Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Yaşayan bir organizma hedef bileşiklerin fotoaktivasyon gibi, embriyonik gelişim, hücresel sinyal ve yetişkin fizyoloji gibi çeşitli biyolojik süreçleri araştırmak için değerli bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Bu bağlamda, multi-foton mikroskopi kullanımı, tek bir hücrenin çözünürlükte derin dokularda belirli bir ışık duyarlı ajan kantitatif fotoaktivasyon sağlar. Zebra balığı embriyolar optik şeffaf olduğu için, onların gelişimi in vivo olarak izlenebilir. Bu özellikler zebrafish odaklı ışığı ile kimyasal ajanlar ve proteinlerin çeşitli aktivite kontrol etmek için mükemmel bir model organizma. Burada biz, bizi, canlı zebrafish embriyolarının hücrenin kaderini takip kimyasal kafesli floresein aktivasyonu ikna etmek için iki-foton mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz, herhangi bir ilgi hücreleri bulmak ve hassas hedef canlı genetik bir dönüm noktası (GFP) ifade embriyolar kullanın. Bu prosedür, aynı şekilde, proteinleri, hormonlar, küçük moleküller ve diğer kafesli bileşikler hassas ışık kaynaklı aktivasyonu için kullanılabilir.

Biz kafesli floresein kullanarak hücre etiketleme bir protokol tanımlayan, ancak diğer fotoğraf devreye sokulabilir boyalar ve proteinlerin aynı şekilde kullanılan olabilir.

1. Kafesli Floresein enjeksiyon

1. Dextran-konjuge 4,5-dimetoksi 2-nitrobenzyl floresein (DMNB) (10.000 MW dekstran, anyonik, Invitrogen, moleküler problar, Carlsbad, CA kafesli% 5 stok solüsyonu hazırlayın (5mg kafesli floresein / 100 mcL 0,2 M KCl) , kedi yok. D-3310). -20 ° C'de kısım ve mağaza DMNB-kafesli floresein ışığa duyarlı ve karanlıkta tutulması gerektiğini unutmayın.
2. "Zebra balığı kitap" ¹ açıklandığı gibi% 1 agaroz (Sigma, St Louis, MO, kedi hayır. A9539) yapılan bir enjeksiyon çukur hazırlayın.
3. 100 x E3 stok solüsyonu seyreltilmesi ile 2 litre E3 ortamı hazırlayın.
4. Enjeksiyondan önce akşam, erkek (ler) fotoaktivasyon için hedef hücrelerinin lokalize için kullanılan bir görünür floresan dönüm noktası (GFP, RFP vb.) Ifade istenilen transgenik çizgi kadın (lar) dan ayıran çiftleşme kafesleri hazırlamak.
5. Mikropipet çektirmesi (Sutter Enstrüman, Novato, CA, P-97) kullanarak kılcal enjeksiyon iğneleri (filamanlı İnce Duvar Cam kılcal, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, kedi hayır. TW100F-6) hazırlayın.
6. Floresein kafesli buz üzerinde% 5 bir kısım çözülme.
7. 0,2 M KCl% 5 kafesli floresein stok çözelti% 1'lik bir nihai konsantrasyonu azaltır ve buz üzerinde tutmak. Işığa maruz kaçının.
8. Kurulum çiftleşme 4. adımda hazırlanan geçer.
9. Döllenmiş yumurtalar kısa sürede belirtilen olarak toplayın. Orient agaroz enjeksiyon kalıp tek hücreli dönem embriyoların E3 ¹ ile kaplanmış.
10. Microloader ucu (Eppendorf, Hamburg, Almanya, kedi.. 5242 956,003) dolgu ~ 1% 1 kafesli floresein çözüm mcL bir enjeksiyon iğnesinin kullanılması.
11. Gazla çalışan bir mikroenjektör (pnömatik picopump, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, PV820) bağlı bir mikromanipülatör içine yerleştirin iğne yüklenir
12. 2-3nl enjeksiyon hacmi ayarlayın ve kafesli floresein doğrudan hücre sitoplazma içine enjekte edilir. Deneme başına 50 embriyoların en az enjekte edilir.
13. 28.5 karanlıkta embriyolar inkübe ° C istenen gelişimsel aşamada E3. Eğer 24 saat sonra döllenme daha büyük embriyolar analiz edilir, pigmentasyon inhibe etmek için% 0.1 (PTU, Sigma, St Louis, MO, kedi hayır. 22.290-9) phenylthiourea ekleyin.

2. Embriyo Montaj

1. (4 ° C'de bir hafta saklanabilir çözümler parçası) taze E2 çözüm hazırlayın.
2. E2 ortamda çözünmüş 1% agaroz ince bir tabaka ile kaplayın 60 mm Petri kapları.
3. % 2 düşük erime noktası agaroz (Ultra Saf LMP agaroz, Invitrogen, Carlsbad, CA, kedi hayır 16.520.100) gömme hazırlayın: agaroz steril çift distile su kaynayana kadar mikrodalga ısıtma çözülür. Isıtma sırasında tüp kılıfı açık tutun. Kısım mikrosantrifüj tüpler içine 1 ml ve 72 ısıtma bloğu ° C
4. Embriyoların chorions hafifçe keskin forseps (5) sayılı dışında koryon çekerek çıkarın. (Bkz: adım 2) agar-kaplı çanak E2 çözüm embriyoların tutun. Polipropilen pipetler yapışabilir Dechorionated embriyolar yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti ile ele alınmalıdır. Bu embriyolar sıvı yüzey gerilimi tarafından hasar görmüş olabilir gibi hava dechorionized embriyo açığa kaçının.
5. E2 küçük hacimli bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak seçili embriyo toplayın, ve 60 mm Petri kabında embriyo. Mount embriyo yanında bir damla% 2'lik agaroz (~ 150 mcL) (3. aşama). Hızla iki damla karıştırın ve homojen bir final ~% 1 agaroz karışımı elde etmek için embriyonun dorsal yüzü objektif lens bakan bir diseksiyon mikroskobu şark kullanarak.
6. Agaroz katılaşmış kadar bekleyin ve gömülü embriyo sıvı batık kadar E2 orta ekleyin. Bu fotoaktivasyon işleminden sonra agaroz serbest olarak çanak başına tek embriyo elde etmek için tercih edilir.

3. Fotoaktivasyon

1. Biz bir Zeiss LSM 510 META NLO iki foton, ayarlanabilir bir geniş bant (700-1020nm) Spectraphysics den Mai Tai-HP-femtosecond lazer ile donatılmış mikroskop kullanın.
2. Üzerine monte edilmiş bir embriyo mikroskop altında bir plaka sahibi yerleştirin. Embriyo floresan dönüm noktası 40x/0.8W Achroplan su kullanarak hedefi dalmış görüntülenmiştir. 500-550nm bant geçiren filtre (BP) ile non-descanned dedektörü (NDD) aşağıdaki adımları izleyin.
3. Fotoaktivasyon süreci için bir ön koşul olarak, en ventral görüntü serisi 860nm iki foton lazer dalga boyu (GFP algılama) ile tespit floresan sinyal dorsal parçası satın alarak ilgi bölgenin mekansal floresan bilgi edinin. Bu amaçla, yeterli çözünürlük elde edilen her bir odak düzlemi arasındaki 6μm bir yayılma kullanılarak elde edilebilir.
4. Hedef seçinfotoaktivasyon için z-düzlemi ve bu bölgede odak noktası haline getirmek. Deneyin amacı bağlı olarak, faiz bölge GFP görünür dönüm içinde veya dışında da olabilir. Bu z-düzleminde tek bir görüntü çekin. Görüntü kaydetme ve ayrı bir pencerede açık tutmak.
5. 720nm iki foton lazer dalga boyu ayarlama ve lazer 'Düzenle çamaşır suyu' menüsünden açmak mod-kilitli olduğu zaman. 'Tanımlama Bölgesi' menüsünü kullanarak 860nm (Adım 4) alınan görüntü göre fotoaktivasyon ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın. Bu, ikinci eylem, x, y konumları gözlenen alan değişiklikleri gibi lazer dalga boyu 720nm değişen sonra bu resmin üzerine ROI seçmek için çok önemlidir.
6. (Bkz: adım 9) 'Düzenle çamaşır suyu' menüsünden fotoaktivasyon için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: a) göreceli lazer güç; b) iterasyon sayısını, c) tarama hızı.
7. Basın 'Düzenle çamaşır suyu' penceresi 'Bleach' ve lazer durana kadar bekleyin.
8. 860nm için geri dönün, çıkan photoactivated malzeme ve görüntü elde aktive etki Z-a (kalınlık) değerlendirmek için ikinci bir dizi yoğunluğunu değerlendirmek için bir tek düzlem görüntü kazanır.
9. Fotoaktivasyon için aşağıdaki parametreler göz önünde bulundurun:
   1. Lazer yoğunluğu ve fotoaktivasyon süresi: Bir ampirik olarak değişen iki parametre tarafından fotoaktivasyon için en uygun koşulların belirlenmesi gerekir. Acousto-Optik Modülatör (AOM) iletim göreceli lazer güç tarafından kontrol edilebilir. Fotoaktivasyon süresi tekrarlamalar ve tarama hızı sayısının bir fonksiyonudur.
   2. Uncaged floresan doygunluk önlemek için floresan doğrusal aralığı belirleyin.
   3. Uncaged moleküllerin elde edilen floresan ve photoactivated ^klon 2 z ekseni bir sürede arasında doğrusal bir korelasyon vardır.

4. Uncaged Floresein Tespiti

1. Fotoaktivasyon sonra karanlıkta embriyolar yükseltmek, 28.5 ° C E2 orta deri pigmentasyonu görünümünü önlemek için% 0.1 PTU içeren.
2. Diseksiyon mikroskop altında agaroz istenilen gelişimsel aşamada, embriyo çıkarın. Sivri uçlu bir bistüri kullanarak, "V" embriyonun kafası dönük böylece embriyo yakın agaroz "V" şeklinde kesi oluşturmak. "V" embriyo başkanı yakın noktada kapalı bir pens yerleştirin ve hafifçe embriyo uzunluğu boyunca agaroz ayıran ve ortama embriyo serbest forseps açık itin.
3. Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile embriyoların toplayın ve paraformaldehid (PFA;% 4 1 x PBS, pH 7.2) ile düzeltmek oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C
4. Fiksatif çözüm çıkartın ve oda sıcaklığında en az 5 dakika PBST 2-3 kez yıkayın.
5. Taze metanol ve -20 ° C'de inkübe ile doldurmak, en az 2 saat, 10 dakika süreyle% 100 metanol ile embriyolar yıkayın.
6. % 80,% 60,% 40 ve% 20: PBSTr seyreltilmiş metanol bir dizi ardışık inkubasyon (5 dk) embriyolar rehidrate. PBSTr 2 x 10 dakika yıkayın.
7. 500 mcL Engelleme çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Çözüm Engelleme 1:500 sulandırılmış bir anti-Floresein alkalen fosfataz (AP) Fab parçaları (Roche, Palo Alto, CA, kedi.. 11426338910) ekleyin ve 4 gece boyunca inkübe ° C (kendi tarafta yer mikrosantrifüj tüpleri) .
9. PBST 5 x 15 dakika yıkayın.
10. TNT, 0,2 M NaCl 5 dakika yıkayınız.
11. TNT 0.4M NaCl içinde 5 dakika boyunca yıkayın.
12. Prestain çözüm taze hazırlanmış 3 x 5 dakika dengelenmesi.
13. Hızlı Kırmızı tablet (Roche, Palo Alto, CA, kedi no 11496549001), 2 mL Prestain çözelti içinde eritin. Un çözünmüş parçacıklar atlamak için Whatman No 2 kağıt kullanarak çözüm filtre tavsiye edilir. Alternatif olarak, çözüm aşağı spin ve net süpernatant sıvı kullanın.
14. 500 mcL Hızlı Kırmızı oda sıcaklığında karanlıkta inkübe her tüp çözüm, ve monitör renk gelişimi istenilen sinyal-zemin oranı (birkaç saat 20 dakika) ulaşana kadar ekleyin. Eğer arka plan geliştirir, 4 transfer ° C. Inkübasyon bir saat sonra, yeni bir Hızlı Kırmızı boyama solüsyonu ile doldurun.
15. 3 x 5 dakika boyama tepki Dur PBST yıkar.
16. 20 dakika oda sıcaklığında% 4 PFA saptamak için.
17. PBST 2 x 5 dakika yıkayınız.
18. Embriyolar kadar% 25,% 50 ve PBS içinde% 75 gliserol ile net embriyoların tüpün alt kısmında yerleşmiş. Embriyolar birkaç gün süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

5. Uncaged Alanı Floresan Görselleştirme

1. Montaj için bir mikroskop lamı hazırlayın: 1 ml şırınga kullanarak birbirinden ~ 15mm bir mesafe yerleştirilen dört slaytta açık silikon gres lekeleri, uygulamak. Cente Mount embriyor ~% 75 gliserol ve yeri bir lamel (no. 0; 18x18mm) 200 mcL üst ve silikon karşı gliserol çözüm slaytlar arasındaki yüzey kaplar kadar yavaşça itin.
2. Sahneye monte embriyo yerleştirin ve 40x objektif kullanarak odak noktası haline getirmek. 488nm Argon ve uyarma kaynağı olarak 543nm HeNe lazerler kullanarak görüntüleri konfokal Z-serisi edinin.
3. Photoactivatated etki z ekseni a Uncaged embriyo bir görüntü analiz yazılımı kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak analiz edilebilir.

6. Çözümler

7. Temsilcisi Sonuçlar

Yaşayan bir zebrafish embriyo ajanlar photoactivate iki foton mikroskopi bir örnek sunulmaktadır. Daha önce de benzer bir yaklaşım kullanarak zebrafish beyin ^2,3 photoactivated etiketli sinir atalarıdır soy izlenmektedir. : GFP muhabiri transgen, canlı içsel bir dönüm noktası olarak görev yaptı: Şekil 1 neurog1 taşıyan zebrafish embriyoların anterior sinir plaka kafesli floresein konjuge tracer boya fotoaktivasyon gösterir.

Embriyolar, bir hücre aşamada kafesli floresein enjekte ve tomurcuk aşamasında agaroz gömülü. 3 - 5 hücre gruplarının sahne uzamsal koordinatlarını neurog1 ölçüldü: GFP transgenik embriyo uncaging (Şekil 1A, A ') için ilgi bölgesi (ROI) belirlemek için. Biz nöral plaka belirli bir etki alanı (Şekil 1B, B ') floresein soy tracer Uncaged. Daha sonra, bu nöral progenitör etiketli subdomain kaderi Uncaged floresein (Şekil 1C, C ') immün prim5 (24 saat sonra döllenme) aşamasında tespit edildi.

Iki foton lazer uncaging ölçüde, yani Uncaged floresan ve photoactivated etki alanı (z a) kalınlığı yoğunluğu iki parametre ayarlayarak kontrol edilebilir: lazer yoğunluğu ve süresi. Ikinci iterasyon sayısı ve tarama hızının ayarlanması ile kontrol edilebilir (Russek-Blum, 2009, bölüm 3, adım 9 bakınız). Şekil 1'de gösterilen örnekte, biz% 12 AOM iletim 25.6 μsec / piksel göreceli lazer gücü, 20 tekrarlamalar ve tarama hızı kullanılır. Bu ayarları kullanarak 9-10 hücreleri ve 30μm photoactivated z-a (~ 1-2 hücre satır) içeren bir yatırım getirisi olarak nitelendirdi.

Şekil 1, iki-foton mikroskopi kullanılarak canlı zebrafish embriyo kafesli floresein fotoaktivasyon Temsilcisi sonucu .

Şematik gösterimi (AC) ve fotoaktivasyon süreci temsilcisi görüntüleri (A'C '). 1 hücre aşamada kafesli floresein tracer boya enjekte edildi: (GFP: neurog1) Zebra balığı embriyo (A, A ') neurogenin-1 organizatörü kontrolü altında ifade GFP yaşayın. 3-5 - hücre gruplarının sahne, ön beyin primordium (diensefalon) ayrı bir alan photoactivated ve Uncaged floresein tracer boya (B, B ') tespit edilebilir. Fotoaktivasyon prosedürü takiben, embriyo ° C ve Uncaged floresein içeren beyin hücrelerinin 24 saat sonra döllenme (C, C 'hpf) anti-Floresein immün tarafından takip 28.5 inkübe edildi. Dien, Diencephalon; Telefon, Telencephalon.

Foto-aktive bileşikler fonksiyonu moleküllerin biyolojik ya da kimyasal olarak aktif bir devlet haline dönüştüren bir fotokimyasal reaksiyon inducing (genellikle UV), belirli bir dalga boyu ile aydınlatılmış kadar maskeli moleküllerdir. Aktivasyon ışığa maruz kaldıkları sınırlayarak tam zamansal ve mekansal olarak kontrol edilebilir beri bu probları, hücre biyolojisi araştırmalarında çok güçlü araçlar sunuyoruz.

Çok foton mikroskopi önemli bir avantaj, nispeten derin bir optik penetrasyon ve azaltılmış nonspesifik fototoksisite. Aktivasyon işleminin yapılabilmesi için, iki düşük enerjili fotonlar aynı zamanda fotoğraf devreye sokulabilir bileşik tarafından absorbe edilmesi gerekir. Böyle bir olayın olasılığı foton yoğunluğuna bağlı olduğundan, aktivasyon odak düzlemi ile sınırlı kalır. Aktivasyon bölge bu nedenle seçici doku içinde tanımlı ses manipüle edilebilir.

Biz, canlı zebrafish embriyoları iki foton mikroskopi kullanılarak kafesli flöresein fotoaktivasyon için bir protokol sunuyoruz. Spesifik bir örnek olarak erken embriyonik aşamada hücreler işareti ve sonrasında, gelişmekte olan zebrafish beyinde etiketli hücrelerinin soy izleme amacıyla kafesli-floresein fotoliz ikna etmek için iki-foton mikroskobu kullanan Burada gösterilen. Fotoaktivasyon kıyasla iki foton tabanlı fotoaktivasyon z ekseni ^4,5 hücreleri ve çözünürlük eksikliği birkaç on izleme boya aktivasyon sonuçları lazer ve flaş lambası, mekansal çözünürlükte ulaşabilirsiniz bir proksimale 01:59 hücre satır ^2,3 aksiyel çözünürlük elde etmek birkaç mikrometre .

Prosedürü burada canlı örneklerin tek bir hücre çözünürlükte bileşiklerin çeşitli aktivasyonu için kullanılabilir. Örneğin, yeşil kırmızı fluorescenct protein ^6,7 Fotoçevrim Kaede protein aynı etiket hücreleri olabilir. Nöronal aktivitenin ⁸ ve ⁹ ışık ışınlama bağlı hücre ölümüne neden olur KillerRed photosensitizers modüle ışık kapılı iyon kanalı, Channelrhodopsin, uygulanabilir diğer ışık ile aktive olan protein içermektedir.

Kafesli moleküllerin çeşitli fizyolojik süreçleri, ekstrasellüler ve intrasellüler ^bileşikler 10 manipülasyonu modülasyonu sağlayan bildirilmiştir . Bu, aktif nörotransmitterlerin (örneğin, glutamat ^11,12) ve ikinci haberciler (örneğin kalsiyum ¹³⁾ ve steroid hormonlar (örneğin, retinoik asit ¹⁴⁾ içerir. Son olarak, zebrafish gen aktivasyon ve sessizliğini fotoğraf aracılı kontrol getirilmiştir. Kafesli antisens oligonükleotidler (morpholinos) ve RNA'lar iki foton tabanlı fotoaktivasyon canlı zebrafish embriyo ^15,16 sınırlı hücre popülasyonunun gen demonte ve fonksiyon-kazanç için kullanılabilir.

Özetle, canlı zebrafish embriyolarında iki foton tabanlı foto-aktivasyon: 1) x, y, z eksenleri boyunca iki hücre satır için hassas bir arada. 2) Kantitatif fotoaktivasyon ölçüde kontrol edilebilir. 3) Çok yönlü fotoğraf konvertibl proteinler çeşitli uygulanabilir.

Uwe Strahle ve nazik neurogenin1 muhabir hattı sağlamak için; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz ve teknik danışmanlık ve yardım için iki foton uncaging ile Leonid Roitman;; Maayan Tahor ve teknik yardım için Suliman Elsadin sayesinde şekil grafik genia Brodsky nedeniyle Bu yazının yorumları için Amos Gutnick. İsrail Bilim Vakfı (hibe sayısı 928/08) ve Harriet & Marcel Dekker Vakfı; Levkowitz laboratuarında araştırma Alman-İsrail Vakfı (hibe sayısı 183/2007) tarafından desteklenmektedir. GL Biyomedikal Araştırma Tauro Kariyer Geliştirme Başkanı bir görevdeki.