收集和唾液DNA提取用于新一代测序

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

获得高质量的DNA对人类遗传研究是在疾病基因的发现进程至关重要。血，虽然需要侵入性手术，也比唾液采集更昂贵，是有利的，用于创建永生化细胞系的DNA的无限源，或iPS细胞的功能性研究，有时血液的DNA时使用的细胞系是不可用的。然而，获得的血液需要经过培训的采血和血液有一个较短的半衰期比口水^1。从唾液DNA是较便宜，容易得到，因为它可以被收集，并通过邮件发送，而不需要用于抽血，由此增加潜在受试者池远远超出医院和实验室²的集水面积。当受试者具有给人一种唾液样品代替血液^3,4的选择研究登记可以得到改进。左右的数量，从唾液DNA的质量问题可能已限制了其广泛我们ë尽管许多研究最近的研究显示全唾液的适用性，平均每毫升4.3×10 ⁵个细胞，用于对较早的口腔拭子的方法未获得显著量唾液^{2，3，4，5}的DNA检测^{， 6，}虽然适度的文学存在呈现出唾液的DNA是否适合进行基因分型应用，包括基于微阵列的方法^{，8，9，10，}没有研究探讨了新一代测序（NGS）。为优化这种唾液DNA提取协议的目的是最大限度地提高数量和质量的遗传学应用，很容易与普通试剂和耗材实验室实现了一个具有成本效益的方式。

从唾液DNA提取需要几个步骤:1）收集并存储，2）细胞裂解，3）核糖核酸酶处理，4）沉淀蛋白，5）用乙醇沉淀，6）DNA的补液。该DNA的稳定缓冲液，所述的此前^2，没有充分改变功能。没有尝试优化核糖核酸酶处理和DNA补液措施作出。对于每一个剩下的步骤，可能影响产量的几个变量进行鉴定。每个变量都被单独操纵和提高产量和质量统计评估。对于被证实可以改善产率和/或DNA质量的变量的最优值被包括在最终的协议。

注意:在此之前提供唾液样本所有受试者知情同意书符合指引处理在全国儿童医院人类受试者。

1，唾液的采集和存储

1. 此前唾液的收集，确保拍摄对象的嘴是免费的食物或其他异物所具有的主题冲洗他们的嘴的水，避免进食或收集样本前，喝了30分钟。
2. 用2.5毫升的DNA稳定缓冲液^2，确保避免触及上限或管内打开一个15毫升的离心管中，并有课题吐唾液2.5毫升放入缓冲液。注:收集多个2.5毫升唾液可导致样品降解从样品的DNA的稳定缓冲液的不足比率。收集太少唾液会减少从协议预期产量。为了评估珍藏册，使用编号为梯度对T的侧面他管的。
3. 更换盖和通过反转混合，直到混合物均化。剧烈摇动是没有必要的。储存在室温下将样品用于短期存储或4℃下长期储存（> 3个月）。

2，前期准备和细胞裂解

1. 在此之前开始开采，加热水浴至37℃，并准备一个冰桶。三的15毫升锥形离心管中，将需要为每个提取的样品。三管将被用于保持细胞和蛋白质沉淀，最终提取基因组DNA，并在异丙醇和乙醇上清液。
2. 从存储器中检索的样品，并翻转试样几次然后涡流在中等速度持续15秒。
3. 免除2.5毫升样品放入一个干净的15ml离心管中，加入5毫升细胞裂解液。通过倒置混合样品50次，并在室温下孵育30分钟。

3，RNA的去除

1. 加入40μl的RNase溶胶ution在100毫克/毫升，并在37℃下进行15分钟。
2. 从37℃水浴中取出样品，并在冰上冷却3分钟。
   1. 的RNA酶A孵育后，提高水浴温度至65℃的协议的DNA再水合步骤。

4，蛋白质和脂肪去除

1. 加入50微升蛋白酶K溶液20毫克/毫升，颠倒混匀数次，并在室温下孵育至少30分钟。注:这是一个可能的暂停点的协议。在加入蛋白酶K溶液中后，可将样品储存于4℃直至萃取就可以完成。储存在4℃下长达24小时未显示出对萃取率或DNA质量显著效果。长期存放在这个阶段并没有进行评估。
2. 添加1.7毫升的蛋白沉淀溶液，涡旋混合20秒，在高速，并置于冰上10分钟。
3. 一旦样品已在冰上冷却10分钟，离心以3,000 XG 10分钟，4℃。沉淀的蛋白质必须形成一个紧密的小球继续。如果沉淀不紧或溶液仍是浑浊的样品可以在冰上冷却5分钟以上，并离心分离重复进行。样品必须保持在冰上，以确保紧密的颗粒。

5，分离和基因组DNA纯化

1. 到一个干净的15ml离心管，移液管5毫升异丙醇和8微升纯糖原溶液20毫克/毫升。
2. 倾从步骤4.3到含有异丙醇和糖原溶液的管含有基因组DNA的上清液，剩下的沉淀的蛋白质沉淀物的后面。一旦上清液已经加入，轻轻在3000 XG和4℃下混匀50次颠倒和离心30分钟。
3. 慢慢倒入上清到一个干净的15ml试管中。除去上清液后，加入1 ml 70％的乙醇，以通过缓慢摇动，然后轻轻移动的乙醇在沉淀沉淀数次洗涤沉淀。保留在管中的乙醇。
4. 初始洗涤后，离心样品在2000 XG 1分钟和20℃。此离心步骤可以在任4°C或20°C下进行。温度的无显著效果已被证实对于此步骤。
5. 以下将沉淀的初始洗涤并离心，慢慢倾从管的乙醇洗涤并弃去，然后通过重复步骤5.3和5.4进行第二次洗涤。
6. 除去来自第二洗涤上清液后，使沉淀物在空气中干燥15分钟。
   1. 如果样品没有完全干燥，风干另外15分钟。

6补液的基因组DNA

1. 一旦样品已干燥，加入300微升的Tris-EDTA至再水化干燥的gDNA粒料。
2. 涡样品5秒，中速和发生在65℃的热水浴中搅拌1小时。
3. 从水浴中取出样品，并培育在o / n RT。
   注意:所有的产品和试剂使用中列出的材料表，以及表4中 。

为了确定最佳参数提取DNA进行了一系列配对的DNA提取的。单唾液样品被分裂并与两个可能的值对于给定的变量1的各部分进行测试。至少8个重复的每个配对测试被执行（ 例如 ，一个单唾液样品等分，以测试提取具有和不具有初始50℃温育）。优化是基于四个标准指标:总DNA的收量，二百八十零分之二百六十〇值时，二百三十分之二百六十值，和电泳的DNA以评估碎片的目视检查。变量不是所有可能的组合进行了评估统计学的相互作用（N = 169的组合），而是选择单独评估每个变量的边际效应。影响采用多路重复测量方差分析测试，估计影响来源于相当于回归方程。所有显著效果总结在表1中 ，示出为AVER产量年龄变化或DNA的质量（260/280和260/230）（每毫升唾液中输入纳克/微升）。

细胞裂解（步骤2）中的优化通过评估:1）的存在/不存在50℃下温育（1小时）的细胞溶解，以确保蛋白酶K降解和细胞裂解由存储缓冲介导的去完成，2前）存在/不存在同质通过涡旋步骤（中速，15秒），以及3）裂解溶液的温育时间（5和30分钟）。在30分钟的细胞裂解孵化的平均3.5％（P <0.01），但没有其他细胞裂解变量对产量显著效果提高产量。涡旋由统计显著（P <0.001），但实际上小的0.03下降260/280比例。

蛋白质沉淀（步骤4）前面的蛋白酶K消化破坏氨基酸链，提高蛋白质沉淀效率和释放捕获的DNA。蛋白酶K的量是变化的10倍。离心温度从20℃降低至4℃。增加蛋白酶K的量引起的产率（8.7％），也稍微提高了260/280和260/230比率均具有统计学显著下降。

乙醇沉淀（步骤5）的检测协议的最后阶段。糖原载体（0,8微升）的量是变化的，因为是总离心时间（5与30分钟^11）。只有离心时间显著影响产量，以290％的平均增幅。较长的自旋也减少了260/280比略（0.05）。在实验中观察到的糖原对产​​量无显著效果;虽然在这些提取的DNA的总量是足够大，使糖原通常不会被使用。尽管缺乏这些样品中的效果，但仍然建议使用糖原，以减少产量减少的危险，每当唾液输入体积比此处或如存在给定的低e是任何其它理由相信产量将是低的。

代表DNA样品的目视检查（ 图1）表明，该提取的DNA不大大分段为任何唾液DNA提取过程，而是表现出适当的高分子量带不表示降解的DNA的拖尾现象。经过RNA酶消化，该协议产生的1.74的平均260/280。

图唾液的DNA 1。质量。四种提取程序被应用到相同的唾液采集。 （一 ）样品进行电泳在0.8％琼脂糖凝胶（250 ng的DNA）。的唾液DNA提取协议的所有变化导致的高分子量（> 20 kb的）的DNA，没有证据退化。里:1的DNA laddeR，2＆3 Oragene小坑L2P协议样本，4＆5 Gentra PUREGENE体液协议，6＆7不用RNA去除步骤的优化的协议，8及9与RNA移除步骤的优化的协议。泳道2-7是直接在同一唾液样品类似的协议。泳道8和9表明，RNA去除步骤不引入DNA降解。 （B）的样品进行电泳在2％的琼脂糖凝胶（150毫微克DNA）。轻微的RNA峰是观察到的在泳道2中的凝胶，通过图7（约定如上述）的底部附近。泳道8和9示出的RNA去除步骤的有效性。

RNA的拆卸步骤（用RNA酶A步骤3）是DNA的准确定量的关键。在测试过程中，持续的高RNA含量观察到，如由双链DNA的RNA由量子比特2.0荧光测量的比率来确定。从样本平均，核酸含量无RNA酶A处理由46.6％（±​​0.4）RNA.样品将经历读为"<20毫微克/毫升的"，这是可能的最低读数的量子比特的RNA检测的RNA的去除步骤。

通过这种优化的协议获得的DNA是具有足够质量的高通量测序当附加的RNaseA步骤施加。为了实现定向重测序数据，自定义安捷伦SureSelect靶向序列富集试剂盒适用于24个样本，针对2.6 MB的顺序。高通量测序对每个通道的12条形码（索引）的样品进行的。顺序读取被BWA对齐到hg19参考基因组^12，用的是最好的做法很难过滤参数，然后进行应用GATK ^13个碱基的质量分数校准，插入缺失会师，重复拆卸，SNP发现和在所有24个样本同时进行基因分型值^14。所有24个样本产生高品质的农工商数据（ 表2）。的读取通过ILLUMina的标准过滤器和过Q> 20，91.4％相一致的序列富集靶区，提供> 30倍的覆盖范围平均在目标深度覆盖在Q> 100，以及在必要的限度罕见SNP发现每个样品中。普通股余额为49.9％。与Illumina公司的微阵列比较基因型变异的呼叫产生了98.9％的一致。

表1对数量/质量指标优化变量的大小，所有的影响大小都在列标题中列出的单位。 p值的方差分析:* P <0.05; ** P <0.01; *** P <.001; NS不显著

高通量的序列，从靶向序列捕获的表2，质量。

优化的协议表3的成本比较，从2毫升唾液与其他市售的协议中提取的DNA，一个所需的DNA提取LL试剂和耗材使用标准目录价格在互联网9月30日对被评估，2013年需要注意的是此协议是写从1.25毫升全唾液（提取的DNA 即 2.5唾液和缓冲液，参见步骤2.3），为这个值表示一半的唾液收集管中的总体积。对于成本比较，将2ml被选择，因为这是一个常见的​​市售试剂盒（Oragene）相关联的量。

表4食谱试剂。

本程序是一个优化的DNA提取的协议，已大大改善了高分子量DNA的产量相比，标准的方法，而不损害DNA的质量。与对产量的大部分影响最大的关键步骤是5.2步，其中包括在乙醇沉淀比任何出版协议审查这里，除了一个没有广泛分布¹¹较长的离心步骤。检测DNA的质量没有改变与该较长的离心关联，表明大部分从唾液采集的可用的DNA是不是退化和高的分子量。

唾液收集在样品质量的限制，例如为外国污染物的潜力，需要在采集阶段被最小化，并且过多的蛋白质的样品中的存在，可以是一个潜在的感染的迹象。大量的蛋白质或外国的污染物可以保留在最终提取的DNA，从而使定量准确。如果有剩余的蛋白或污染物后补液（步骤6）被怀疑，样品清理可以通过启动在蛋白质沉淀步骤以缩放，以反映样品输入量的试剂量来进行。协议的另一个限制是时间的长短来执行的步骤需要。多个样品可以并行地运行;然而，建议不超过24平行萃取同时运行。这是用于蛋白质沉淀步骤，其中所述样品必须保持冷，以确保紧密的颗粒和运行超过24个样品可以允许粒料时重新溶解尤为重要。

这里提出的方案是最经济有效的方法考虑（ 见表3）。而该协议不使用试剂从PUREGENE提取试剂盒，更小的体积比建议的PUREGENE协议用于不影响萃取效率，这是这种减少的试剂，其驱动节约成本相对于该协议。需要注意的是计算的费用提取使用的标价为每一个项目，并不能反映任何折扣。与优化的协议每提取成本可通过公司的销售代表进一步与大宗订单或折扣减少。

证据也被提供，该协议是适用于下一代测序使用。所获得的数据提供唾液样本进行人类遗传学研究许多疾病的效用，其中血液是不是经常用进一步的证据。而血液和细胞系的DNA仍是用于测试遗传物质的优选的来源，唾液的收集是一个可行的选择时，这样的源不可用，当患者人数会受他们的集合或放血不可用或不实际的。

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).