שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

Photoactivation של תרכובות מטרה בכל יצור חי הוכיחה גישה ערך לחקור תהליכים ביולוגיים שונים, כגון ההתפתחות העוברית, איתות הסלולר ופיזיולוגיה מבוגר. מבחינה זו, השימוש במיקרוסקופ רב פוטון מאפשרת photoactivation כמותי של סוכן ניתנה תגובה אור רקמות עמוק ברזולוציה של תא בודד. כמו עוברי דג הזברה הם שקוף אופטית, הפיתוח שלהם יכול להיות פיקוח in vivo. תכונות אלה הופכות את דג הזברה אורגניזם מודל מושלם לבקרת פעילות של מגוון רחב של חומרים כימיים חלבונים על ידי אור ממוקד. כאן אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים לגרום הפעלת והעמסת בכלוב כימית, אשר בתורו מאפשר לנו לעקוב אחר גורלו של תא חי עוברי דג הזברה. אנו משתמשים העוברים להביע ציון דרך גנטי חיים (GFP) לאתר למקד את כל התאים של עניין. הליך זה יכול לשמש באותה מידה להפעלת מדויק המושרה אור של חלבונים, הורמונים, מולקולות קטנות ותרכובות אחרות בכלוב.

אנו מתארים פרוטוקול של תיוג התא באמצעות והעמסת בכלוב, לעומת זאת, אחרים צילום activatable צבעים וחלבונים יכול לשמש באותה מידה.

1. הזרקת והעמסת Caged

1. הכן פתרון המניה 5% (5mg בכלוב-והעמסת / 100 0.2M KCl μL) של dextran-מצומדות 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) בכלוב והעמסת (10,000 מגוואט dextran, anionic, Invitrogen, בדיקות מולקולריות, בקרלסבד, קליפורניה , חתול. לא. D-3310). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. שים לב DMNB-בכלוב והעמסת רגיש לאור צריך להישמר בחושך.
2. הכן שוקת הזרקת עשוי agarose 1% (Sigma, סנט לואיס, מיזורי, חתול. לא. A9539) כפי שמתואר "הספר דג הזברה" ^1.
3. הכינו 2 ליטר בינוני E3 על ידי דילול פתרון x 100 מניות E3.
4. בערב לפני הזריקה, להכין כלובים ההזדווגות הפרדת זכר (ים) מן הנקבה (ים) של הקו הרצוי מהונדס המבטא נקודת ציון ניאון גלוי (GFP, RFP וכו ') המשמשים למקם את התאים יעד photoactivation.
5. הכן מחטים הזרקת נימי (Thin קיר זכוכית נימים עם נימה, מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה, חתול. לא. TW100F-6) באמצעות חולץ micropipette (כלי סאטר, Novato, CA, P-97).
6. הפשירי aliquot של 5% בכלוב והעמסת על הקרח.
7. לדלל את 5% בכלוב פתרון והעמסת המניות 0.2M KCl לריכוז סופי של 1%, ולשמור על הקרח. המנעו מחשיפה לאור.
8. ההזדווגות הגדרת חוצה מוכן בשלב 4.
9. איסוף ביצים מופרות ברגע שהם הניחו. אוריינט חד תא עוברי שלב עובש הזרקת agarose ועליהן E3 ^1.
10. בעזרת קצה microloader (Eppendorf, בהמבורג, גרמניה, חתול. לא. 5242 956.003) למילוי המזרק עם μL 1 ~ 1% בכלוב פתרון והעמסת.
11. מקום טעון מחט לתוך micromanipulator מצורף בנזין microinjector (פנאומטי picopump, העולם Precision מכשירים, סרסוטה, פלורידה, PV820).
12. התאם את עוצמת הזריקה על 2-3nl ו להזריק את בכלוב-והעמסת ישירות לתוך הציטופלסמה של התא. הזרק מינימום של 50 עוברים לכל ניסוי.
13. דגירה עוברים בחושך על 28.5 ° C ב-E3 לשלב ההתפתחותי הרצוי. אם עוברים יותר מ 24 שעות שלאחר ההפריה הם ניתחו, להוסיף phenylthiourea 0.1% (PTU, Sigma, סנט לואיס, מיזורי, חתול. לא. 22290-9) לעכב פיגמנטציה.

2. העובר הרכבה

1. הכן טרי פתרון E2 (ראה חלק פתרונות, ניתן לאחסן 4 ° C למשך שבוע).
2. מעיל 60 מ"מ צלחות פטרי עם שכבה דקה של agarose 1% מומסים בינוני E2.
3. הכן 2% נקודת התכה נמוכה agarose (Ultra טהור LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, חתול לא 16520100..) להטבעת: לפזר את agarose במים מזוקקים סטרילי כפול על ידי חימום במיקרוגל עד רתיחה. שמור כובע של צינור פתוח במהלך החימום. 1 Aliquot מ"ל לתוך צינורות microcentrifuge ולשמור בבלוק חימום על 72 ° C.
4. הסר את chorions של העוברים על ידי משיכתו בעדינות סיסית בנפרד עם מלקחיים חדה (מס '5). שמור עוברים פתרון E2 על צלחת אגר מצופה (ראה שלב 2). עוברים Dechorionated צריכים להיות מטופלים עם אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן. הימנע חשיפת העובר dechorionized לאוויר כמו אלה העוברים עלול להיפגע על ידי מתח פני הנוזל.
5. אסוף את העובר נבחרים נפח קטן של E2 באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר, והמקום עובר על צלחת פטרי 60 מ"מ. הר ירידה (~ 150 μL) agarose של 2% (שלב 3) לצד העובר. במהירות לערבב את שתי טיפות כדי לקבל הומוגנית הסופי ~ 1% תערובת agarose ושימוש להתמצא מיקרוסקופ לנתח את העובר עם הצד הגבי שלה מול העדשה אובייקטיבי.
6. המתן עד agarose יש ביסוס להוסיף בינוני עד E2 העובר מוטבע הוא שקוע בתוך נוזל. הוא העדיף לקבל עובר יחיד לכל צלחת כפי שהוא עשוי להיות משוחרר מן agarose לאחר תהליך photoactivation.

3. Photoactivation

1. אנו משתמשים LSM Zeiss 510 META NLO שני הפוטונים מיקרוסקופ המצויד בפס רחב מתכונן (700-1020nm) מאי טאי-HP-femtosecond לייזר Spectraphysics.
2. מניחים את העובר רכוב על בעל צלחת מתחת למיקרוסקופ. ציון דרך ניאון העובר הוא מדמיין באמצעות מים 40x/0.8W Achroplan שקוע אובייקטיבי. לגבי הצעדים הבאים בהם אנו משתמשים שאינם descanned גלאי (NDD) עם הלהקה לעבור סינון (BP) של 500-550nm.
3. כתנאי מוקדם לתהליך photoactivation, לקבל מידע פלורסנט מרחבי האזור של עניין על ידי רכישת סדרה תמונה מתוך הגחון ביותר לחלק הגבי של האות ניאון מזוהה עם אורך גל two פוטון לייזר של 860nm (גילוי ה-GFP). לשם כך, ברזולוציה מספיק ניתן להשיג באמצעות טווח של 6μm בין כל מוקדי רכשה מטוס.
4. בחר את היעדZ-מטוס photoactivation ולהביא את האזור למוקד. בהתאם לצורך הניסוי, אזור של אינטרס יכול להיות בתוך או מחוץ ציון דרך ה-GFP גלוי. קחו תמונה אחת במטוס-z זה. שמור את התמונה להשאיר אותו פתוח בחלון נפרד.
5. קבע את אורך הגל שני הפוטונים לייזר 720nm כאשר הלייזר נמצא במצב נעול לפתוח את התפריט 'ערוך אקונומיקה ". הגדר את האזור של עניין (ROI) עבור photoactivation לפי התמונה נלקחה ב 860nm (שלב 4) שימוש בתפריט 'הגדרת אזור ". זה חיוני כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה על התמונה הזאת לאחר העברת לייזר באורך גל 720nm כמו הפעולה האחרונה משנה את x, y עמדות של שדה ציין.
6. כוונו את הפרמטרים הבאים עבור photoactivation בתפריט 'עריכה אקונומיקה "(ראה שלב 9): כוח) לייזר יחסית; ב) מספר חזרות: ג) מהירות סריקה.
7. "Bleach" הקש בחלון 'ערוך אקונומיקה "ולהמתין מפסיק לייזר.
8. עבור בחזרה ל 860nm, לרכוש תמונה מטוס אחד כדי להעריך את העוצמה של החומר photoactivated שהתקבל סדרה שנייה של רכישת התמונה על מנת להעריך את Z-span (עובי) של התחום הפעיל.
9. קחו למשל את הפרמטרים הבאים עבור photoactivation:
   1. אחד צריך לקבוע באופן אמפירי את התנאים האופטימליים עבור photoactivation ידי שינוי שני פרמטרים: עוצמת הלייזר ומשך photoactivation. כוח לייזר יחסית יכול להיות נשלט על ידי העברת acousto אופטיים (AOM) אפנן. משך photoactivation היא פונקציה של מספר חזרות מהירות הסריקה.
   2. קבע את טווח ליניארי של עוצמת הקרינה על מנת למנוע הרוויה של הקרינה שברחה מכלוב.
   3. קיים קשר לינארי בין עוצמת הקרינה המתקבל של מולקולות שברחה מכלוב ואת תוחלת Z-ציר המשובט photoactivated ^2.

4. גילוי והעמסת את שברחה מכלוב

1. לאחר photoactivation, להעלות את העוברים בחושך על 28.5 מעלות צלזיוס בינוני E2 המכיל 0.1% PTU כדי למנוע מראית עין של בפיגמנטציה של העור.
2. בשלב ההתפתחותי הרצוי, להסיר את העובר מן agarose תחת מיקרוסקופ לנתח. באמצעות אזמל הצביע, ליצור "V" חתך בצורת agarose ליד העובר כך "V" היא מצביעה לעבר ראשו של העובר. מניחים מלקחיים סגור בשלב של "V" ליד ראש העובר בעדינות לדחוף לפתוח את מלקחיים הפרדת agarose לאורך העובר ומשחרר את העובר לתוך המדיום.
3. אסוף את העוברים עם אש מלוטש פיפטה פסטר ולתקן עם paraformaldehyde (PFA, 4% 1 x PBS, PH 7.2) עבור כל אחד 3 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
4. הסר את הפתרון מקבע ולשטוף 2-3 פעמים PBST לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף עוברים עם מתנול 100% עבור 10 דקות, לחדש עם מתנול דגירה טריים ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 2.
6. רעננותם עוברים על ידי incubations רצופים (5 דקות כל אחת) בסדרה של מתאנול מדולל PBSTr: 80%, 60%, 40% ו 20%. לשטוף 2 x 10 דקות PBSTr.
7. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 500 μL של פתרון חסימה.
8. הוסף phosphatase אנטי והעמסת אלקליין (AP) שברי Fab (רוש, בפאלו אלטו, קליפורניה, חתול. לא. 11426338910), מדולל 1:500 ב חסימה פתרון דגירה לילה ב 4 ° C (microcentrifuge מקום צינורות על צדם) .
9. לשטוף 5 x 15 דקות PBST.
10. שטפו במשך 5 דקות ב 0.2M NaCl ב-TNT.
11. שטפו במשך 5 דקות ב 0.4M NaCl ב-TNT.
12. לאזן 3 x 5 דקות בתמיסה Prestain מוכן טרי.
13. ממיסים אחד מהיר האדום הלוח (רוש, בפאלו אלטו, קליפורניה, חתול. לא. 11496549001) פתרון 2 Prestain מ"ל. מומלץ לסנן את הפתרון באמצעות Whatman מס '2 נייר להשמיט בלתי מומסים חלקיקים. לחלופין, ספין למטה פתרון ולהשתמש נוזלי supernatant ברור.
14. הוספת 500 μL פתרון האדום מהירה צינור אחד, דגירה בחושך בטמפרטורת החדר, וצבע פיתוח לפקח עד הרצוי אות רקע היחס הוא הגיע (20 דקות עד מספר שעות). אם הרקע מפתחת, להעביר 4 ​​° C. לאחר שעה של דגירה, לחדש עם פתרון מהיר מכתים חדש האדום.
15. עצור את התגובה מכתים ידי 3 x 5 דקות שוטף ב PBST.
16. תקן 20 דקות ב PFA 4% בטמפרטורת החדר.
17. לשטוף 2 x 5 דקות PBST.
18. נקה עוברים דרך סדרה של 25%, 50% ו 75% גליצרול PBS עד עוברים הם התיישבו בחלק התחתון של הצינור. עוברים יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

5. ויזואליזציה פלורסנט אזור שברחה מכלוב

1. הכן שקופית מיקרוסקופ עבור הרכבה: באמצעות מזרק 1 מ"ל להחיל ארבע נקודות של גריז סיליקון ברור בשקופית, ממוקם במרחק של ~ 15mm אחד מהשני. הר העובר על center ב μL 200 ~ של גליצרול 75% במקום coverslip (מס '0; 18x18mm) על גבי בעדינות לדחוף אותו נגד סיליקון עד הפתרון גליצרול תופסת את פני השטח בין השקופיות.
2. מניחים את העובר רכוב על הבמה ולהביא אותו אל המוקד באמצעות המטרה 40X. לרכוש confocal Z-סדרה של תמונות באמצעות ארגון 488nm ו 543nm לייזרים HeNe כמקור עירור.
3. תוחלת Z-ציר של תחום photoactivatated ניתן לנתח באמצעות שחזור 3D של העובר שברחה מכלוב באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

6. פתרונות

7. נציג תוצאות

דוגמה של שימוש במיקרוסקופ שני פוטונים על photoactivate סוכנים עובר דג הזברה חי מוצגת. שימוש בגישה דומה לנו בעבר לייחס את שושלת היוחסין של אבות photoactivated שכותרתו עצביים במוח דג הזברה ^2,3. איור 1 מציג photoactivation של צבע בכלוב והעמסת מצומדות נותב בצלחת עצביים הקדמי של עוברי דג הזברה נושא neurog1: GFP כתב transgene, ששימש כנקודת ציון פנימי לחיות.

עוברים הוזרקו והעמסת בכלוב בשלב אחד את התא מוטבע agarose בשלב ניצן. בגיל 3 - 5-somite הבמה קואורדינטות מרחבי נמדדו neurog1: העובר GFP מהונדס כדי לקבוע את האזור של עניין (ROI) עבור משחררות רפרוף (איור 1 א ', א'). אנו שברחה מכלוב נותב השושלת והעמסת בתחום מסוים של צלחת העצבית (איור 1B, ב '). כתוצאה מכך, גורלו של משנה זו שכותרתו נתון אב עצביים נקבע על prim5 (24 שעות שלאחר ההפריה) שלב אחר immunostaining של והעמסת שברחה מכלוב (תרשים 1C, C ").

היקף שני הפוטונים משחררות רפרוף לייזר, כלומר את עוצמת הקרינה שברחה מכלוב ואת עובי של תחום photoactivated (z-span), יכול להיות נשלט על ידי התאמת שני פרמטרים: עוצמת הלייזר ומשך. האחרון יכול להיות נשלט על ידי התאמה של מספר החזרות מהירות סריקה (ראה חלק 3, שלב 9; Russek-בלום, 2009). בדוגמה המוצגת באיור 1, השתמשנו כוח לייזר היחסית של שידור AOM 12%, 20 חזרות ולסרוק במהירות של 25.6 μsec / פיקסל. באמצעות הגדרות אלו אנו שכותרתו ROI המכיל 90-10 תאים photoactivated Z-span של 30μm (~ 1-2 שורות תאים).

באיור 1. התוצאה נציג photoactivation של והעמסת בכלוב בעובר דג הזברה לחיות באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

איור סכמטי (AC) ותמונות נציג (A'-C ') של תהליך photoactivation. העובר חי דג הזברה (א ', א') ה-GFP להביע בשליטת היזם neurogenin 1 (neurog1: GFP) כי הזריקו בכלוב והעמסת נותב לצבוע בשלב 1 התא. בבית 3-5 - שלב somite, אזור נפרד של primordium forebrain (diencephalon) היה photoactivated ואת שברחה מכלוב והעמסת נותב לצבוע ניתן היה לזהות (ב ', ב'). בעקבות ההליך photoactivation, העובר הודגר ב 28.5 ° C ו לתאי המוח המכילים את והעמסת שברחה מכלוב אותרו על ידי immunostaining אנטי והעמסת ב 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf: C, C "). דיין, Diencephalon;. תל, Telencephalon..

Photo-activatable תרכובות הם מולקולות שתפקידו רעולי פנים עד שהם מוארים עם אורך גל מסוים (UV בדרך כלל), גרימת תגובה פוטו הממירה את מולקולות למצב פעיל מבחינה ביולוגית או כימית. בדיקות אלה מספקים כלים חזקים מאוד בתחום המחקר בביולוגיה של התא, מאז ההפעלה ניתן לשלוט בדיוק temporally מרחבית על ידי הגבלת החשיפה שלהם לאור.

היתרון המשמעותי של מיקרוסקופיה רב פוטון הוא חדירה עמוקה יחסית אופטיים phototoxicity ספציפי מופחת. במשך תהליך ההפעלה, שני פוטונים של אנרגיה נמוכה חייב להיקלט על ידי מתחם צילום activatable באותו זמן. כאשר ההסתברות לאירוע כזה תלוי בצפיפות פוטון, הפעלת נשאר מוגבל למישור המוקד. האזור ההפעלה ולכן ניתן להשפיע באופן סלקטיבי בנפח מוגדר בתוך הרקמה.

אנו מציגים פרוטוקול עבור photoactivation של והעמסת בכלוב באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה עוברי דג הזברה לחיות. בדוגמה ספציפית המוצג במסמך זה אנו משתמשים שני הפוטונים במיקרוסקופ כדי לגרום בכלוב-והעמסת photolysis כדי לסמן תאים בשלבים עובריים מוקדמים לאחר מכן לעקוב אחר שושלת היוחסין של תאים במוח הנקרא דג הזברה מתפתח. בהשוואה photoactivation על ידי לייזר פלאש מנורה, שתוצאתה ההפעלה של צבע נותב בתוך כמה עשרות תאים וחוסר ברזולוציה של ציר z ^4,5, שני הפוטונים מבוססי photoactivation יכול להגיע ברזולוציה מרחבית של כמה מיקרומטרים קבלת החלטה צירית של proximally 1-2 שורות תאים ^2,3.

נוהל דיווח בזאת יכול להיות מנוצל לצורך הפעלה של מגוון רחב של תרכובות ברזולוציה תא בודד בדגימות לחיות. לדוגמה, החלבון קאךה ניתן להשתמש באופן דומה תאים תווית הבאים photoconversion שלה ירוק לחלבון fluorescenct אדום ^6,7. אחרים אור הופעל חלבונים שניתן להחיל לכלול את ערוץ אור מגודרת יון, Channelrhodopsin, אשר יכול לווסת את הפעילות העצבית ⁸ ו פוטוסנסיטייזרים כגון KillerRed, אשר גורם מוות של תאים על הקרנת אור ^9.

מגוון של מולקולות בכלוב דווחו, המאפשר ויסות של תהליכים פיזיולוגיים על ידי מניפולציה של חומרים תאיים ו תאיים ^10. אלה כוללים, נוירוטרנסמיטורים פעיל (לדוגמא גלוטמט ^11,12) ושליחים השני (למשל סידן ¹³⁾ ו - הורמונים סטרואידים (למשל החומצה הרטינואית ^14). לבסוף, תמונה בתיווך שליטה על הפעלת גנים והשתקת של דג הזברה כבר הציג. Photoactivation שני הפוטונים מבוסס על מולקולות אנטיסנס בכלוב (morpholinos) ו RNAs יכול לשמש מציאה גן ולהשיג-of-פונקציה באוכלוסייה תא מוגבלת של העובר דג הזברה לחיות ^15,16.

לסיכום, שני הפוטונים מבוססי צילום ההפעלה עוברי דג הזברה לחיות הוא: 1) מדויק, 1-2 שורות תאים לאורך x, y, z צירים. 2) כמותי, את מידת photoactivation יכול להיות נשלט. 3) צדדי, ניתן להחיל עבור מגוון רחב של צילום להמרה חלבונים.

תודה הן בשל ג'ניה ברודסקי עבור דמות גרפיקה, ויאצ'סלב Kalchenko, דאגלס לוץ, וליאוניד רויטמן ייעוץ סיוע טכני עם משחררות רפרוף שני הפוטונים, מעיין טהור לבין סולימאן Elsadin לקבלת סיוע טכני; Uwe Strahle עבור באדיבות מתן קו כתב neurogenin1 ו עמוס גוטניק הערות על כתב היד הזה. המחקר במעבדה לבקוביץ נתמך על ידי הקרן הגרמנית ישראלית (מספר המענק 183/2007); הקרן הלאומית למדע (מענק מספר 928/08) ואת הארייט & מרסל דקר קרן. GL הוא מופקד הקתדרה פיתוח קריירה Tauro במחקר ביו.