Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Fotoativação de compostos alvo em um organismo vivo tem se mostrado uma abordagem valiosa para investigar vários processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, sinalização celular e fisiologia adulta. A este respeito, o uso de microscopia multi-fotão permite fotoativação quantitativa de um determinado agente luz responsivo em tecidos profundos em uma resolução única célula. Como embriões zebrafish são opticamente transparentes, o seu desenvolvimento podem ser monitorados in vivo. Essas características tornam o zebrafish um organismo modelo perfeito para controlar a atividade de uma variedade de agentes químicos e proteínas pela luz concentrada. Aqui nós descrevemos o uso de microscopia de dois fótons de induzir a ativação de fluoresceína quimicamente enjaulado, que por sua vez, permite-nos a seguir o destino de células em embriões vivos zebrafish. Nós usamos embriões expressando um marco vivo genética (GFP) para localizar e precisamente alvo as células de interesse. Este procedimento pode ser igualmente utilizado para a ativação induzida luz precisa de proteínas, hormônios, pequenas moléculas e outros compostos enjaulado.

Nós descrevemos um protocolo de rotulagem célula usando a fluoresceína enjaulado, no entanto, outros foto-ativável corantes e as proteínas podem ser igualmente utilizados.

1. A injeção de fluoresceína Caged

1. Preparar a solução estoque de 5% (5mg enjaulado-fluoresceína / 100 mL de KCl 0,2 M) de Dextran-conjugado 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzyl (DMNB) enjaulado fluoresceína (10.000 MW dextran, aniônicos, Invitrogen, sondas moleculares, Carlsbad, CA , cat. não. D-3310). Alíquotas e armazenar em -20 ° C. Note-se que DMNB gaiolas fluoresceína é sensível à luz e deve ser mantido no escuro.
2. Prepare uma calha de injeção feita de agarose 1% (Sigma, St. Louis, MO, cat. Não. A9539), conforme descrito no "livro O peixe-zebra" ^1.
3. Prepare 2 litros de E3 por meio de diluição de 100 x solução estoque E3.
4. Na noite antes da injeção, prepare gaiolas de acasalamento separar o sexo masculino (s) da fêmea (s) da linha desejada transgênicos expressando um marco visível fluorescente (GFP, RFP, etc) usado para localizar as células-alvo para a fotoativação.
5. Prepare agulhas de injeção capilar (Parede Fina capilares de vidro com filamento, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL, cat. Não. TW100F-6), utilizando um extrator de micropipeta (Sutter Instrumento, Novato, CA, P-97).
6. Descongelar uma alíquota de 5% enjaulado fluoresceína no gelo.
7. Diluir a solução estoque de 5% enjaulado fluoresceína em KCl 0,2 M para uma concentração final de 1%, e manter em gelo. Evitar exposição à luz.
8. Acasalamento configuração cruza preparada na etapa 4.
9. Recolher os ovos fertilizados logo que são colocados. Embriões Orient uma célula-fase do molde de injeção agarose revestidas com ^uma E3.
10. Usando uma ponta microloader (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha, cat. Não. 5,242 956,003) backfill uma agulha de injecção com ~ mL 1 de 1% enjaulado solução de fluoresceína.
11. Lugar carregado de agulha em um micromanipulador anexado a um gas-powered microinjetor (pneumático picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820).
12. Ajustar o volume de injeção para 2-3nl e injetar o enjaulado-fluoresceína diretamente no citoplasma da célula. Injetar um mínimo de 50 embriões por experiência.
13. Incubar os embriões no escuro a 28,5 ° C na E3 para o estágio de desenvolvimento desejado. Se embriões com mais de 24 horas após a fecundação são analisados, adicione phenylthiourea 0,1% (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Não. 22290-9) para inibir pigmentação.

2. Embrião de montagem

1. Preparar a solução E2 fresco (ver parte de soluções; pode ser armazenado a 4 ° C por uma semana).
2. Casaco de 60 milímetros placas de Petri com uma fina camada de agarose 1% dissolvida em meio E2.
3. Prepare 2% baixo ponto de fusão incorporação de agarose (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, gato não 16520100..) Para: dissolver a agarose em água destilada estéril por duas vezes aquecimento por microondas até ferver. Mantenha a tampa do tubo está aberta durante o aquecimento. ML alíquota 1 em tubos de microcentrífuga e manter-se em um bloco de aquecimento a 72 ° C.
4. Remover o córions dos embriões, puxando cuidadosamente o córion além com uma pinça afiada (n. 5). Manter os embriões em solução E2 em um prato de agar-revestido (ver passo 2). Dechorionated embriões devem ser manuseados com fogo-de vidro polido pipeta Pasteur, pois podem ficar com pipetas de polipropileno. Evite expor o embrião dechorionized ao ar uma vez que estes embriões possam ser danificados pela tensão superficial do líquido.
5. Recolher o embrião selecionado em um pequeno volume de E2 usando um fogo-de vidro polido pipeta Pasteur, e colocar o embrião em 60 milímetros prato de Petri. Montar uma gota (~ mL 150) de agarose 2% (passo 3) ao lado do embrião. Rapidamente misturar as duas gotas para obter um homogênea finais ~ 1% mistura de agarose e usando um microscópio de dissecação orientar o embrião com o lado dorsal de frente para a lente objetiva.
6. Aguarde até que a agarose solidificou e adicione meio E2 até o embrião incorporado é submerso em líquido. É preferível obter um único embrião por prato, pois pode ser liberado do agarose após o processo de fotoativação.

3. Fotoativação

1. Nós usamos uma Zeiss LSM 510 META NLO dois fótons microscópio equipado com uma banda larga ajustável (700-1020nm) Mai Tai-laser de femtosegundos HP-de Spectraphysics.
2. Coloque o embrião montado em um suporte da placa sob o microscópio. O marco fluorescente no embrião é visualizado utilizando 40x/0.8W água Achroplan imerso objetivo. Para as etapas seguintes que usamos não descanned detector (NDD) com a banda passar filtro (BP) de 500-550nm.
3. Como pré-requisito para o processo de fotoativação, obter informações fluorescentes espacial da região de interesse através da aquisição de série de imagens da mais ventral com a parte dorsal do sinal detectado fluorescente com dois fótons de comprimento de onda do laser de 860nm (para a detecção de GFP). Para este fim, resolução suficiente pode ser obtida usando uma extensão de 6μm entre cada plano adquirido focal.
4. Selecione o destinoz-plano de fotoativação e trazer esta região em foco. Dependendo da finalidade do experimento, a região de interesse pode ser dentro ou fora do marco GFP visível. Dê uma única imagem neste z-plano. Salvar a imagem e mantê-la aberta em uma janela separada.
5. Definir o comprimento de onda do laser de dois fótons de 720nm e quando o laser está em modo bloqueado abrir o menu "Editar lixívia". Definir a região de interesse (ROI) para fotoativação de acordo com a imagem tirada em 860nm (Etapa 4) usando o menu "Definir Região". É crucial para selecionar o ROI sobre esta imagem após mudar o comprimento de onda do laser para 720nm como a ação muda o último x, y posições do campo observado.
6. Ajuste os seguintes parâmetros para fotoativação no menu "Editar lixívia" (ver passo 9): a) potência do laser relativa; b) número de iterações; c) velocidade de verificação.
7. 'Bleach' imprensa na janela "Editar lixívia" e aguarde até o pára laser.
8. Voltar para 860nm, adquirir uma imagem de plano único para avaliar a intensidade do material resultante fotoativado e uma segunda série de aquisição de imagem para avaliar o Z-span (espessura) do domínio ativado.
9. Considere os seguintes parâmetros para fotoativação:
   1. Deve-se empiricamente determinar as condições ideais para fotoativação variando dois parâmetros: laser intensidade e duração da fotoativação. A potência do laser em relação pode ser controlado pelo acusto-Optic Modulador de transmissão (OMA). A duração da fotoativação é uma função do número de iterações ea velocidade de varredura.
   2. Determinar a faixa linear da intensidade de fluorescência, a fim de evitar a saturação da fluorescência uncaged.
   3. Existe uma correlação linear entre a intensidade de fluorescência obtida das moléculas uncaged ea extensão do eixo z do clone fotoativados ^2.

4. Detecção da fluoresceína Uncaged

1. Após fotoativação, aumentar os embriões no escuro a 28,5 ° C em meio contendo 0,1% E2 PTU para prevenir o aparecimento de pigmentação da pele.
2. Na fase de desenvolvimento desejado, remover o embrião do agarose sob um microscópio de dissecação. Usando um bisturi pontiagudo, criar um "V" incisão em forma na agarose perto do embrião para que o "V" está apontando em direção à cabeça do embrião. Coloque uma pinça fechada no momento do "V" perto da cabeça do embrião e empurre abrir a fórceps separando os agarose ao longo do comprimento do embrião e liberando o embrião para o meio.
3. Coletar os embriões com um fogo-polido pipeta Pasteur e corrigir com paraformaldeído (PFA; 4% em 1 x PBS, pH 7,2) tanto para três horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
4. Remover a solução fixadora e enxaguar 2-3 vezes em PBST por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente.
5. Lavar embriões com metanol 100% por 10 min, reabastecer com metanol fresco e incubar a -20 ° C por pelo menos 2 horas.
6. Reidratar embriões por incubações sucessivas (5 min cada) em uma série de metanol diluído em PBSTr: 80%, 60%, 40% e 20%. Lave 2 x 10 minutos em PBSTr.
7. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente em 500 mL de solução de bloqueio.
8. Adicionar um anti-fosfatase alcalina de fluoresceína-(AP) fragmentos Fab (Roche, Palo Alto, CA, cat. Não. 11426338910), diluído 1:500 em solução de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C (tubos de microcentrífuga lugar em seus lados) .
9. Lavar 5 x 15 minutos em PBST.
10. Lavar por 5 minutos em NaCl 0,2 M em TNT.
11. Lavar por 5 minutos em 0,4 M NaCl em TNT.
12. Equilibrar 3 x 5 minutos em solução preparada na hora Prestain.
13. Dissolver um comprimido Fast Red (Roche, Palo Alto, CA, cat. Não. 11496549001) em 2 mL de solução Prestain. Recomenda-se filtrar a solução usando papel Whatman No. 2 para omitir-un dissolvido partículas. Alternativamente, spin down solução e usar o líquido claro sobrenadante.
14. Adicionar 500 mL de solução rápida Vermelho para cada tubo, incubar no escuro à temperatura ambiente, eo desenvolvimento da cor do monitor até que o desejado relação sinal-fundo é atingido (20 minutos a várias horas). Se desenvolve de fundo, a transferência para 4 ° C. Após uma hora de incubação, repor com uma solução de coloração nova Fast Red.
15. Parar a reação de coloração por 3 x 5 minutos lavagens em PBST.
16. Correção para 20 minutos em PFA 4% à temperatura ambiente.
17. Lave 2 x 5 minutos em PBST.
18. Embriões clara através de uma série de 25%, 50% e glicerol 75% em PBS até que os embriões são liquidadas na parte inferior do tubo. Embriões podem ser armazenados a 4 ° C por alguns dias.

5. Visualization fluorescentes da Área Uncaged

1. Prepare uma lâmina de microscópio para a montagem: com uma seringa de 1 mL aplicar quatro manchas de graxa de silicone clara sobre o slide, colocado a uma distância de ~ 15 milímetros uma da outra. Montar o embrião no center em ~ 200 mL de glicerol 75% e colocar uma lamela (n º 0; 18x18mm) em cima e empurre-a contra o silicone até que a solução de glicerol ocupa a superfície entre os slides.
2. Coloque o embrião montada no palco e trazê-lo em foco usando uma objetiva de 40x. Adquirir uma confocal Z-série de imagens usando lasers 488nm e 543nm Argon HeNe como a fonte de excitação.
3. A extensão do eixo z do domínio photoactivatated podem ser analisados ​​usando reconstrução 3D do embrião uncaged usando um software de análise de imagem.

6. Soluções

7. Resultados representante

Um exemplo do uso de dois fótons de microscopia para photoactivate agentes em um embrião de peixe-zebra viva é apresentado. Utilizando uma abordagem similar que anteriormente traçou a linhagem do fotoativados rotulados progenitores neurais no cérebro zebrafish ^2,3. A Figura 1 mostra fotoativação de uma gaiola corante traçador fluoresceína conjugada na placa neural anterior de embriões zebrafish carregando uma neurog1:: gfp repórter transgene, que serviu como um marco vivo intrínseca.

Embriões foram injetados com fluoresceína enjaulado na fase uma célula e embebidos em agarose no estádio de gema. Em 3-5 somitos palco as coordenadas espaciais foram medidos no neurog1:: gfp embrião transgênico para determinar a região de interesse (ROI) para uncaging (Figura 1A, A '). Nós uncaged o marcador de linhagem de fluoresceína em um domínio específico da placa neural (Figura 1B, B '). Posteriormente, o destino deste subdomínio progenitor dada rotulados neural foi determinada em prim5 (24 horas após a fecundação) estágio por imunocoloração da fluoresceína uncaged (Figura 1C, C ').

A extensão de dois fótons uncaging laser, ou seja, a intensidade da fluorescência uncaged ea espessura do domínio fotoativados (z-span), pode ser controlada através do ajuste de dois parâmetros: intensidade do laser e duração. Este último pode ser controlada pelo ajuste do número de iteração e velocidade de digitalização (ver parte 3, o passo 9; Russek-Blum, 2009). No exemplo mostrado na Figura 1, usamos potência do laser em relação de transmissão AOM 12%, 20 iterações e velocidade de digitalização de 25,6 ms / pixel. Usando as configurações, rotulado de ROI contendo 9-10 células e uma fotoativados z-span de 30μm (~ 1-2 fileiras de células).

Figura 1. Um resultado Representante da fotoativação de fluoresceína enjaulado em embrião zebrafish ao vivo usando dois fótons de microscopia.

Esquemática ilustração (AC) e imagens representativas (A'-C ") do processo de fotoativação. Ao vivo embrião zebrafish (A, A ') expressando GFP sob o controle de neurogenin-1 promotor (neurog1:: gfp) que foi injetado com fluoresceína enjaulado traçador corante na fase célula 1. No 3-5 - estágio somito, uma área distinta do primórdio do prosencéfalo (diencéfalo) foi fotoativado e as uncaged fluoresceína traçador corante poderia ser detectado (B, B '). Após a fotoativação procedimento, o embrião foi incubado a 28,5 ° C e as células do cérebro que contém a fluoresceína uncaged foram traçados por anti-fluoresceína imunocoloração menos 24 horas após a fertilização (hpf; C, C '). Dien, Diencéfalo;. Tel, Telencéfalo..

Foto-ativável compostos são moléculas cuja função é mascarado, até que são iluminados com um comprimento de onda específico (geralmente UV), induzindo uma reação fotoquímica que converte as moléculas em um estado biologicamente ou quimicamente ativas. Essas sondas fornecem ferramentas muito poderosas na investigação em biologia celular, uma vez que a ativação pode ser controlado com precisão temporal e espacialmente, limitando a sua exposição à luz.

A vantagem significativa de microscopia multi-fotão é a sua penetração relativamente profunda ópticos e fototoxicidade inespecífica reduzida. Para o processo de ativação, dois fótons de baixa energia deve ser absorvida pelo composto foto-ativável, ao mesmo tempo. Como a probabilidade de um evento como esse é dependente da densidade de fótons, a ativação permanece restrita ao plano focal. A região de ativação pode ser seletivamente manipulados em um volume definido dentro do tecido.

Nós apresentamos um protocolo para a fotoativação de fluoresceína enjaulado utilizando dois fótons de microscopia em embriões de peixe-zebra ao vivo. No exemplo específico aqui apresentados, usamos dois fótons de microscopia para induzir enjaulado-fluoresceína fotólise, a fim de marcar células em estágios embrionários iniciais e, posteriormente, traçar a linhagem da células marcadas no cérebro zebrafish em desenvolvimento. Em comparação com a fotoativação por laser e flash-lâmpada, o que resulta na ativação do corante traçador em algumas dezenas de células e falta de resolução no eixo z ^4,5, de dois fótons baseado fotoativação pode alcançar uma resolução espacial de alguns micrômetros de obtenção de uma resolução axial proximalmente 1-2 fileiras de células ^2,3.

O procedimento aqui relatado pode ser utilizado para a ativação de uma variedade de compostos em uma resolução única célula de espécimes vivos. Por exemplo, a proteína Kaede pode ser igualmente utilizado para as células rótulo seguinte ao da sua fotoconversão a partir de uma proteína verde para vermelho fluorescenct ^6,7. Outros activado pela luz proteínas que podem ser aplicadas incluem o canal iônico light-gate, channelrodopsina, que pode modular a atividade neuronal ⁸ e fotossensibilizadores como KillerRed, que induz a morte celular após irradiação de luz ^9.

Uma variedade de moléculas enjaulado têm sido relatados, permitindo a modulação de processos fisiológicos através da manipulação de compostos extracelular e intracelular ^10. Estes incluem, neurotransmissores ativa (por exemplo, o glutamato ^11,12) e segundos mensageiros (por exemplo, cálcio ¹³⁾ e hormônios esteróides (por exemplo, ácido retinóico ^14). Por fim, foto-mediada controle da ativação do gene e silenciamento no peixe-zebra foi introduzido. Fotoativação de dois fótons com base de oligonucleotídeos antisense enjaulado (morpholinos) e RNAs podem ser usadas para knockdown do gene e de ganho de função em população de células de um embrião de restrito ao vivo zebrafish ^15,16.

Em suma, dois fótons baseados foto-ativação em embriões de peixe-zebra ao vivo é: 1) precisa-1-2 fileiras de células ao longo dos eixos x, y, z. 2) Quantitativo-o grau de fotoativação podem ser controlados. 3)-Versatile pode ser aplicado para uma variedade de foto-conversíveis proteínas.

Agradecimentos são devidos a Genia Brodsky para a figura de gráficos; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman para aconselhamento e assistência técnica com o uncaging dois fótons; Maayan tahor e Suliman Elsadin de assistência técnica; Uwe Strahle por ter gentilmente cedido a linha de repórter e neurogenin1 Amos Gutnick para comentários a este manuscrito. A pesquisa no laboratório Levkowitz é apoiado pela Fundação Alemã-Israelense (concessão número 183/2007); Israel Science Foundation (Grant número 928/08) e da Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL é um titular da Cátedra de Desenvolvimento de Carreira Tauro em Investigação Biomédica.