكل 3). أدت زارة الداخلية الفيروسية من 100 في ما يقرب من 100٪ من الوقود النووي المشعكفاءة ection مع أي دليل على السمية الخلوية. في المقابل، ترنسفكأيشن باستخدام الكواشف استنادا للدهون، فشلت في إنتاج في أي نقل الجينات يمكن كشفها إلى الكبار صواريخ سام، حتى بعد 72 ساعة ^9.

توصيف وظيفي عبر الكهربية التصحيح، المشبك هو أمر حاسم لتقييم كلا معزولة تماما ومثقف صواريخ سام. 4A الشكل يظهر تسجيلات المشبك الحالي نموذجية من إمكانات العمل عفوية المسجلة من صواريخ سام تماما معزولة أو مثقف باستخدام أمفوتيريسين مثقبة التصحيح التكوين تسجيل. وكانت إجراءات الطول الموجي المحتملة مماثلة في صواريخ سام معزولة تماما ومثقف، وكان هناك لا فرق في متوسط AP معدل اطلاق النار (الشكل 4B).

أنا _و هو السمة المميزة للصواريخ سام والقنوات HCN4 التي تنتج أنا _و تستخدم كعلامات immunocytochemical من العقدة الجيبية الأذينية. وبالتالي العلاقات العامةesence من أنا _و في التسجيلات المشبك التصحيح يمكن استخدامها لدعم فكرة أن الخلايا هي في الواقع صواريخ سام. كل من صواريخ سام الحادة ومثقف نشطة بشكل عفوي وصفها هنا أيضا عرضت أنا _و> 100 السلطة الفلسطينية ردا على خطوة الجهد 1 ثانية ل-120 بالسيارات. للحصول على نتائج تمثيلية هو موضح هنا، تم perfused الخلايا مع حل تايرود تحتوي على 1 ملم بووتون ₂ لمنع K ⁺ التيارات (الجدول 3) والاعتماد الجهد تفعيل أنا _و كان يعاير بنسبة 3 ثانية الخطوات hyperpolarizing الجهد من -60 إلى -160 بالسيارات من المحتمل عقد -50 بالسيارات، كما وصفناها سابقا ^5-8. تم تقييم كثافة التيار في الاستجابة إلى 3 ثانية البقول اختبار hyperpolarizing ل-150 بالسيارات من المحتمل عقد -50 بالسيارات. لم تكن هناك اختلافات كبيرة سواء في الجهد الاعتماد تفعيل أنا _F أو أنا _و الكثافة الحالية بين بحدة معزولة ومثقف صواريخ سام (الشكل 4C - D). وتتطلب هذه المشارك التسجيلات من نقاط وصول عفوية وأنا _و من صواريخ سام الفردية حوالي 9 دقائق في المجموع (بما في ذلك غسل الأولي 2 دقيقة، 30-60 ثانية من نقاط وصول عفوية في وضع المشبك الحالي، وتغيير الحل 2 دقيقة، وحوالي 5 دقائق ل جمع بيانات كافية المشبك الجهد لوصف الجهد الاعتماد تفعيل أنا _و). ومن هنا توضح البيانات الواردة في الشكل 4C أيضا متانة إعداد الخلية.

الشكل 1: أدوات تشريح للعزلة وتفكك الماوس صواريخ سام (A) ط الثانية 10 سم أطباق بتري تحتوي على ~ 25 مل علاجه سيليكون المطاط الصناعي.. تم تحميلها مسبقا كل طبق مع 6-10 دبابيس تشريح صغيرة لشل حركة الأنسجة. ب. 100 كوب مل لعقد كامل من تايرود في 35 و# 176؛... C حمام الماء الثالث على نطاق واسع (~ مم 2)، النار مصقول التفكك ماصة الرابع حصر (~ 1.5 مم) مصقول النار ماصة نقل ضد ماصة نقل البلاستيكية لإعداد الاستحمام مع كامل في تايرود مع... المقص الصغير لإجراءات القطع الداخلية ملقط الأنسجة، 5.5 في، 1 × 2 الأسنان لمعالجة الأنسجة الخارجية الهيبارين السادس. فتح الذاتي السابع. ملقط غرامة (حجم غيض 0.06 س 0.02 ملم) للتلاعب الأنسجة الداخلية. الثامن. التاسع. مقص القزحية المنحنية 4.3 في إجراءات القطع الخارجية. (ب) عن قرب صورة إبراز دبابيس تشريح صغيرة توضع في طبق تشريح. (C) الصورة عن قرب إبراز مصقول النار نقل ضيق ماصة (يسار) والنار مصقول ماصة واسعة الفم لسحن الميكانيكية (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصدارات ن من هذا الرقم.

. الشكل 2: عزل تماما وصواريخ سام مثقف لا يمكن تمييزها شكليا ج: صور مشرق الميدان من صواريخ سام التمثيلي إما مباشرة بعد العزلة (الحادة) أو بعد 24 ساعة، 48 ساعة، 72 ساعة، 96 ساعة، أو 6 أيام في المختبر B - D : متوسط (± SEM) الحد الأقصى لطول ومساحة العرض ومستعرضة لعزل تماما مقابل 48 ساعة مثقف صواريخ سام E: متوسط (± SEM) غشاء السعة من تسجيلات الجهد المشبك من صواريخ سام تماما معزولة أو مثقف. جميع المقارنات ليست كبيرة: P> 0.05 مقابل الحادة. مقتبس من الإشارة ^9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل (3): التعبير الفيروسة الغدانية من البروتينات الخارجية في مثقف صواريخ سام الحقل مشرق وصور epifluorescent من ممثل صواريخ سام مثقف التي أصيبت في وزارة الداخلية من 100 لالغدية معربا عن EGFP (الخضراء) وmCherry (أحمر)، إما في 24 أو 48 ساعة بعد. إصابة مزدوجة. شريط النطاق = 20 ميكرون. مستنسخة من مرجع ^9.

الشكل 4: توصيف الكهربية من مثقف صواريخ سام ج: الممثل التسجيلات المشبك الحالية من معزولة تماما (أسود) أو مثقف (الرمادي) صواريخ سام في حل تايرود تحتوي على 1 نانومتر ايزوبروتيرينول. أشرطة النطاق: 40 فولت، 100 ميللي ثانية ب: متوسط (± SEM) لحظيةاطلاق تردد في معزولة تماما (أسود، ن = 6) أو 48 ساعة مثقف (الرمادي، ن = 14) صواريخ سام C: متوسط تطبيع (± SEM) العلاقات تصرف الجهد لأني _و في معزولة تماما (أسود، ن = 8) أو مثقف (رمادي، ن = 14) صواريخ سام إدراجات:. أسرهم التمثيلية الحالية من حاد (أسود) أو مستنبت صواريخ سام (الرمادي) التي تسببها 3 ثانية البقول اختبار hyperpolarizing من -60 إلى -160 بالسيارات في 10 الزيادات بالسيارات D: متوسط ( ± SEM) أنا _و كثافة التيار في -150 بالسيارات في معزولة تماما (أسود، ن = 7) ومثقف (الرمادي، ن = 8) صواريخ سام. مقتبس من الإشارة ^9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الجدول 1: حلول التفكك التراكيب الحلول المستخدمة في تفكك myocytes العقدة الجيبية الأذينية. يتم إعطاء تركيز في ملي إلا إذا لاحظت.

الجدول 2: الطلاء والثقافة حلول التراكيب الحلول المستخدمة في الطلاء وثقافة myocytes العقدة الجيبية الأذينية.

الجدول 3: تسجيل الحلول الكهربية التراكيب من خارج الخلية (تايرود) وبين الخلايا (PP) الحلول المستخدمة لأمفوتيريسين التسجيلات مثقبة التصحيح من myocytes العقدة الجيبية الأذينية.

تقدم هذه الورقة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية للعزلة وثقافة متباينة تماما myocytes العقدة الجيبية الأذينية من فئران بالغة. بروتوكول العزلة تنتج موثوق صواريخ سام الماوس نشطة بشكل عفوي مناسبة لأي تحليل الكهربية فوري أو ثقافة اللاحقة. وقد تم الإبلاغ عن بروتوكولات مماثلة من قبل العديد من المجموعات الأخرى (على سبيل المثال، انظر المراجع ^{11،12،10،13-17).} ومع ذلك، لدينا بروتوكول للحفاظ على الماوس الكبار صواريخ سام في المختبر يحافظ على التشكل مميزة، النشاط العفوي، والخصائص الكهربية للخلايا ويسمح للتسليم الفيروسة الغدانية من البروتينات ^9.

لتعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من البروتوكولات، وتجدر الإشارة إلى بضع خطوات حاسمة. العامل الحاسم الأول هو كبير تقلب الكثير إلى الكثير في نشاط الأنزيمات هضم (الخطوة 1.4)، والذي يمكن أن يغير بشكل كبير من عدد ونوعية صواريخ سام معزولة في prepar معينأوجه. هذا التباين هو صحيح بشكل خاص لالإيلاستاز، الأمر الذي يتطلب عادة الكثير محددة الأمثل، والتي ينبغي أن وضع بين أقواس التركيز والتعرض مرات على مدى عدة الاستعدادات (في كثير من الأحيان يتم بالتوازي) لزيادة عدد الخلايا والصحة. بعض البروتوكولات لعزل صواريخ سام من مختلف الأنواع تستخدم كولاجيناز والبروتيني الانزيمات الفردية بدلا من مزيج الانزيم البروتيني كولاجيناز في هذا البروتوكول. ومع ذلك، فإن تقلب الكثير إلى الكثير لكل من هذه الانزيمات مرتفعة إلى حد ما (مماثلة لتلك التي الإيلاستاز)، مما استلزم الجولات المتكررة من التعاون الأمثل. يوفر مزيج انزيم مزيد من الاتساق عبر الكثير ويتطلب أقل الخطوات الأمثل.

والثاني حاسمة، وغير واضح، وعامل لاستكشاف العزلة SAM هو سلامة مصقول النار الزجاج التفكك ماصة (الشكل 1C). إذا حافة ماصة تحتوي على أي حواف حادة، والشقوق أو ج المتراكمةالحطام ellular، يمكن أن الخطوة سحن الميكانيكية تلف الخلايا، مما يؤدي إلى سمية الكالسيوم. يجب أن يتم استبدال التفكك ماصة النار مصقول على الأقل كل 2 أشهر من الاستخدام المنتظم، أو في أي وقت أن العائد خلية أو نوعية ينخفض ​​بشكل ملحوظ على مدى عدة الاستعدادات.

توقيت وقوة التفكك الميكانيكي هو خطوة حاسمة الثالثة لاستكشاف بروتوكول العزلة. سحن يتطلب بطيئة (حوالي 0،5-1 هرتز)، ولكن الاضطراب قوية لمدة 5-10 دقائق. ويمكن أيضا أن معدلات بشكل أسرع وتقليل مرات استخدامها، ولكن من المهم تجنب إدخال فقاعات أو توليد زبد في الحل. عندما العينات العقدة الجيبية الأذينية تم فصلها تماما، يجب أن تظهر شرائط الأنسجة المتبقية ناعم وأبيض اللون. خفية الوردي العش التلوين يشير سحن غير مكتملة. عندما بحثت في 200-400X التكبير، الخلايا من عينات أعدت على النحو الأمثل لها أغشية الخلايا على نحو سلس، في حين memb خليةranes من الإفراط في هضم أو المسحوقة على عينات لها مظهر الفوهات ومخططة. في الخلايا السليمة، ويلاحظ تقلصات الوخز في المقام الأول وخفية من نهايات الخلايا. موجات من التقلص هي علامة من الخلايا التالفة، والتي يمكن ملاحظتها على التعاقد بقوة لفترة قصيرة، قبل التكور المتابعة. ماصة التفكك متصدع هي السبب الأكثر شيوعا لتلف الخلايا من هذا القبيل. في العينات التي كانت تحت هضمها أو تحت المسحوقة، وخلايا موجودة كما كتل أو مجاميع بدلا من الخلايا واحدة، وأعداد كبيرة من صواريخ سام متعاقد يمكن ملاحظة في قطع الأنسجة المتبقية.

سوف يحتاج كل مستخدم لتحسين فردي التفكك. على الرغم من أن ينبغي تعديل الهضم الأنزيمي والأوقات التفكك الميكانيكية على حد سواء، فمن المستحسن أن تبقي في البداية الوقت الأنزيمية الهضم ثابت حين تعديل الوقت التفكك. ضبط إضافي يعتمد أساسا على قدرة المستخدم على التعرف على لppearance من القطع الأنسجة المتبقية عند الانتهاء من سحن - عندما القطع ناعم وبيضاء اللون، ثم سحن يجب أن تتوقف. الأمثل هو ضروري أيضا لاستيعاب الاختلافات في العقدة الجيبية الأذينية التي تصاحب الاختلافات في العمر والجنس، أو سلالة من الفئران. على سبيل المثال، تفكك الخلايا من الحيوانات القديمة ⁷ يتطلب انخفاض كل من الهضم الأنزيمي والأوقات التفكك الميكانيكية. كمبدأ عام، وإعداد نموذجي من الذكور 2-3 الشهر القديمة عوائد C57BL / 6 الماوس تقريبا 50-200 قابلة للحياة صواريخ سام، والتي ربما 5-10 يمكن أن يكون بنجاح في جلسة يوم جيد، واعتمادا على تجارب فرضت التصحيح . العائد هو إلى حد كبير (~ 30٪) أقل عند استخدام الفئران الأكبر سنا ^(7).

نجاح بروتوكول الثقافة يعتمد أيضا على عدد قليل من الخطوات الرئيسية. قبل كل شيء، ونجاح زراعة الخلايا الأولية يتطلب التفكك ذات جودة عالية، كما نوقش أعلاه. فمن المستحسن عشرفي إعداد خلية معزولة تماما أن يكون الأمثل قبل محاولة للحفاظ على الخلايا في الثقافة. العامل الحاسم الثاني للخلايا المستزرعة يكمن في اختيار الخلايا للتسجيلات الكهربية. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن صواريخ سام مثقف المختارة للتسجيلات تظهر تقلصات عفوية فور تبييض مستنبت التي تحتوي على BDM. وبداية بطيئة من تقلصات عفوية على غسل التدريجي من BDM هو علامة من الخلايا غير صحية.

لديه نظام الثقافة SAM بعض القيود، وأبرزها حجم صغير جدا من الماوس SAN. في حين أن أساليب مثبتة هنا تسمح لأعداد الخلايا كافية للدراسات الكهربية والتصوير، وكمية محدودة من الأنسجة يحول دون التحليلات الكيميائية الحيوية للمثقف صواريخ سام. الحد آخر من التقنية هو أن صواريخ سام يجب أن يكون المثقف في وجود عكسها المانع الميوسين أتباز، BDM. هذا هو مصدر قلق محتمل لبي دي إم له آثار الخلوية الأخرى، بما في ذلكغير محددة النشاط الفوسفاتيز، وتثبيط من النسخ القلب عوامل ^19، وتثبيط قنوات الصوديوم، قنوات الكالسيوم وryanodine المستقبلات ^20. ومع ذلك، تشير البيانات إلى أن بي دي إم لديها الحد الأدنى من الآثار على الخصائص المورفولوجية والكهربية من صواريخ سام يعاير هنا.

في التطبيقات المستقبلية، يبدو من المرجح أن الأساليب المذكورة هنا يمكن تكييفها لإعداد الثقافات SAM من الثدييات الكبيرة. في تركيبة مع نقل الجينات الفيروسة الغدانية، يمكن لهذه الثقافات تسمح التلاعب الجيني من pacemaking في نماذج حيوانية كبيرة. يوفر القدرة على إدخال البروتينات من الفائدة أيضا للتطبيقات المستقبلية التي جزيئات مراسل المشفرة وراثيا يمكن استخدامها لتحقيق مسارات الإشارات بين الخلايا في صواريخ سام.

None.

We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.