Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

Получение высокого качества ДНК для генетических исследований человека имеет важнейшее значение в процессе обнаружения гена болезни. Кровь, при том, что требует инвазивных процедур, а также быть более дорогим, чем сбора слюны, способствует для создания линии иммортализованных клеток в виде бесконечного источника ДНК, или токов для функциональных исследований, а иногда и ДНК в крови используется, когда клеточные линии не доступны. Однако получение кровь требует квалифицированного Phlebotomist и кровь имеет короткий период полураспада, чем слюны ^1. ДНК из слюны дешевле и легче получить, так как он может быть собран и отправлен по почте без необходимости Phlebotomist, тем самым увеличивая потенциальные бассейны, подлежащих далеко за пределы водосборного бассейна больниц и лабораторий ^2. Исследование учащихся может быть улучшена, если объекты имеют возможность давать образец слюны вместо крови ^{3, 4.} Опасения по поводу количества и качества ДНК из слюны, возможно, ограничивается его широкое насэ несмотря на многочисленные исследования последних исследований, показывающих, пригодность всей слюны, в среднем 4,3 х 10 ⁵ клеток на миллилитр, для анализа ДНК за старые методы буккальные тампоны, которые не получить значительное количество слюны ^{2, 3, 4, 5, 6.} Пока скромный литература существует показывая пригодность всей слюны, полученной ДНК для генотипирования приложений, включая микрочипов на основе методов ^{8, 9, 10,} никакие исследования не рассматриваются следующего поколения секвенирования (NGS). Цель оптимизации всю эту протокола экстракции слюны ДНК была максимально количество и качество для генетики приложений в экономически эффективным образом, что легко реализуется в лабораториях с обычных реагентов и расходных материалов.

Выделение ДНК из слюны требуется несколько процедур: 1) сбор и хранение, 2) лизис клеток, 3) лечение РНКазы, 4) осаждение белка, 5) осаждение этанолом, 6) регидратации ДНК. Раствор ДНК стабилизации буфера, описанныеранее ^2, функции адекватно без изменения. Не было сделано никаких попыток оптимизировать лечение РНКазы и шаги ДНК регидратации. Для каждого из оставшихся шагов, были выявлены несколько переменных, которые могут повлиять выход. Каждая переменная манипулировали индивидуально и улучшение урожайности и качества оценивали статистически. Для переменных, которые были показаны для повышения урожайности и / или качество ДНК, оптимальные значения были включены в итоговый протокол.

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем предоставить образцы слюны все пациенты подписали информированное согласие, соответствующую принципов для лечения человека предметов в Национальной детской больницы.

1 Слюна Сбор и хранение

1. До сбора слюны, убедитесь, что рот субъекта свободен от пищи или других посторонних веществ, имея предметом промыть рот водой и избегая еды или питья в течение 30 мин перед сбором.
2. Откройте 15 мл центрифужную пробирку с 2,5 мл ДНК стабилизации буфера ^2, убедившись, чтобы не касаться внутренней части крышки или трубки, и есть предметом плевать 2,5 мл слюны в буферный раствор. Примечание: Сбор более 2,5 мл слюны может привести к деградации образца от недостаточного соотношения образца буфера стабилизации ДНК. Сбор слишком мало слюны уменьшит ожидаемые урожаи из протокола. Для оценки объемов сбора, используйте цифровые градиенты на стороне тон трубку.
3. Замените крышку и перемешать с помощью инверсии, пока смесь не гомогенизируют. Энергичные сотрясения нет необходимости. Храните образцы при комнатной температуре в течение кратковременного хранения или 4 ° С в течение длительного хранения (> 3 месяцев).

2. Исходные Препараты и лизиса клеток

1. Перед началом добычи, нагреть на водяной бане до 37 ° С, и подготовить ведро со льдом. Три 15 мл конические центрифуги трубы будут необходимы для каждого извлеченного образца. Три трубки будет использоваться для хранения клеток и белка гранул, окончательный извлеченный гДНК, и изопропанол и этанол супернатантов.
2. Получить образцы из хранилища, и образцы инвертировать несколько раз затем вихрь на средней скорости в течение 15 сек.
3. Разлить 2,5 мл образца в чистую 15 мл центрифужную пробирку и добавьте 5 мл клеточного лизиса решения. Смешайте образца 50 раз по инверсии, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.

3 РНК удаления

1. Добавить 40 мкл РНКазы А-Сольution при 100 мг / мл, и инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин.
2. Извлеките образец из С на водяной бане в 37 ° и охладили на льду в течение 3 мин.
   1. После инкубации РНКазы А, увеличить температуру в водяной бане до 65 ° С для регидратации ДНК шага протокола.

4 белков и липидов удаления

1. Добавить 50 мкл протеиназы К раствору при 20 мг / мл, смешивают несколько раз путем инверсии, и инкубируют при комнатной температуре в течение как минимум 30 мин. Примечание: Это возможно точка паузы для протокола. После добавления раствора протеиназы К, образец можно хранить при температуре 4 ° С до тех пор, извлечение не может быть завершен. Хранение при 4 ° С в течение до 24 часов не было показано, что значительное влияние на доходность добычи или качеством ДНК. Длительное хранение на данном этапе не была оценена.
2. Добавить 1,7 мл Белок осадков решения, вихрь энергично в течение 20 сек на высокой скорости, и место на льду в течение 10 мин.
3. После того, как образцы были охлаждали на льду в течение 10 мин, центрифугируют в течение 10 мин при 3000 х г и 4 ° C. Осажденные белки должны составлять плотный осадок, чтобы продолжить. Если гранулы не плотно, или раствор все еще Ясно, образцы могут быть охлаждали на льду в течение 5 мин и более центрифугирования повторили. Образцы должны храниться на льду, убедившись в надежности осадок.

5 Выделение и очистка гДНК

1. В чистую 15 мл центрифужную пробирку, пипетки 5 мл изопропанола и 8 мкл гликогена чистого раствора при 20 мг / мл.
2. Налейте супернатант, содержащий гДНК с шага 4,3 в пробирку, содержащую изопропанол и гликогена решение, оставив осажденного белка гранул. После того, как супернатант был добавлен, осторожно перемешать образца в 50 раз от инверсии и центрифуги в течение 30 мин при 3000 х г и 4 ° C.
3. Налейте супернатант медленно в чистую пробирку на 15 мл. После удаления надосадочной жидкости, добавляют 1 мл 70% этанола, чтобыВымойте гранул, медленно покачиваясь и нежно перемещая этанола над осажденной гранул несколько раз. Сохранить этанола в трубке.
4. После начальной промывки образец центрифугировать в течение 1 мин при 2000 х г и 20 ° С. Этот шаг центрифугирования может быть сделано в любом 4 ° С или 20 ° С. Никакого значительного влияния температуры не было показано на этом шаге.
5. После первоначального стирки и центрифугирования осадка, постепенно влить этанола мыть из трубки и выбросить, а затем выполните вторую мытье, повторяя шаги 5,3 и 5,4.
6. После удаления надосадочной жидкости от второго мытья, чтобы осадок высохнуть на воздухе в течение 15 мин.
   1. Если образец не полностью высушивают, сухой воздух еще 15 мин.

6 Регидратация гДНК

1. После того, как образец сушат, добавляют 300 мкл Трис-ЭДТА увлажняет высушенного осадка гДНК.
2. Vortex образец в течение 5 сек при средней скорости и места в65 ° С горячей водяной бане в течение 1 часа.
3. Удалить образцы из водяной бани и инкубировать O / N при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все продукты и реагенты, используемые перечислены в таблице материалов, а также Таблица 4.

Для определения оптимальных параметров для ДНК экстракцию серия парных извлечения ДНК. Один образец слюны был разделен, и каждая часть проверены с одним из двух возможных значений для данной переменной. Проводились по меньшей мере восемь повторов каждого парного теста (например, один образец слюны на аликвоты для проверки добычу, так и без первоначального 50 ° C инкубации). Оптимизация была основана на четырех стандартных метрик: Общий выход ДНК, стоимостью 260/280, 260/230 стоимости, и визуальный осмотр электрофорез ДНК для оценки фрагментации. Не все возможные комбинации переменных оценивались статистических взаимосвязей (N = 169 комбинаций), а вместо этого оценить предельный эффект каждой переменной в отдельности. Эффекты были протестированы с использованием многоходовой повторных измерений ANOVA и предполагаемое воздействие были получены из эквивалентному уравнению регрессии. Все существенные эффекты приведены в таблице 1, показаны в виде СрИзменение возраст с выходом (нг / мкл на мл вход слюны) или качество ДНК (260/280 и 260/230).

Лизис клеток (стадия 2) была оптимизирована путем оценки: 1) наличие / отсутствие 50 ° C инкубации (1 час) до лизису клетки, чтобы гарантировать, что деградация протеиназы К и лизис клеток при посредничестве буфера для хранения пошел к завершению, 2 ) наличие / отсутствие гомогенизации встряхиванием шаг (средняя скорость, 15 сек), и 3) Время лизиса решение Инкубационный (5 против 30 мин). Лизис клеток Инкубационный 30 мин увеличилась урожайность в среднем на 3,5% (р <0,01), но ни одна другая переменная лизис клеток не оказала значительное влияние на урожай. Встряхиванием уменьшилось соотношение 260/280 на статистически значимую (р <0,001), но практически маленький 0,03.

Белок осадков (этап 4) предшествует протеиназы К пищеварения, чтобы разрушить цепи аминокислот, повышение эффективности осаждения белка и освобождение захвачен ДНК. Количество протеиназы К была разнообразной в десять раз.Температура Центрифугирование была снижена с 20 ° С до +4 ° С. Увеличение количества протеиназы К вызвало статистически значимое снижение урожайности (8,7%), а также несколько улучшенных обоих соотношений 260/280 и 260/230.

Этанол осадков (шаг 5) был последним этапом протокола рассматривается. Количество гликогена носителем (0, 8 мкл) был различен, как и общее время центрифугирования (5 против 30 мин ^11). Только время центрифугирования значительно влияет доходность, со средним увеличением 290%. Чем дольше спин также снижало показатель 260/280 незначительно (0,05). Не наблюдалось существенное влияние гликогена на выход во время экспериментов; при том, что общее количество ДНК в этих экстракций был достаточно большим, что гликоген не будет, как правило, быть использован. Несмотря на отсутствие эффекта в этих образцах, он по-прежнему рекомендуем использовать гликоген, чтобы минимизировать риск снижению урожайности, когда объем ввода слюна ниже приведены здесь или если Therе любой другой причины полагать, доходность будет низкой.

Визуальный осмотр представительных образцов ДНК (Рисунок 1) показал, что извлеченный ДНК не была сильно фрагментирована для любой процедуры экстракции слюны ДНК, а показал соответствующую высокую молекулярную группу веса без размытия индикативного деградированных ДНК. После РНКазы A пищеварения, протокол производится средний 260/280 1,74.

Рисунок 1. Качество слюны, полученной ДНК. Четыре процедуры извлечения были применены к той же коллекции слюны. (A) Образцы подвергали электрофорезу на 0,8% агарозном геле (250 нг ДНК). Все вариации протоколов добычи слюны ДНК приводят к высоким молекулярным весом (> 20 кб) ДНК, без признаков деградации. Lane: 1 ladde ДНКг, 2 и 3 пробы Oragene prepIT L2P протокола, 4 и 5 Gentra Puregene биологическими жидкостями протокола, 6 и 7 оптимизированный протокол без стадии удаления РНК, 8 и 9 оптимизирован протокол с шагом РНК удалить. Дорожки 2-7 непосредственно аналогичные протоколы на тех же образцах слюны. Дорожки 8 & 9 показывают, что стадия удаления РНК не приводят к снижению ДНК. (B) Образцы подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле (150 нг ДНК). Небольшое пик РНК наблюдается в нижней части геля в полос 2 через 7 (конвенций, как указано выше). Дорожки 8 & 9 показать эффективность стадии удаления РНК.

Удаление РНК (стадия 3 РНКазой А) имеет решающее значение для точного количественного определения ДНК. Во время тестирования, стабильно высокое содержание РНК наблюдали, как определено по соотношению двухцепочечной ДНК в РНК, измеренной Кубит 2,0 флуорометре. В среднем, содержание нуклеиновых кислот из образцов без РНКазы лечение состояло из 46,6% (± 0,4) RNA. Образцы, прошедшие в РНК Removal Шаг читать как "<20 нг / мл", что является самым низким возможным чтение для обнаружения РНК кубита в.

ДНК, полученную через этот оптимизированного протокола было достаточного качества для высокой пропускной последовательности, когда дополнительная РНКазы шаг был применен. Для достижения целевых данные повторного упорядочения, обычай комплект Agilent SureSelect Целевая Обогащение была применена к 24 образцов, ориентированных 2,6 Мб последовательности. Высокая пропускная секвенирование проводили на 12 штрих (индексированных) образцов на одну полосу движения. Последовательность читает были BWA-выравниваются по эталонному hg19 генома ^12, то применение GATK ¹³ база показатель качества калибровки, INDEL перестройки, удаление дубликатов, SNP открытия и генотипирования одновременно во всех 24 образцов проводили с использованием лучший параметр практика трудно фильтрации значения ^14. Все 24 образцов дало высокого качества NGS данных (Таблица 2). Из чтения, что прошло IlluМины стандартные фильтры и имел Q> 20, 91,4% выравнивается целевых регионах по обогащению последовательность, обеспечивая среднюю на-мишени глубину охвата> 30x покрытия на Q> 100, а в необходимых пределах для редкого открытия SNP в каждом образце. Средний остаток нити составила 49,9%. Сравнивая вариант звонки с Illumina микрочипов генотипов дали согласование 98,9%.

Таблица 1 Влияние Размер оптимизированного переменной от количества / параметров качества. Все размеры эффекта в единицах, перечисленных в заголовке столбца. р-значения за ANOVA: * р <0,05; ** Р <0,01; *** Р <0,001; нс не имеет существенного значения

Таблица 2 Качество высокой пропускной последовательности от Target обогащения.

Таблица 3 Сравнение Стоимость оптимизированного протокола для извлечения ДНК из 2 мл цельной слюны с другими коммерчески доступных протоколов.LL реагенты и расходные материалы, необходимые для выделения ДНК были оценены с использованием стандартных цен список доступных в Интернете по состоянию на 30 сентября 2013 года Обратите внимание, что этот протокол написано извлечь ДНК из 1,25 мл цельной слюны (т.е. 2,5 мл слюны и буфера см шаг 2,3), поскольку это значение представляет половину от общего объема в области сбора слюны трубки. Для сравнения затрат, 2 мл была выбрана, поскольку это количество, связанный с общим коммерчески доступного набора (Oragene).

Таблица 4 Рецепты для реагентов.

Настоящая процедура оптимизирована протокол выделения ДНК, что значительно улучшилась урожайность высокомолекулярной ДНК веса по сравнению со стандартными методами, без ущерба для качества ДНК. Решающим шагом с самым большим влиянием на выход большей была шагом 5.2, которая включает в себя более длительный этап центрифугирования при осаждением этанолом, чем любой опубликованной протокола в данном обзоре, за исключением одного, который не был широко распространен ^11. Никаких изменений в качестве ДНК, связанные с этим длительного центрифугирования не были обнаружены, что указывает на большую часть доступной ДНК из всей сбора слюны не ухудшается, и с высокой молекулярной массой.

Вся коллекция слюна имеет ограничения по качеству образца, так как потенциал для иностранных загрязняющих веществ, которое должно быть сведено к минимуму на этапе сбора и наличием избыточного белка в образце, который может быть признаком основного инфекции. Большое количество белка или иностранных загрязняющих веществ можетостаются в конечном экстрагированной ДНК в результате чего количественное неточными. Если есть остаточные примеси белков или после регидратации (шаг 6) подозревают, образец очистки может быть выполнена, начиная с этапа осаждения белка с объемов реагентов масштабированных чтобы отразить объем ввода образца. Другим ограничением протокола является время, необходимое для выполнения этапов. Несколько образцов может работать параллельно; Тем не менее, рекомендуется, чтобы не более 24 параллельных экстракции не будет работать одновременно. Это особенно важно для осаждения белка этапе, когда образец должен оставаться холодным, чтобы обеспечить плотный осадок и работает более 24 образцов может позволить гранул времени, чтобы повторно растворить.

Протокол, представленные здесь является наиболее экономически эффективным методом считается (таблица 3). В то время как этот протокол делает использовать реагенты из набора для экстракции Puregene, меньший объем, чем рекомендовано в протоколе Puregene используетсябез ущерба для урожайности экстракции и именно это сокращение реагентов, что приводит в экономию по сравнению с протоколом. Обратите внимание, что расчетная стоимость для извлечения использует цену список для каждого элемента и не отражает никаких скидок. Стоимость за добычу с оптимизированного протокола может быть уменьшен с оптовых заказов или скидки через торговых представителей компании.

Доказательства также при условии, что этот протокол является подходящим для использования с следующего поколения секвенирования. Полученные данные предоставляет дополнительные доказательства полезности слюны для исследования генетики человека в многих заболеваний, где кровь не всегда возможно. В то время как кровь и клеточная линия получена ДНК продолжает быть предпочтительным источником генетического материала для тестирования, вся коллекция слюна является хорошей альтернативой, когда такие источники не доступны, когда зачисление пациент зависит от их сбора или кровопускания не доступен или нецелесообразно.

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).