שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

מיוציטים צומת Sinoatrial (Sams) לשמש כמנהל הקוצבים הטבעיים של הלב, לביצוע כל לב הכה על ידי יצירת פוטנציאל פעולה ספונטני (APS). נקודות גישה הקוצבות אלה משקפים את הפעילות המתואמת של זרמי קרום רבים ורכיבה על אופני סידן תוך תאים. עם זאת המנגנון המדויק אשר מוביל פעילות קוצב ספונטנית סאמס להישאר חמקמק. סאמס מבודדים בחריפות מהווים הכנה הכרחית ניסויים כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של pacemaking הלב. עם זאת, לא בוררת את האנטומיה, microdissection המורכב, ותנאי עיכול אנזימטי בררנים מנעו שימוש נרחב של סאמס בחריפות המבודדת. בנוסף, שיטות לא היו זמינות עד לאחרונה להתיר תרבות לטווח הארוך של סאמס ללימודי ביטוי חלבון. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול ווידאו הפגנה למען בידודה של סאמס מעכברים בוגרים. שיטה מודגמת גם לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה עבור expressiעל חלבונים אקסוגניים באמצעות זיהום adenoviral. בחריפות מבודדים סאמס תרבותי מוכן באמצעות שיטות אלה מתאימים מגוון רחב של מחקרים אלקטרו הדמיה.

מיוציטים קוצבים צומת sinoatrial של הלב (myocytes sinoatrial, "סאמס") ליצור פוטנציאל פעולה ספונטני, אומנותי (APS) כי להפיץ דרך שריר הלב ליזום כל לב. ניסויים באמצעות סאמס מבודד בחריפויות ממינים רבים היו חיוניים לגיבוש מבהיר המנגנונים לתרום לדור של פעילות קוצבת. סאמס הוא מאוד cardiomyocytes מיוחד שונה באופן מהותי מן עמיתיהם שריר לב הפרוזדורים חדרית מבחינת מורפולוגיה, פונקציה, ביטוי חלבון. המאפיין העיקרי של נקודות גישה ספונטנית סאמס היא שלילת קוטביות ספונטנית במהלך דיאסטולה שמניע את פוטנציאל הממברנה אל סף כדי לעורר את הבא AP ^1,2. זה "פוטנציאל קוצב לב" תלוי בפעילות המתואמת של זרמי קרום שונים כולל "הנוכחי המצחיק" (אני _F), T-וזרמי סידן L-סוג, ואת curr מחליף נתרן-סידןאף אוזן גרון (אני _NCX), אשר מונע על ידי שחרור ^{2 +} Ca מן הרטיקולום sarcoplasmic ^3,4.

בעוד סאמס העכבר מבודדים בחריפות מהווים הכנה ניסיוני חיוני לחקר pacemaking, בידודה של סאמס מעכברים יכולה להיות שיטה מאתגר לאמץ בגלל האנטומיה ברור וגודל קטן של SAN העכבר דורש microdissection ניואנסים ואת האנזימטית בשילוב מכני דיסוציאציה של תאים דורש אופטימיזציה זהיר.

אנו מספקים כאן הפגנת וידאו מפורטת של פרוטוקול נוצל בהצלחה לבודדת סאמס מעכברים בוגרים עבור צמד תיקון הקלטות ^5-8. למיטב ידיעתנו, אין הפגנה ויזואלית כגון זמינה מכל מקור אחר. בנוסף, שיטה חדשה מודגמת שבודד סאמס מעכברים בוגרים יכול להישמר במבחנה במשך מספר ימים, ובכך לאפשר הכניסה של חלבונים, מקודד גנטימולקולות כתב או RNAi באמצעות זיהום adenoviral ^9.

הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קמפוס רפואי קולורדו אנשוץ. הפרוטוקול הסטנדרטי להלן עבר אופטימיזציה באמצעות זכר C57BL / 6J של 2-3 חודשים של גיל.

1. הכין מניות ואספקת פתרון מראש של ניסויים

הערה: עיין ב חומרי שולחן ציוד ואספקת צורך.

1. הכן 1 ליטר כל אחד מהפתרונות הבאים כמצוין בטבלה 1: של Tyrode השלם, נמוך Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ Tyrode של, השתנה קראפט-Brühe (KB) פתרון, ואת שור סרום אלבומין (BSA) פתרון. ultrapure השתמש מסוננים מים ללא יונים עבור כל פתרונות. מחלקים כל פתרון לתוך aliquots ולאחסן 50 מ"ל ב 20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. להפשיר aliquots הפרט מיד לפני ניסויים, ולאחסן עד שבוע ב 46; C.
2. הכן 50 מ"ל של 10 מ"מ NaCl ו -1.8 מ"מ CaCl ₂ פתרון הסתגלות ידי המסת NaCl ו CaCl ₂ במים deionized מסונן ultrapure (טבלה 1). אחסן בטמפרטורת החדר למשך עד שישה חודשים.
3. הכן 4.75 יחידת פעילות האנזים (U) aliquots של אלסטט ידי pipetting לתוך צינורות microfuge. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
4. הכן 375 מיקרוגרם aliquots (ב ultrapure H ₂ O) של תערובת אנזים collagenase-פרוטאז ידי pipetting לתוך צינורות microfuge. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
5. הכינו שתי טפטפות פסטר אש מלוטש, אחד עבור העברת רקמות (~ 1.5 מ"מ קוטר הפתח הסופי; איור 1Aiv ואיור 1C) ואחד עבור דיסוציאציה (~ 2 מ"מ קוטר; איור 1Aiii ואיור 1C).
   1. טפטפות ציון פסטר עם חתכי זכוכית ולהצמיד יחד את התוצאה ל לייצר פתח מעט גדול יותר בגודל הרצוי. אֵשׁ-פולנית לסוף חתך של כל פיפטה עבור ~ 30-60 שניות על אש קטנה על מבער בונזן לייצר קיר עבה מלוטשים פתח בקוטר הרצוי. ודא פתיחת האש המלוטשת נקיה מכל סדקים או קצוות מחוספסים.
6. הכינו שתי מנות לנתיחה על ידי הוספת ~ 25 מ"ל אלסטומר סיליקון מעורב על פי הוראות היצרן לכל צלחת פטרי 100 מ"מ (איור 1Ai ואיור 1B). אפשר לרפא בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
7. עבור התרבות היחידה: להכין 25-50 מ"ל כל בינוני ציפוי ותרבות בינוני לפי טבלה 2 חנות עד שבועיים ב 4 ° C...

2. הכינו פתרונות כדי לשמש על יום של בידוד תא

הערה: הסכומים הבאים לבידוד תרמי של מיוציטים sinoatrial מעכבר אחד.

1. להוסיף 2.5 מ"ל של נמוך Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ של Tyrode (pH 6.9) לכל אחת משלוש צינור תרבות קטן, עגול תחתיתים. מקום צינורות באמבט מים 35 ± 1 ° C.
2. להוסיף 2.5 מ"ל של נמוך Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} של Tyrode אחד צינור תרבות גדול עגול תחתית. כדי צינור זה, להוסיף 1 aliquot (4.75 U) אלסטט ו aliquot אחד (375 מיקרוגרם) תערובת אנזימים פרוטאז collagenase. מערבולת לערבב. צינור מקום ב 35 ± 1 ° C אמבט מים.
3. להוסיף 2.5 מיליליטר של KB בינוני עד שלושה צינורות תרבות קטנים נוספים, עגולים תחתיים ואחד צינור תרבות גדול נוסף, עגול תחתי. מקום צינורות באמבט מים 35 ± 1 ° C.
4. הוסף ~ 7 מ"ל של תמיסת BSA לאחד צינור תרבות תחתית גדול. שמור צינור זה בטמפרטורת החדר.
5. מניחים 20-40 מ"ל של תמיסת של השלם Tyrode בכוס 50 מ"ל (איור 1Aii). הוסף 10 הפרין USP / מ"ל, מערבולת לערבב, ומניחים את הכוס באמבט מים 35 ± 1 ° C.

3. הכינו פתרונות וחומרים נוספים עבור תאים בתרבית (דלגו אלה צעדי תאים מבודדים בחריפות)

1. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, הנח שתי 12 מ"מ coverslips זכוכית עגולה לכל עכבר לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר.
   הערה: הצלחת גם 24 משמשת כי הבארות הן בגודל נוח, אשר ממשמש כדי להגביל את עוצמת הקול עבור זיהומים נגיפיים שלאחר מכן.
2. פיפטה כ 200 μl של פתרון 100 ng / ml של laminin עכבר מדולל בופר פוספט סטרילית (PBS) על כל coverslip.
3. דגירה coverslips עם laminin למשך הבידוד (לפחות שעה 1) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
4. טרום חמים הבינוני הציפוי ותרבות הבינונית (מ שלב 1.7 ולוח 3) עד 37 מעלות צלזיוס.

4. בידוד צומת Sinoatrial

1. במנדף כימי קטר, למקם עכבר בתא אחד של קופסת שני קאמרית להרדים עם ~ 200 μl isoflurane נוזלי הציג באמצעות מקלון צמר גפן לתוך תא אחר. אשר הרדמה (בדרך כלל תוך ~ 30-60 שניות) עם קמצוץ הבוהן. להרדיםהעכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
   הערה: תיבת קצה פיפטה ריק 1 מ"ל ניתן להשתמש כדי ליצור את תיבת שני קאמרית; להפוך את מתלה במהופך בתיבת ליצור תא נפרד עבור isoflurane כדי למנוע את העכבר מן ההתקשרות עמה ישירות.
2. סור פרווה מחזה עם כלוב מספרי חתך צלע לחשוף את חלל החזה באמצעות מלקחי רקמות חיצוניים (איור 1Aviii) ומספרי דיסקציה (איור 1Avix). לרחוץ את חלל החזה עם ~ 2 מ"ל חימם השלם Tyrode של עם הפרין בעזרת פיפטה ההעברה.
   הערה: המשך חלל החזה רחצה בעת הצורך, אינם מאפשרים הכנה להתייבש.
3. תחת מיקרוסקופ לנתח, להסיר בזהירות את הריאות התימוס באמצעות מספריים פנימיים (איור 1Avi) מלקחי דיסקציה (איור 1Avii).
4. תוך כדי לחיצה על הקודקוד בעדינות של הלב עם מלקחיים דיסקציה פנימי, לחתוך בזהירות את הווריד הנבוב נחות אאורטה עם המספריים הפנימיים כדי להסיר את לב מחלל החזה. מעבירים את הלב אחת המנות סיליקון לנתיחה להתרחץ עם ~ 4 מ"ל חימם heparinized השלם Tyrode של בעזרת פיפטה ההעברה.
5. אוריינט בלב כגון שהכלים האחוריים גלויים ומופנה כלפי מעלה, עם העלייה הימנית של החיה על אטריום על ימין ועל שמאל של הנסיין על השמאלי של הנסיין. לאחר אוריינטציה, לשתק את הלב על ידי מצמיד דרך איפקס לתוך צלחת סיליקון לנתיחה.
6. אתר את החריץ בין החדרים ואת הפרוזדורים (הטבעת ברורה מעל החדרים).
7. בעזרת המספריים לנתיחה הפנימיים, עושה חתך בחלק הגרוב, שמירה קרובה החדרים מ הפרוזדורים. שטוף את חריץ חתך עם Tyrode השלם נוסף חמם heparinized כמו של נדרש כדי לאפשר תצוגה ברורה של הפרוזדורים ואת השסתומים. המשך לחתוך לאורך החריץ להפריד בין הפרוזדורים מן החדרים.
8. העברת רקמות פרוזדורים אל המנה השנייה סיליקון לנתיחה להתרחץ עם ~ 3 מ"ל חימם heparinized השלם Tyrode של.
9. אוריינט הרקמה כך אטריום ימין של החיה הוא עכשיו על השמאל הנסיין, ואת אטריום שמאל נמצא בצד ימין.
   הערה: אטריום ימין הוא יותר שקוף, תוך הפרוזדור השמאלי יש יותר של בטון אדום כהה.
10. הצמד את הרקמה דרך cavae הנבוב הנח המעולה ובזכות נספחי פרוזדורי שמאל, מתיחה הכנה בעדינות. הסר את כל רקמת שומן או אחרת הנותרים כדי לאפשר תצוגה ברורה של התכשיר (להיזהר לא לחתוך לתוך קיר הפרוזדורים, כצומת sinoatrial היא עדינה למדי, יכולה להיפגע בקלות).
11. פתח את הקיר הקדמי של הפרוזדורים ידי חיתוך דרך cavae venae. Re-למקם את הסיכות כמו צורך לדמיין מחץ interatrial.
12. חותכים לאורך מחצה interatrial להסיר אטריום שמאל. Re פינים הכנה, מתיחה בעדינות.
13. הסר tהוא צודק פרוזדורים תוספת ולשחרר את הצומת sinoatrial ידי חיתוך לאורך terminalis cristae, אשר נראה כמו פס כתום כהה הגובל תוספת פרוזדורים.
14. Re פינים הרקמה קטרי ופצע אותו רוחבית (בניצב terminalis crista) לייצר שלוש רצועות שוות בגודלן.

5. עיכול צומת Sinoatrial

1. בעזרת פיפטה אש מלוטש צר (איור 1Aiv), להעביר את שלוש רצועות של רקמת הצומת sinoatrial במכונית הראשונה מבין שלוש צינורית קטנה, עגול תחתית המכילה 2.5 מ"ל של נמוכה Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ Tyrode של ב -35 ± 1 ° C אמבט מים. דגירה במשך 5 דקות.
2. העברת רקמות רצועות אל הצינור התחתון קטן, בסיבוב השני המכיל 2.5 מ"ל נמוך Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ Tyrode של באמבט מים 35 ± 1 ° C, תוך שימוש באותה פיפטה צר. שטוף את רצועות רקמה על ידי עדין מתערבל הצינור או על ידי pipetting עם פיפטה הצר בעדינות. האם לא Invert הצינור.
3. העברת רצועות רקמה אל הצינור התחתון קטן, בסיבוב השלישי המכיל 2.5 מ"ל נמוך Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ Tyrode של, וחזור על השלב כביסה כמתואר בשלב 5.2.
4. רצועות העברת לתוך הצינור עגול תחתית גדול המכיל 2.5 מ"ל של נמוכה Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ Tyrode של עם אנזימים (אלסטט בתוספת תערובת collagenase-פרוטאז) באמבט מים 35 מעלות צלזיוס. ודא שכל שלוש רצועות הרקמה נוכחות. דגירה של 10-15 דקות ב 35 ± 1 °. מערבבים כל 5 דקות על ידי מתערבל הצינור בעדינות. אין להפוך את הצינור.

6. Sinoatrial צומת Myocyte דיסוציאציה

1. בעקבות עיכול אנזים, השתמש פיפטה אש מלוטש צר בעדינות להעביר את רצועות רקמה על צינור קטן, עגול תחתית הראשון המכיל פתרון 2.5 מ"ל KB ב 35 ± 1 ° C. לשטוף רקמות ידי מתערבל הצינור בעדינות.
   הערה: רצועות רקמות תופענה שקופות מעט ועשויות גוש ביחד בבית הנקודה. ידית בעדינות רבה לאחר עיכול אנזימטי כדי למנוע אובדן תאים.
2. העברת הרקמה אל הצינור העגול תחתי הקטן הנוסף שהכיל 2.5 מיליליטר KB ב 35 ± 1 ° C. מערבולת בעדינות כדי לשטוף.
3. העברת הרקמה אל הצינור העגול תחתי הקטן השלישי המכיל 2.5 מיליליטר KB ב 35 ± 1 ° C. מערבולת בעדינות כדי לשטוף.
4. העברת הרקמה אל הצינור הגדול, העגול תחתי המכיל 2.5 מיליליטר KB ב 35 ± 1 ° C.
5. בעזרת פיפטה האש מלוטשת הגדולה (האיור 1Aiii והאיור 1C), לנתק את התאים בצינור העגול תחתי הגדול על ידי טחינת דקה קבועה על כ 0.5-1 הרץ למשך 5-10 דקות, מקפיד לשמור על צינור דיסוציאציה שקוע בתוך 35 ± 1 ° C אמבט מים כדי למנוע החדרת בועות לתוך התמיסה.
   הערה: זמן טחינה דקה משתנה עם קוטר של פיפטה דיסוציאציה והכוח של pipetting. זמן צריך להיות מותאם כך את החלקים הנותרים רקמות בזמן tהוא סוף דיסוציאציה להופיע דק ושקוף ומדובלל. אם הרקמה נותרת עם השקעה כלשהי צבע, ניתוק צפוי להיות שלם. תדר (0.5-1 הרץ) נקבע על ידי יד.
6. הסר צינור עגול תחתית המכיל ניתק סאמס מן האמבטיה במים לאזן בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.

7. Re-הסתגלות סידן צומת Sinoatrial (מבוצע בטמפרטורת חדר)

הערה: לקבלת סאמס המיועדים ניסויים תרבות, הליך כלשהו בסעיף הבא צריך להתבצע במנדף בתרבית רקמה סטרילית. אם סאמס הוא לשמש לניסויים חריפים, אין צורך לבצע את הפעולות הבאות בסביבת סטרילית.

1. הוסף 75 μl של NaCl / CaCl ₂ פתרון הסתגלות (טבלה 2). מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 5 דקות.
2. להוסיף 160 μl של פתרון NaCl / CaCl ₂ הסתגלות. מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 5 דקות.
3. להוסיף 390 μl של סול BSAution (טבלה 2). מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 4 דקות.
4. הוסף 1.25 מ"ל של תמיסת BSA. מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 4 דקות.
5. להוסיף 4.37 מ"ל של תמיסת BSA. מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 4 דקות.
   הערה: הריכוז הסופי של סידן יהיה 1.8 מ"מ.
6. בעקבות מחדש הסתגלות סידן, לאסוף סאמס בכך שהוא מאפשר להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך ~ 10 דקות או על ידי צנטריפוגה ב ~ 2,000 XG במשך 3 דקות.
   1. עבור תאים מבודדים בחריפות, בעדינות להסיר ולסלק כ -5 מ"ל של supernatant בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, משאיר תאים בנפח של ~ 2 מ"ל. אחסן תאים אלה בטמפרטורת החדר למשך עד ~ 8 שעות עבור הצמד תיקון הקלטות.
   2. עבור תאים בתרבית, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר בעזרת פיפטה פסטר זכוכית סטרילית. גלולה תא גלולה ב 1 מ"ל מחומם מראש (37 ° C) ציפוי בינוני (טבלה 2).

ציפוי 8. והתרבות של Sinoatrial מיוcytes (דילוג עבור תאים מבודדים בחריפות)

1. הסר פתרון laminin מ coverslips משלב 3.3 עם פיפטה פסטר. מיד זרע 500 μl (~ 50-100 תאים) על כל coverslip laminin מצופה (משלב 3).
   הערה: monoxime 2,3-butanedione מעכב התכווצות (BDM) נכלל בתקשורת ציפוי ותרבות למנוע התכווצות, הגורמת התשה של תאים ^9.
2. מחזירים את הצלחת 24-היטב המכיל סאמס זורעים החדש אל האינקובטור ולשמור על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 95% אוויר / 5% CO _2. אפשר תאים לדבוק coverslips במשך 4-6 שעות ב מדיה ציפוי (טבלה 2).
3. הוצא בעדינות בינוני ציפוי בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. חלף עם 500 μl לכל גם מחומם מראש (37 ° C) בינוני תרבות (טבלה 2).

9. התמרה adenoviral של תרבויות Myocyte Sinoatrial למבוגרים (דילוג עבור תאים מבודדים בחריפות)

1. הערכת מספר ceLLS לכל coverslip מייד לפני יישום אדנו ידי ספירת תאי שדה הראייה תחת מיקרוסקופ, תקנון ההגדלה. לספור את כל התאים, לא רק סאמס.
2. לדלל אדנו ב בינוני 199 ולהתאים את דילול עבור כייל הנגיף כך שתחולת 1-10 μl נדרש כדי להשיג ריבוי הסופי של זיהום (משרד הפנים) של 100 יחידות ויראלי לכל תא. הוסף פתרון adenoviral באופן dropwise ישירות על גבי מצופה סאמס.
3. דגירת תאים עם הלילה במדיום המכיל וירוס (~ 12-14 שעות). ואז להחליף עם מדיום תרבות טרי. שמור על תאי חממה, שינוי התרבות בינונית כל 48 שעות, עד ביטוי חלבון רצוי מתקבל.

10. הערכה תפקודית של סאמס המבודד או מתורבת בחריפות

הערה: הפרוטוקול להלן דוגמא של הערכות תפקודיות של סאמס מבודד באמצעות amphotericin המחורר-תיקון טכניקה להקליט הוא נקודות גישה ספונטניות ואני _{f מאותו התא (ראה התייחסות ^9).}

1. הכינו פתרונות ההקלטה כמתואר בטבלה 3.
2. כן פתרון מניות של 20 מ"ג / מיליליטר amphotericin-B ב DMSO טרי ביום ההקלטה. שמור המניות בטמפרטורת החדר ולהגן מפני אור. לדלל מניות amphotericin-B פתרון תאי לריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מיליליטר רק לפני השימוש. שמירה על פתרון פיפטה הסופי על הקרח להגן מפני אור.
   הערה: פיפטה המכיל amphotericin פתרון ניסויים צריך להיות מוכן טרי מדי שעה על ידי דילול aliquot של פתרון המניות לתוך התמיסה התאית vortexing דקות לפחות 1.
3. העבר aliquot של בחריפות ניתק ההשעיה תא SAM או שבר זכוכית coverslip נושאות סאמס תרבותי אל חדר הקלטה המכיל פתרון של Tyrode ב 35 ± 1 ° C. Perfuse תאים עם פתרון של Tyrode לפחות 2 דקות לפני recordin אלקטרוgs כדי להסיר כל BDM שיורית שנותר מן התרבות בינונית.
   הערה: התכווצויות ספונטניות צריכות להיות ברורות מייד עם העברת הפתרון של Tyrode. סאמס להקלטה ניתן לזהות על ידי שילוב של תכונות, כולל פעילות התכווצות ספונטנית, מורפולוגיה אופיינית (למשל., איור 2), חוסר תלמים, ביטוי של חלבון HCN4, בנוכחות הנוכחי אני _F, קיבול הממברנה <50 pF, ואת נקודות גישה ספונטנית עם גל הכוללות שלב שלילת קוטביות הדיאסטולי ו upstroke איטי.
4. באמצעות טפטפות זכוכית בורוסיליקט עם התנגדויות של 1.5-3.0 MΩ, למלא את הקצה עם פתרון תאי חסר amphotericin על ידי טבילה למשך 10-30 שניות. לאחר מכן חזרה למלא את פיפטה עם תמיסה המכילה-amphotericin. חותם GΩ מצורף תא יש לקבל כמה שיותר מהר. אם ההיווצרות חותמת קשה, להאריך את משך זמן טיפ-מילוי.
   הערה: התנגדות הגישה צריכה להיות באופן רציףהפיקוח הבא היווצרות של החותם מצורף התא, והקלטות יש להתחיל לאחר קבלת התנגדות גישה יציבה רק של <10 MΩ.
5. כדי להקליט נקודות גישה ספונטניות, לעבור את המגבר למצב נוכחי מהדק מהיר ללא הזרקה נוכחית.
   הערה: 1 ננומטר isoproterenol נכלל הפתרון של Tyrode תאי בעת הקלטת נקודות גישה על מנת לייצב את קצב הירי, כפי שדווח בעבר ^10.

הפרוטוקולים המתוארים כאן הועסקו בעבר לבודד ספונטני פעיל סאמס מעכברי בוגרים מתאימים מגוון רחב של מחקרי מהדק תיקון שונה ^5-8. בנוסף, הפרוטוקולים מאפשרים סאמס מבודדים שאפשר לקיים בתרבות עד שבוע אחד. החדרת גנים לתוך תאים בתרבית יכול להתבצע באמצעות זיהום adenoviral ^9. התוצאות המוצגות בסעיף זה נובעים מהעבודות הקודמות שלנו מוצגות כאן כדוגמות המאפיינים של בחריפות סאמס מבודד תרבותי.

כפי שניתן לראות בתרשים 2, ספונטני פעיל סאמס יכול להישמר בתרבות עד 6 ימים. התאים בתרבית לשמר נושא מורפולוגיה הכוללת כי הוא מאוד דומה לזה של סאמס בחריפות המבודדת, ללא שינויים משמעותיים האורך, הרוחב הממוצע, אזור החתך, או קיבול הממברנה של בתרביתתאים לעומת תאים מבודדים בחריפות (תרשים 2B - E). היתה זאת התשה של מספר סאמס קיימא לאורך זמן בתרבות. לפיכך, מומלץ כי תרבויות להיות מוכנות מתאי ונקווה מחיות מרובות אם תכנון הניסוי דורש מערכי נתונים נרחבים.

יעד מרכזי בפיתוח הפרוטוקול לתרבות של מיוציטים sinoatrial מעכברים בוגרים היה ליצור מערכת שתאפשר הביטוי של חלבונים אקסוגני בהקשר הסלולר היליד המבוגר סאמס. דוגמא לסוג זה של ביטוי חלבון מוצגת באיור 3 עבור המקרה של תאי שיתוף נגוע וירוסים להביע את החלבונים בסמן פלורסנטי GFP ו mCherry. מצאנו כי ביטוי חלבון ניכר בבירור בתוך 24 שעות של זיהום adenoviral, והיה מקסימאלי עבור חלבוני הבדיקה תוך 48 שעות (איור 3). משרד הפנים ויראלי של 100 הביא כמעט 100% INFיעילות השיקוף ללא עדות רעילות הסלולר. לעומת זאת, transfection באמצעות ריאגנטים שומנים מבוססים הצליח לייצר בכל העברת גנים לזיהוי לתוך המבוגר סאמס, גם לאחר 72 שעות ^9.

אפיון פונקציונלי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה תיקון- clamp הוא קריטי להערכה של שני 4A סאמס. האיור המבודד התרבותי בחריפות תערוכות הקלטות נוכחי מהדק טיפוסיות של פוטנציאל פעולה הספונטני רשם סאמס מבודד או מתורבת בחריפות באמצעות תצורת ההקלטה מחוררת-תיקון amphotericin. גל פוטנציאל פעולה היה דומה סאמס מבודדים תרבותיים בחריפות ולא היה הבדל בשיעור ירי AP הממוצע (האיור 4B).

אני _F היא סימן ההיכר של סאמס ואת ערוצי HCN4 המייצרים אני _F משמשים כסמנים immunocytochemical של הצומת sinoatrial. מכאן presence של אני _F בהקלטות מהדק תיקון יכול לשמש כדי לתמוך ברעיון כי התאים הם למעשה סאמס. כל סאמס החריף ותרבותי הפעיל באופן ספונטני כפי שיתואר בהמשך הציגו גם אני _F> 100 PA בתגובת צעד מתח 1 שניות כדי -120 mV. לקבלת התוצאות נציג המוצגים כאן, התאים היו perfused עם פתרון של Tyrode המכיל 1 מ"מ BaCl ₂ לחסום K ⁺ זרמים (לוח 3) והתלות במתח של הפעלת אני _F היה assayed ידי 3 שניות צעדים מתח hyperpolarizing מ -60 ל -160 mV מן הפוטנציאל אחזקה של -50 mV, כפי שתיארנו קודם לכן ^5-8. הצפיפות הנוכחית הוערכה בתגובת 3 פולסים שניות hyperpolarizing מבחן -150 mV מן פוטנציאל אחזקה של -50 mV. לא היו הבדלים משמעותיים בשתי תלות במתח של הפעלת אני _F או אני _F צפיפות זרם בין מבודדים בחריפות ו סאמס תרבותי (איור 4C - D). הקלטות שיתוף אלה של APS הספונטני ואני _f מ סאמס בודד דורשים כ -9 דקות בסך הכל (כולל שטיפה ראשונית 2 דקות, 30-60 שניות של APS הספונטנית במצב מהדק נוכחי, שינוי פתרון 2 דקות, ולאחר כ -5 דקות עד לאסוף נתונים מהדקים מתח מספיק כדי לתאר את ההפעלה-תלות המתח של של אני _F). לפיכך הנתונים שמוצגים באיור 4C גם להמחיש את חוסנו של הכנת התא.

איור 1: כלי Dissection עבור בידוד דיסוציאציה של העכבר סאמס (א) לי שתי 10 ס"מ צלחות פטרי המכילות ~ 25 מ"ל נרפא אלסטומר סיליקון... כל מנה היא מראש עם 6-10 סיכות לנתיחה קטנות עבור רקמות משתקות. Ii. 100 כוס מיליליטר להחזקה שלמה Tyrode של ב -35 &# 176;... C אמבט מים iii Wide (~ 2 מ"מ קוטר), פיפטה דיסוציאציה אש מלוטש iv צר (~ 1.5 מ"מ קוטר) פיפטה העברת אש מלוטש נ פיפטה העברת פלסטיק להכנת רחצה עם השלם Tyrode של עם... הפרין. vi. עצמית פתיחת מספריים מיקרו לפרוצדורות חיתוך פנימי. vii. מלקחיים פיין (גודל טיפ 0.06 x 0.02 מ"מ) עבור מניפולציה רקמות פנימיות. viii. מלקחיים רקמות, 5.5, 1 x 2 שיניים עבור מניפולציה רקמות חיצוני. ix. איריס מספרית מעוקל 4.3 לפרוצדורות חיתוך חיצוניות. (ב) צילום תקריב מדגיש סיכות לנתיחה קטנות להציב בצלחת לנתיחה. (C) תקריב צילום הדגשת פיפטה העברת צר אש מלוטשת (משמאל) אש מלוטשת פיפטה פעורה פה על טחינה דקה מכאנית (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג versio גדול n של נתון זה.

. איור 2: מבודדים בחריפות ו סאמס בתרבית הם מורפולוגית נבדל ת:. תמונות שדה מוארת של נציג סאמס או מיד לאחר בידוד (אקוטי) או לאחר 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, או 6 ימים במבחנה B - D : ממוצע (± SEM) אורך מרבי, רוחב חתך באזור המבודד בחריפות לעומת 48 שעות בתרבית סאמס E:. הממוצע (± SEM) קיבול הממברנה מהקלטות מהדק מתח מ סאמס מבודד או מתורבת בחריפות. כל ההשוואות אינן משמעותיות: p> 0.05 לעומת חריפה. מעובד מתוך התייחסות ^9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

התחת = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 3: ביטוי adenoviral של חלבונים אקסוגניים תרבותי סאמס שדה מואר ותמונות epifluorescent של סאמס התרבותי הנציג כי נדבקו ב משרד פנים של 100 עבור adenoviruses להביע eGFP (ירוק) ו mCherry (אדום), או ב 24 או 48 שעות לאחר. זיהום כפול. בר סולם = 20 מיקרומטר. לשחזרו מהתייחסות ^9.

איור 4: אפיון אלקטרו של A בתרבית סאמס:. קלטות מהדק נוכחיות נציגה מבודדת בחריפות (שחור) או מתורבת (האפור) סאמס בתמיסה של Tyrode המכילה 1 ננומטר isoproterenol. ברי סולם: 40 mV, 100 msec B:. ממוצע (± SEM) מיידיירי תדירות מבודד בחריפות (שחור; n = 6) או 48 שעות תרבותיות (אפור; n = 14) סאמס C:. ממוצע מנורמל (± SEM) יחסים במתח מוליך עבור אני _F ב מבודד בחריפות (שחור; n = 8) או מתורבת (אפור; n = 14) סאמס ריבועים:.. משפחות נוכחיות נציג חריף (שחור) או סאמס תרבותי (אפור) שהושר על ידי פולסים בדיקה 3 שניות hyperpolarizing מ -60 ל -160 mV במרווחים של 10 mV D: ממוצע ( ± SEM) אני צפיפות זרם _f ב -150 mV ב מבודדים בחריפות (שחור; n = 7) ותרבותיים (אפור; n = 8) סאמס. מעובד מתוך התייחסות ^9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> טבלה 1:. פתרונות דיסוציאציה יצירות של פתרונות המשמשים דיסוציאציה של מיוציטים הצומת sinoatrial. ריכוזים ניתנים מ"מ אלא אם צוין אחרת.

טבלה 2: ציפוי ופתרונות תרבות יצירות של פתרונות המשמשים ציפוי והתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial..

טבלה 3: פתרונות הקלטת Electrophysiology יצירות של תאית (של Tyrode) ו תאי (PP) פתרונות המשמשים להקלטות מחוררות-תיקון amphotericin מ מיוציטים צומת sinoatrial..

מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים עבור הבידוד וההתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial בדיל באופן מלא מעכברים בוגרים. פרוטוקול הבידוד באופן מהימן מייצר סאמס עכבר פעיל באופן ספונטני מתאים לניתוח אלקטרו מיידי או תרבות שלאחר מכן. פרוטוקולים דומים דווחו על ידי קבוצות רבות אחרות (למשל, לראות את הפניות ^{11,12,10,13-17).} עם זאת, הפרוטוקול שלנו לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה משמר את המורפולוגיה האופיינית, פעילות ספונטנית, ואת תכונות אלקטרו של התא ומאפשר למסירת adenoviral של חלבונים ^9.

עבור שינוי ופתרון בעיות של הפרוטוקולים, כמה צעדים קריטיים יש לציין. הגורם הקריטי הראשון הוא השתנות משמעותית הרבה-אל-הרבה בפעילות האנזימים לעכל (שלב 1.4), אשר יכול באופן דרמטי לשנות את מספר ואיכות סאמס מבודדת בתוך prepar נתוןation. השתנות זה נכון במיוחד עבור אלסטט, אשר בדרך כלל דורש אופטימיזציה ספציפית-הרבה, שבו פעמי ריכוז חשיפה צריכות להיות תיחום במהלך כמה הכנות (לעתים קרובות נעשה במקביל) על מנת למקסם את המספר הסלולרי ובריאות. כמה פרוטוקולים עבור הבידוד של סאמס ממינים שונים להשתמש אנזימי collagenase ו פרוטאז יחידים, ולא תערובת אנזימי פרוטאז collagenase בפרוטוקול הנוכחי. עם זאת, שונה הרבה-אל-הרבה עבור כל אחד האנזימים האלה הוא גבוה למדי (בדומה לזה של אלסטט), דבר מחייב סיבובים חוזרים ונשנים של אופטימיזציית שיתוף. שילוב האנזים מספק יותר עקבי לאורך הרבה ומחייב ביצוע צעדים אופטימיזציה פחות.

שנייה קריטית, unobvious, גורם לפתרון בידוד SAM היא שלמות של פיפטה דיסוציאציה זכוכית אש מלוטש (תרשים 1C). אם שפת פיפטה מכילה כל קצוות חדים, סדקים או ג שנצברפסולת ellular, הצעד טחינה דקה מכני יכול לגרום נזק לתאים, וכתוצאה מכך רעילות סידן. פיפטה דיסוציאציה האש מלוטשת צריכה להיות מוחלפת לפחות כל 2 חודשים של שימוש קבוע, או בכל עת כי תשואת התא או האיכות יורדת באופן ניכר במהלך הכנות כמה.

העיתוי ואת הכח של הניתוק המכאני הוא שלב קריטי שלישי לפתרון פרוטוקול הבידוד. הטחינה הדקה דורשת איטי (כ 0.5-1 הרץ) אבל מערבולת חזקה למשך 5-10 דקות. שיעורים מהר וזמניים מופחתים גם יכולים לשמש, אולם חשוב כדי למנוע החדרת בועות או יצירת קצף הפתרון. כאשר דגימות צומת sinoatrial כבר ניתקו לחלוטין, הרצועות הנותרות הרקמות אמורות להופיע דקיקות בצבע לבן; צביעה הוורודה-ish עדין מציינת טחינת דקה שלמה. כאשר בדקו בהגדלה 200-400X, תאי מדגימות מוכנות בצורה אופטימלית יש קרום תא חלק, ואילו memb התאRanes ממדגם יתר מתעכל או יתר triturated יש מראה מכתשים וחד. בתאים בריאים, התכווצויות הם נצפו בעיקר עוויתות עדין כמו הקצוות של התאים. גלים של התכווצות הם סימן של תאים פגומים, אשר ניתן לצפות להתכווץ בחוזקה במשך זמן קצר, לפני למעלה דופק. פיפטה דיסוציאציה סדוק הוא הגורם השכיח ביותר של נזק לתאים כאלה. בדגימות שהיו תחת מעוכל או תת triturated, תאים נוכחים כמו גושים או אגרגטים במקום תאים בודדים, ומספרים משמעותיים להידבקות סאמס ניתן לראות את נתחי רקמה הנותרות.

כל משתמש יצטרך בנפרד לייעל את הניתוק. למרות העיכול אנזימטי ושעות ניתוק מכאניות הן צריכים להיות מותאמים, מומלץ בתחילה כדי לשמור על זמן עיכול אנזימטי מתמיד תוך שינוי זמן דיסוציאציה. כוונון עדין נוסף מסתמך בעיקר על היכולת של המשתמש להכיר אppearance של חתיכות הרקמה הנותרת בסיום הטחינה דק - כאשר הוא החתיכות דלילות לבנבן בצבע, אז הטחינה הדקה צריכה להיפסק. אופטימיזציה היא גם צורך להתאים וריאציות צומת sinoatrial שמלוות הבדלי גיל, מין, או זן של עכברים. לדוגמא, דיסוציאציה של תאים מבעלי חיים מבוגרים ⁷ דורשת הפחתה בשני עיכול אנזימטי ושעות ניתוק מכאניות. כהנחיה כללית, הכנה אופיינית עכבר C57BL גבר בן 2-3 חודשים / 6 תשואות בערך 50-200 סאמס קיימא, מתוכם אולי 5-10 יכול להיות בהצלחה-הדק תיקון בפגישה של יום טוב, תלוי הניסויים . התשואה משמעותית (~ 30%) נמוכה יותר כאשר עכברי מבוגרים משמשים ^7.

ההצלחה של פרוטוקול התרבות גם מסתמכת על כמה שלבים עיקריים. בראש ובראשונה, את ההצלחה של תרבית תאים ראשונית דורש ניתוק באיכות גבוהה, כפי שפורט לעיל. מומלץ העל הכנת התא המבודדת בחריפות להיות מותאם לפני שתנסה לשמור על התאים בתרבית. גורם קריטי שני עבור תאים בתרבית טמון בבחירה של תאים עבור קלטות אלקטרו. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סאמס תרבותי שנבחר להקלטות צריך להפגין התכווצויות ספונטניות מייד עם כישלון של מדיום התרבות המכיל BDM. התפרצות איטית של התכווצויות ספונטניות על שטיפה-אאוט של BDM היא סימן של תאים בריאים.

מערכת התרבות SAM יש מספר מגבלות, בעיקר בגודל קטן מאוד של העכבר SAN. בעוד השיטות הפגינו כאן לאפשר מספרים סלולריים מספיק מחקרי אלקטרו הדמיה, הכמות המוגבלת של רקמות מונעת ניתוחים ביוכימיים של בתרבית סאמס. מגבלה נוספת של הטכניקה היא כי סאמס חייב להיות מתורבת בנוכחות המעכבת ATPase השרירן ההפיך, BDM. זוהי דאגת פוטנציאל בגלל BDM יש השפעות תאיות אחרות, לרבותהלא ספציפית phosphatase פעילות, עיכוב של שעתוק לב גורמי ^19, ועיכוב של תעלות נתרן, ערוצי סידן קולטנים ryanodine ^20. עם זאת, הנתונים מראים כי יש BDM אפקטים מינימלי על תכונות מורפולוגיות אלקטרו של סאמס assayed כאן.

ביישומים עתידיים, נראה סביר כי מהשיטות המתוארות כאן יכולות להיות מותאמות כדי להכין תרבויות SAM מיונקים גדול יותר. בשילוב עם העברת גני adenoviral, תרבויות כאלה עלולות לאפשר מניפולציות גנטיות של pacemaking במודלים של בעלי חיים גדולים. היכולת להציג חלבוני העניין מספקת גם עבור יישומים עתידיים שבו מקודד גנטי מולקולות כתב יכולות לשמש כדי לחקור מסלולי איתות תאיים סאמס.

None.

We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.