Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

İnsan genetik çalışmalar için yüksek kalitede DNA temininde hastalık geni bulma işlemi esastır. Kan, tükürük toplama daha pahalı olması da invaziv işlemler gerektiren ve rağmen, fonksiyonel çalışmalar için sonsuz bir DNA kaynağı veya iPSCs olarak ölümsüzleşti hücre hatları oluşturmak için tercih edilir ve hücre hatları mevcut olmadığında bazen kan DNA kullanılır. Bununla birlikte, kan elde eğitimli bir flebotomist gerektirir ve kan tükürük ¹ daha kısa bir yarı-ömrü vardır. O toplanan ve böylece iyi hastane ve laboratuvarlardan ² su toplama alanı dışında potansiyel denek havuzu artan flebotomist için gerek kalmadan posta yoluyla gönderilen olabilir beri tükürük DNA elde etmek daha az pahalı ve daha kolaydır. Konular yerine kan ^{3, 4} bir tükürük örneği vererek seçeneği varken Çalışması okullaşma gelişmiş olabilir. Miktar ve tükürük DNA kalitesi ile ilgili endişeler bizi yaygın sınırlı olabilirtükürük ^{2, 3, 4, 5} önemli miktarda elde etmedi eski yanak bezlerden yöntemleri üzerinde DNA testi için mililitre başına 4.3 x 10 ⁵ hücre ortalama ile, bütün tükürük uygunluğunu gösteren çok sayıda çalışma son çalışmalarda rağmen ^{e, 6.} mütevazı bir edebiyat microarray tabanlı yöntemler ^8, dahil genotiplendirme uygulamalar için bütün tükürük edilen DNA uygunluğunu gösteren var iken ^{9, 10,} herhangi bir çalışma inceleyen gelecek nesil dizileme (NGS). Bütün bu tükürük DNA ekstraksiyon protokolü optimize etmek için hedefe kolaylıkla ortak reaktifler ve sarf malzemeleri ile laboratuarlarda uygulanan maliyet etkin bir şekilde genetik uygulamalar için miktar ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak oldu.

Tükürük DNA ekstraksiyon çeşitli prosedürler gerektirir: 1) toplama ve depolama, 2) hücre parçalama, 3) RNaz tedavisi, 4) protein çökelmesi, 5) etanol yağış, 6) DNA rehidrasyon. Tarif edilen DNA sabitleştirme Tampon çözelti,Daha önce ^2, yeterince değişiklik olmadan fonksiyonları. RNaz tedavi ve DNA rehidrasyon adımları optimize için hiçbir girişimde bulunuldu. Kalan her adım için, verimi etkileyebilecek çeşitli değişkenler tespit edilmiştir. Her bir değişken ayrı ayrı manipüle edilmiş ve verim ve kalitesinde iyileşme istatistiksel olarak değerlendirildi. Veriminin ve / veya DNA kalitesini geliştirdiği gösterildi değişkenler için, en uygun değerleri final protokolüne dahil edilmiştir.

NOT: Önceki tükürük örnekleri sağlayarak tüm konular Nationwide Çocuk Hastanesi, insan deneklerin tedavisi için yönergelere uygun bilgilendirilmiş onam formu.

1. Tükürük Toplama ve Saklama

1. Tükürük toplama önce, öznenin ağız konu su ile ağzınızı çalkalayın sahip ve yeme kaçınarak veya numune toplama önce 30 dakika boyunca içerek gıda veya diğer yabancı maddelerden arındırılmış olduğundan emin olun.
2. Başlığın veya borunun iç dokunmamak için emin bir DNA sabitleme tamponu ^2, 2.5 ml bir 15 ml santrifüj tüpü açın ve söz konusu tampon çözeltisi içine, tükürük 2,5 mi tükürük vardır. Not: tükürük fazla 2,5 ml Toplama DNA sabitleştirme tamponu, numune oranı yetersiz bir ikinci örnek bozulmasına yol açabilir. Çok az tükürük Toplama protokol beklenen verimi azaltacaktır. Toplama hacimleri değerlendirmek için, t tarafında sayılı geçişlerini kullanmakdiye tüp.
3. Kapağı yerine yerleştirin ve bu karışım homojen hale getirene kadar inversiyon yolu ile karıştırılır. Çalkalama gerekli değildir. Kısa süreli depolama veya uzun süreli depolama boyunca 4 ° C (> 3 ay), oda sıcaklığında örnekleri saklayın.

2. İlk Hazırlıklar ve Hücre Lizis

1. Önceki ekstraksiyon başlangıç, 37 ° C bir su banyosu ısı ve bir buz kovası hazırlar. Üç 15 ml konik santrifüj tüpleri her numune için ekstre edilmiştir gerekli olacaktır. Üç tüp, hücre ve protein topağı, son ekstre gDNA ve izopropanol ve etanol süpernatantlar tutmak için kullanılacaktır.
2. 15 saniye sonra orta hızda vorteks depolama örnekleri ve ters örnekleri birkaç kez almak.
3. Temiz bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne numune 2.5 ml koyun ve Celi Lysis Çözüm 5 ml ilave ediniz. Ters, numune 50 kez karıştırılır ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

3. RNA Kaldırma

1. Rnaz A Sol 40 ul ekleyin100 mg / ml Katkı ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 3 dakika boyunca buz üzerinde 37 ° C su banyosu numuneyi çıkarın ve soğuk.
   1. RNaz bir inkübasyondan sonra, protokol DNA rehidrasyon aşama boyunca 65 ° C'ye kadar su banyosu sıcaklığını arttırabilir.

4. Protein ve Lipid Kaldırma

1. Ml / 20 mg Proteinaz K çözeltisi 50 ul ters çevirme ile birkaç kez karıştırın ve 30 dakika en az oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: Bu protokolü için olası bir duraklama noktasıdır. Ekstraksiyon tamamlanabilir kadar Proteinaz K solüsyonu ilave edildikten sonra, numune, 4 ° C'de saklanabilir. En fazla 24 saat boyunca 4 ° C 'de depolama, ekstraksiyon verimi veya DNA kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu gösterilmemiştir. Bu aşamada uzun süreli depolama henüz değerlendirilmemiştir.
2. 10 dakika boyunca buz üzerinde yüksek hızda 20 saniye, ve yeri boyunca kuvvetli bir şekilde, girdap protein çökeltme çözeltisinin 1.7 ml ilave edilir.
3. Örnekler 3000 x g'de 10 dakika ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj boyunca buz üzerinde soğutuldu sonra. Çöken proteinler, sıkı bir topak oluşturmak devam etmek gerekir. Topak sıkı değildir ya da çözelti hala puslu olması halinde, numuneler daha 5 dakika boyunca buz üzerinde soğutulabilir ve santrifüj işlemi tekrarlanır. Numuneler, bir sıkı bir pelet sağlamak için buz üzerinde tutulmalıdır.

5. izolasyonu ve saflaştırılması gDNA

1. Temiz bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, bir pipet 5 ml izopropanol ve 20 mg / ml saf Glikojen Çözüm 8 ul.
2. Çöken protein, pelet geride bırakarak, izopropanol ve glikojen çözeltisi içeren bir tüp içine adım 4,3 gDNA ihtiva eden üst sıvıyı dökün. Üst fazı ilave edildikten sonra yavaşça 3.000 x g ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca ters Numune ve santrifüj ile 50 kez karıştırılır.
3. Temiz bir 15 ml tüp içine yavaşça süpernatant dökün. Üstte yüzen maddenin çıkarılmasından sonra,% 70 etanol, 1 ml eklebirkaç kez yavaşça sallanarak hafifçe çökelen pelet üzerine etanol taşıyarak pelet yıkayın. Tüp içinde etanol saklayın.
4. İlk yıkama, 2,000 xg'de 1 dakika ve 20 ° C için örnek santrifüj. Bu santrifüj işlemi, 4 ° C ya da 20 ° C 'de yapılabilir. Sıcaklıkta hiçbir belirgin etkisi, bu aşama için gösterilmiştir.
5. Pelet İlk yıkama ve santrifüj ardından yavaş yavaş tüpten etanol yıkama dökün ve atın, sonra adımları 5.3 ve 5.4 tekrarlayarak bir ikinci yıkama yapar.
6. İkinci yıkamadan gelen süpernatan ayrılmasından sonra, 15 dakika boyunca hava ile kuruması için pelet sağlar.
   1. Numune tamamen kurumuş olduğunda, başka bir 15 dakika boyunca hava ile kurumaya.

GDNA'sından 6. Rehidrasyon

1. Örnek kuruduktan sonra, kurutulan gDNA pelet yeniden sulanması Tris-EDTA içinde 300 ul ilave edin.
2. Bir orta hızda ve yerde 5 saniye vorteks örnek1 saat boyunca 65 ° C sıcak su banyosu.
3. Su banyosundan çıkarın ve numune, oda sıcaklığında O / N inkübe edin.
   Not: Tüm ürünler ve reaktifler Malzeme, Tablo l'de listelenen ikinci, hem de Tablo 4.

DNA, bir DNA ekstraksiyon eşleştirilmiş bir dizi gerçekleştirilmiştir ekstraksiyon için optimal parametreleri belirlemek. Tek bir tükürük örnek bölünmüş ve her bölümü belirli bir değişken için iki muhtemel değere biri ile test edilmiştir. Eşleştirilmiş her testin en az sekiz çoğaltır (örneğin, tek bir tükürük örneği ve ilk 50 ° C inkübasyon olmadan hem ekstraksiyon test etmek için bölündü) yapıldı. Toplam DNA verimi, 260/280 değeri, 260/230 değeri ve parçalanma değerlendirmek için Elektroforezlenmiş DNA görsel muayenesi: Optimizasyon dört standart ölçümlere dayanmaktadır. Değişkenlerin tüm olası kombinasyonları tek tek her değişkenin marjinal etkisini değerlendirmek yerine gözle, (N = 169 kombinasyonları) istatistiksel etkileşimleri değerlendirilmiştir. Etkileri çok-yönlü tekrarlayan ölçümler ANOVA kullanılarak test edildi ve tahmini etkiler eşdeğer regresyon denklemi elde edilmiştir. Tüm önemli bir etkisi aver olarak gösterildiği gibi, Tablo 1 'de özetlenmiştirverimle yaş değişiklik ya da DNA kalitesi (260/280 ve 260/230) (tükürük girişinin ml'si başına ng / | il).

Hücre liziz işlemi (aşama 2) belirlenmesi ile optimize edilmiştir: 50 ° C'de inkübasyon (1 saat) 1) varlığını / yokluğunu Proteinaz K bozunma ve depolama tamponu aracılığıyla hücre parçalama tamamlanması 2 ila şekilde verilmesini sağlamak için, hücre lizizi öncesinde ) varlığında / aşama (orta hız, 15 saniye) ile homojenize vorteks ile bulunmaması ve 3) liziz çözeltisi Kuluçka süresi (5 karşı 30 dakika). 30 dakika inkübasyon, bir hücre liziz% 3.5 (p <.01) ortalama ancak başka bir hücre parçalama değişken verimi üzerinde önemli bir etkiye sahip ile verim artmıştır. Girdaplama istatistiksel olarak anlamlı (p <.001), ancak 0,03 pratikte küçük tarafından 260/280 oranı azalmıştır.

Protein çöktürülmesi (aşama 4) çok protein çökelmesi randımanı daha iyi bir amino asit zincirlerini bozmak için proteinaz K sindirimi öncesinde DNA ve yakalanan serbest bırakır. Proteinaz K miktarı on kat çeşitlidir.Santrifüjleme sıcaklığı 4 ° C ila 20 ° C düşürülmüştür. Proteinaz K miktarını artırmak verimi (% 8.7) ve de biraz gelişmiş hem 260/280 ve 260/230 oranlarında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olduğu.

Etanol yağış (adım 5) incelendiğinde protokolün son aşaması oldu. Toplam santrifüj süresi (5 dakika ¹¹ genel 30) olduğu gibi glikojen taşıyıcı (0, 8 ul) miktarı çeşitlidir. Sadece santrifüj süresi önemli ölçüde% 290 bir ortalama artış, verim etkilenir. Uzun dönme da 260/280 oranı biraz daha (0.05) azalmıştır. Verimine glikojen önemli bir etkisi deneylerde gözlenmiştir; Bu ekstraksiyon DNA'nın toplam miktarı da, tipik olarak glikojen kullanılamaz, yeterince büyük. Bu örneklerde etkisinin olmamasına rağmen, yine de tükürük giriş hacminin burada ya ther eğer verilen daha düşük olduğunda verimde azalma riskini en aza indirmek için glikojen kullanılmasını tavsiye ediyoruzE verim düşük olacaktır inanmak için herhangi bir başka nedenidir.

Temsilcisi DNA örneklerinin Görsel inceleme (Şekil 1) ekstre edilen DNA büyük ölçüde herhangi bir salya, DNA ekstraksiyon işlemi için parçalanmış olmadığını gösterdi, fakat oldukça bozulmuş DNA göstergesidir bulaşması olmaksızın uygun bir yüksek molekül ağırlıklı bant gösterdi. RNase A sindirimi sonra protokol 1,74 ortalama 260/280 üretti.

Tükürük edilen DNA 1. Kalitesi Şekil. Dört çıkarma prosedürleri aynı tükürük toplama uygulanmıştır. (A) Numuneler, bir% 0.8 agaroz jeli (250 ng DNA) üzerinde elektroforeze tabi tutulur. Tükürük DNA ekstraksiyon protokolleri tüm varyasyonların bozulma kanıtı olmadan yüksek moleküler ağırlıklı (> 20 kb) DNA ile sonuçlanır. Şerit: 1 DNA'sı merdr 2 & 3 Oragene prepIT L2P Protokol örnekleri, 4 & 5 Gentra Puregene Vücut Sıvıları Protokol, 6 ve 7 optimize RNA giderme aşaması olmadan protokolü, 8 ve 9 RNA kaldır adım ile optimize protokol. Lanes 2-7, doğrudan aynı tükürük örnekleri üzerinde benzer protokolleri vardır. Şerit 8 ve 9 RNA ayırma aşaması DNA bozunmasını getirmemektedir göstermektedir. (B) Örnekler, bir% 2 agaroz jel (150 ng DNA) üzerinde elektroforeze tabi tutulur. Hafif bir RNA, tepe 7 (sözleşmeler yukarıdaki gibi) ile şerit 2 jelin alt kısmında gözlenmektedir. Şerit 8 ve 9 RNA çıkarılması aşamasının etkisini göstermektedir.

RNA ayırma aşaması (RNase A, aşama 3) DNA bölgesinin tayini için daha kesin kritiktir. Bir Qubit 2.0 Florometre ile ölçülen RNA için çift dallı DNA oranı ile tespit edildiği üzere test sırasında, sürekli olarak yüksek bir RNA muhtevası gözlenmiştir. RNaz'ın olmadan örneklerinden ortalama, nükleik asit içeriğine bir tedavi% 46.6 (± 0.4) RN oluşuyorduQubit en RNA saptanması için mümkün olan en düşük okumasıdır "<20 ng / ml" olarak okumak RNA ayırma aşaması uygulandı C. örnekler.

Ek bir adım RNaz uygulandığında bu optimize protokolü ile elde edilen DNA, yüksek sekanslama için yeterli bir kalitede olmuştur. Hedeflenen yeniden dizileme verileri ulaşmak için, özel bir Agilent SureSelect Hedef Zenginleştirme kiti dizisinin 2.6 Mb hedefleyen, 24 numunelere uygulanmıştır. Yüksek verim sıralama kulvar başına 12 barkodlu (endeksli) örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Sıra, GATK ¹³ baz kalite puanı rekalibrasyon, indel yeniden düzenlenmesi, yinelenen kaldırılması, SNP keşif ve 24 örneklerin genelinde eş zamanlı genotiplenmesi ardından uygulama iyi uygulama sabit filtreleme parametreleri kullanılarak uygulandı hg19 referans genom ¹² BWA-saftaydılar okur ¹⁴ değerleri. Tüm numuneler, yüksek kaliteli 24 NGS verileri (Tablo 2) vermiştir. O Illu geçti okurmina standart filtre ve Q ise> 20, her bir numune nadir SNP bulunması için gerekli olan sınırlar içinde, Q> 100 °> 30x içerisinde bir ortalama hedefe kapsama derinliğin sekans zenginleştirme bölgelerin saptanmasına olanak tanıyan aynı hizada 91.4%. Ortalama iplikçik bakiyesi,% 49.9 idi. Illumina microarray genotipleri ile karşılaştırıldığında varyant aramalar% 98.9 uyumu vermiştir.

Miktar / Kalite Ölçütleri'nin Optimize Edilmiş Değişken Tablo 1. Etkisi Boyutu. Tüm etki boyutları sütun başlığında belirtilen birimler bulunmaktadır. ANOVA p-değerleri: * p <.05; ** P <.01; *** P <.001; anlamlı değildir ns

Hedef Zenginleşmeden Yüksek Verimli Sıra Tablo 2. Kalite.

Optimize protokol Tablo 3. Maliyet karşılaştırması piyasada mevcut diğer protokoller ile bütün tükürük 2 ml DNA ayıklamak için. ADNA ekstraksiyonu için gerekli ll reaktifler ve sarf 30 Eylül internette mevcut standart liste fiyatları kullanılarak değerlendirilmiştir, bu protokol tüm tükürük 1.25 ml (DNA ayıklamak için yazılı olduğunu 2013 Not yani, tükürük ve tampon 2.5 ml bu değer, tükürük toplama tüpü içinde toplam hacminin yarısına temsil eder) adım 2.3. Maliyet Karşılaştırma için, 2 mi, bu ortak bir ticari olarak temin edilebilir kit (Oragene) ile ilişkili bir miktar olarak seçilmiştir.

Tablo Ayıraçların 4. Tarifler.

Bu prosedür, büyük ölçüde DNA, kaliteden ödün vermeden, standart yöntemlere göre daha yüksek molekül ağırlıklı DNA verimini geliştirilmiş bir optimize edilmiş DNA ekstraksiyon protokolüdür. Verim çoğunda büyük etkisi ile kritik adım, yaygın olarak ¹¹ dağıtılan değildi biri hariç, burada gözden yayınlanmış herhangi bir protokol daha etanol yağış sırasında uzun bir santrifüj aşamasını kapsamaktadır adım 5.2 oldu. Bu daha santrifüj ile bağlantılı DNA kalitesinde bir değişiklik bütün tükürük koleksiyon mevcut DNA'nın büyük molekül ağırlıklı ve yüksek bozuk olmadığını belirten, tespit edilmiştir.

Tüm tükürük toplama gibi toplama aşamasında en aza indirilmesi gerekiyor yabancı kirleticiler için potansiyeli, ve altta yatan bir enfeksiyon belirtisi olabilir numunede aşırı protein varlığı gibi örnek kalite sınırlamaları vardır. Protein veya yabancı kirletici maddelerin büyük miktarlarda canböylece miktarının yanlış yapma nihai çıkarılan DNA kalır. Rehidrasyon (aşama 6) şüpheli sonra kalan proteinleri veya kirletici varsa, bir numune örnek giriş hacmi yansıtacak şekilde ölçeklenmiş hacimleri ile reaktif protein çökeltme adımında başlayarak gerçekleştirilebilir temizlemek. Protokolün bir diğer olumsuzluğu da adımları gerçekleştirmek için gereken zaman uzunluğu. Çoklu örnekleri paralel olarak çalıştırılabilir; Ancak, en fazla 24 paralel çekimi aynı anda çalıştırmak tavsiye edilir. Bu, örneğin, sıkı bir pelet yeniden çözmek için topaklar zaman sağlayabilir fazla 24 örnekleri için, soğukta çalışan kalmalıdır protein çökeltme aşaması için özellikle önemlidir.

Burada sunulan protokol kabul en maliyet etkili yöntem (Tablo 3) 'dir. Bu protokol Puregene ekstraksiyon kiti kullanımı reaktifleri yok iken, Puregene protokolünde önerilen daha küçük bir hacim kullanılırekstraksiyon verimini ödün ve olmadan protokole göreceli maliyet tasarrufu sürücüler reaktiflerdeki bu azalma olduğunu. Çıkarılması için hesaplanan maliyet her öğe için liste fiyatını kullanan ve herhangi bir indirim yansıtmamaktadır unutmayın. Optimize protokol ile ekstraksiyon başına maliyet şirket satış temsilcileri aracılığıyla daha fazla toplu siparişler veya indirimler ile azaltılabilir.

Kanıtlar, bu protokol, yeni nesil dizilemesi ile kullanım için uygun olduğu sürece edilmiştir. Elde edilen veriler kan rutin olarak pek çok hastalıkta insan genetiği araştırmalarının tükürük örneklerinin yarar bir başka kanıtıdır. Kan ve hücre hattı türetilmiş DNA testi için genetik materyalin tercih edilen bir kaynak olmaya devam ederken böyle kaynaklar mevcut olmadığında, bütün tükürük toplama bir alternatif olduğunu, hasta kayıt kendi koleksiyonu veya flebotomiden etkilenir kullanılabilir ya da pratik değildir.

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).