ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Multiphoton المجهري يسمح السيطرة على الفوتونات منخفضة الطاقة الضوئية مع الاختراق العميق والضيائية مخفضة. نحن تصف استخدام هذه التكنولوجيا لوضع العلامات الخلية تعيش في الأجنة الزرد. يمكن أن يكون هذا البروتوكول تكييفها بسهولة للتحريض ، صورة من الجزيئات التي تستجيب للضوء مختلف.

وقد ثبت تنشيط ضوئي من المركبات المستهدفة في الكائنات الحية نهجا قيما للتحقيق في العمليات البيولوجية المختلفة مثل التطور الجنيني ، مما يشير الخلوية وعلم وظائف الأعضاء الكبار. في هذا الصدد ، واستخدام متعدد الفوتون المجهري تمكن من تنشيط ضوئي الكمي وكيل معين تستجيب الضوء في الأنسجة العميقة في قرار خلية واحدة. كما الأجنة الزرد شفافة بصريا ، ويمكن رصد تنميتها في الجسم الحي. هذه الصفات تجعل من الزرد كائن نموذج مثالي للسيطرة على نشاط مجموعة متنوعة من العوامل الكيميائية والبروتينات التي تركز الضوء. نحن هنا وصف استخدام المجهر ثنائي الفوتون للحث على تنشيط فلوريسئين قفص كيميائيا ، والذي بدوره يسمح لنا لمتابعة مصير الخلايا في الأجنة الزرد حية. نحن نستخدم تعبير عن أجنة حية المعالم الوراثية (GFP) لتحديد الهدف بدقة وأية خلايا من الفائدة. ويمكن استخدام هذا الإجراء على نحو مماثل لتفعيل دقيقة بفعل ضوء البروتينات والهرمونات والجزيئات الصغيرة وغيرها من المركبات في قفص.

وصفنا بروتوكولا للوسم الخلية باستخدام فلوريسئين قفص ، ومع ذلك ، يمكن غيرها من الصور activatable الأصباغ وتستخدم بروتينات مماثلة.

1. حقن فلوريسئين محبوس

1. تحضير 5 ٪ محلول المخزون (5mg قفص - فلوريسئين / 100 بوكل 0.2M ميكرولتر) من ديكستران - مترافق 4،5 - dimethoxy - nitrobenzyl - 2 (DMNB) في قفص فلوريسئين (10000 ميجاوات دكستران ، أنيوني ، Invitrogen ، تحقيقات الجزيئية ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، القط. لا. D - 3310). قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. علما بأن DMNB - قفص فلوريسئين حساسة للضوء ويجب أن تبقى في الظلام.
2. يعد حوض الحقن المصنوعة من agarose 1 ٪ (سيغما ، وسانت لويس ، MO ، القط. لا. A9539) كما هو موضح في "الكتاب والزرد" ^1.
3. إعداد 2 لتر من E3 المتوسطة عن طريق تمييع 100 X محلول المخزون E3.
4. في المساء قبل الحقن ، وإعداد أقفاص التزاوج فصل الذكور (ق) من الإناث (ق) للخط المطلوب المعدلة وراثيا التي تعبر عن المعالم وضوحا فلوري (GFP ، RFP الخ) المستخدمة في توطين الخلايا المستهدفة لتنشيط ضوئي.
5. إعداد إبر الحقن الشعرية (رقيقة الجدار الزجاجي الشعيرات الدموية مع خيوط ، الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا ، القط. لا. TW100F - 6) باستخدام مجتذب micropipette (سوتر الصك ، نوفاتو ، CA ، P - 97).
6. أذاب an قسامة من 5 ٪ في قفص فلوريسئين على الجليد.
7. يخفف من 5 ٪ أسهم فلوريسئين قفص بوكل حل في 0.2M إلى تركيز النهائي من 1 ٪ ، والحفاظ على الجليد. تجنب التعرض للضوء.
8. التزاوج الصلبان أعدت الإعداد في الخطوة 4.
9. جمع البويضات المخصبة في أقرب وقت وضعت فيه. أجنة توجيه مرحلة واحدة خلية في القالب حقن agarose مضافين مع E3 ^1.
10. استخدام غيض microloader (إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا ، القط. رقم 5242 956،003) الردم إبرة الحقن مع ميكرولتر 1 ~ 1 ٪ في قفص فلوريسئين الحل.
11. مكان تحميل إبرة في micromanipulator تعلق على بالغاز microinjector (picopump الهوائية ، الآلات الدقيقة العالم ، ساراسوتا ، فلوريدا ، PV820).
12. ضبط مستوى الصوت لحقن 3nl - 2 وحقن قفص - فلوريسئين مباشرة في سيتوبلازم الخلية. ضخ ما لا يقل عن 50 الأجنة في التجربة.
13. احتضان الأجنة في الظلام على 28،5 درجة مئوية في E3 إلى المرحلة التنموية المنشودة. إذا حللت أجنة مضى عليها أكثر من 24 ساعة بعد الإخصاب ، إضافة الفنيل 0.1 ٪ (PTU ، سيغما ، وسانت لويس ، MO ، القط. لا. 22290-9) لمنع تصبغ.

2. تركيب الجنين

1. اعداد جديدة E2 الحل (انظر الجزء الحلول ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة اسبوع).
2. معطف 60 ملم أطباق بتري بطبقة رقيقة من agarose 1 ٪ الذائبة في المتوسط ​​E2.
3. إعداد 2 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose (الترا بيور LMP agarose ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، القط لم 16520100..) لتضمين : حل agarose في الماء المعقم المقطر المزدوج عن طريق تسخين الميكروويف حتى الغليان. ابقاء سقف أنبوب المفتوحة أثناء التسخين. قسامة 1 مل في أنابيب microcentrifuge والاحتفاظ في كتلة التدفئة في 72 درجة مئوية.
4. إزالة chorions من الأجنة عن طريق سحب بلطف بعيدا المشيماء حاد مع ملقط (رقم 5). إبقاء الأجنة في حل E2 على طبق آغار المغلفة (راجع الخطوة 2). يجب التعامل مع الأجنة Dechorionated النار مصقول ماصة باستير الزجاج لأنها قد التمسك ماصات البولي بروبلين. تجنب تعريض الجنين dechorionized في الهواء كما قد يكون معطوبا هذه الأجنة من توتر سطح السائل.
5. جمع الجنين المحدد في صغر حجم E2 باستخدام الزجاج المصقول النار ماصة باستور ، ووضع الجنين على 60 مم طبق بتري. جبل قطرة (~ 150 ميكرولتر) من agarose 2 ٪ (الخطوة 3) بجانب الجنين. المزيج بسرعة قطرات اثنين إلى الحصول على مزيج متجانس النهائي ~ agarose 1 ٪ وباستخدام مجهر توجيه تشريح الجنين مع الجانب الظهري التي تواجه عدسة الهدف.
6. انتظر حتى agarose وقد عززت والمتوسطة إضافة E2 حتى غمرت جزءا لا يتجزأ من الجنين في السائل. يفضل الحصول على جنين واحد لكل طبق ما قد أفرج عنه من agarose بعد عملية تنشيط ضوئي.

3. تنشيط ضوئي

1. نستخدم LSM زايس 510 META NLO ثنائي الفوتون المجهر مجهزة الانضباطي النطاق العريض (700 - 1020nm) ماي تاي HP - الفيمتو ثانية ليزر من Spectraphysics.
2. وضع الجنين محمولة على حامل لوحة تحت المجهر. المعلم الفلورسنت في الجنين هو تصور باستخدام 40x/0.8W Achroplan المياه تغمر الهدف. عن الخطوات التالية التي نستخدمها غير descanned كاشف (NDD) مع الفرقة تمرير التصفية (BP) من 550nm - 500.
3. كشرط مسبق لعملية تنشيط ضوئي ، الحصول على معلومات الفلورسنت المكاني للمنطقة من الفائدة من خلال الحصول على سلسلة من الصور الأكثر البطني للجزء الظهرية من الإشارة الكشف الفلوري مع اثنين من الفوتون الطول الموجي 860nm الليزر (لكشف GFP). تحقيقا لهذه الغاية ، يمكن الحصول على ما يكفي من القرار باستخدام مدى 6μm الطائرة بين كل اتصال المكتسبة.
4. حدد الهدفض الطائرة لتنشيط ضوئي وجلب هذه المنطقة في التركيز. اعتمادا على الغرض من التجربة ، لا يمكن للمنطقة أن تكون إما الفائدة داخل أو خارج المعالم GFP مرئية. التقاط صورة واحدة في هذا ض الطائرة. حفظ الصور وابقائه مفتوحا في نافذة منفصلة.
5. تعيين الطول الموجي ليزر ثنائي الفوتون إلى 720nm ، وعندما ليزر في وضع غير الساحلية فتح "تحرير التبييض' القائمة تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لتنشيط ضوئي وفقا للصورة التي اتخذت في 860nm (الخطوة 4) باستخدام القائمة "تحديد المنطقة". فمن الأهمية بمكان لتحديد عائد الاستثمار على هذه الصورة بعد تحويل الطول الموجي 720nm الليزر لمثل الإجراء الأخير التغييرات س ، ص المواقف حقل الملاحظة.
6. ضبط المعلمات التالية لتنشيط ضوئي في قائمة "تحرير التبييض" (راجع الخطوة 9) : أ) قوة الليزر النسبية ؛ ب) عدد التكرارات ج) سرعة المسح الضوئي.
7. "بليتش" الصحافة في نافذة "تحرير التبييض" وانتظر حتى يتوقف الليزر.
8. التبديل إلى 860nm ، والحصول على صورة طائرة واحدة لتقييم كثافة المواد الناتجة وphotoactivated سلسلة ثانية من الحصول على الصور لتقييم مدى Z - (سمك) في المجال تفعيلها.
9. النظر في المعايير التالية لتنشيط ضوئي :
   1. ينبغي للمرء أن يحدد تجريبيا الظروف المثلى لتنشيط ضوئي بدرجات معلمتين : ليزر كثافة ومدة تنشيط ضوئي. يمكن التحكم في قوة الليزر النسبي انتقال صوتية البصرية (AOM) المغير. مدة تنشيط ضوئي هي وظيفة من عدد من التكرارات وسرعة المسح الضوئي.
   2. تحديد نطاق من الكثافة الخطي مضان من أجل تجنب تشبع uncaged مضان.
   3. هناك علاقة خطية بين كثافة مضان الحصول عليها من الجزيئات uncaged وتمتد ض محور استنساخ photoactivated ^2.

4. الكشف عن فلوريسئين Uncaged

1. بعد تنشيط ضوئي ، ورفع الأجنة في الظلام على 28،5 درجة مئوية في المتوسط ​​تحتوي على 0.1 ٪ E2 PTU لمنع ظهور تصبغ الجلد درجة.
2. في هذه المرحلة التنموية المرجوة ، وإزالة الجنين من agarose تشريح تحت المجهر. وأشار باستخدام مشرط ، إنشاء "V" شق في شكل agarose قرب جنين بحيث "V" يشير نحو رأس الجنين. وضع ملقط يغلق عند نقطة من "V" بالقرب من رأس الجنين ويدفع برفق فتح ملقط فصل agarose على طول الجنين والإفراج عن الجنين في المتوسط.
3. جمع الأجنة مع ماصة باستير النار المصقول والإصلاح مع بارافورمالدهيد (منهاج العمل ؛ 4 ٪ في برنامج تلفزيوني × 1 ، 7،2 PH) ل3 ساعات سواء في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. إزالة الحل تثبيتي ، وشطف 2-3 مرات في PBST ما لا يقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. غسل الأجنة مع الميثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 10 دقيقة ، مع تجديد الطازجة والميثانول في احتضان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
6. ترطيب الأجنة حضانات المتعاقبة (5 دقائق لكل منهما) في سلسلة من الميثانول مخففة في PBSTr : 80 ٪ ، 60 ٪ ، 40 ٪ و 20 ٪. غسل 2 × 10 دقيقة في PBSTr.
7. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 500 ميليلتر من محلول الحظر.
8. إضافة الفوسفاتيز مكافحة فلوريسئين القلوية (ا ف ب) شظايا فاب (روش ، بالو ألتو ، كاليفورنيا ، القط. رقم 11426338910) ، 1:500 المخفف في الحل والحظر احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أنابيب microcentrifuge مكان على جنوبهم) .
9. يغسل 5 × 15 دقيقة في PBST.
10. يغسل لمدة 5 دقائق في كلوريد الصوديوم في 0.2M TNT.
11. يغسل لمدة 5 دقائق في كلوريد الصوديوم في 0.4M TNT.
12. يوازن 3 × 5 دقائق في محلول Prestain الطازجة.
13. حل صيام واحد الأحمر قرص (روش ، بالو ألتو ، كاليفورنيا ، القط. رقم 11496549001) في 2 مل من محلول Prestain. فمن المستحسن لتصفية حل به Whatman رقم 2 لحذف ورقة الامم المتحدة وحلت الجسيمات. بدلا من ذلك ، وتدور حل لأسفل واستعمال السائل واضحة طاف.
14. إضافة 500 ميكرولتر حل سريع الأحمر على كل أنبوب ، واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، ورصد التنمية اللون حتى يتم الوصول إلى المطلوب إشارة إلى الخلفية نسبة (20 دقيقة إلى عدة ساعات). إذا تطور الخلفية ، ونقل إلى 4 درجات مئوية. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، مع تجديد جديد حل سريع تلطيخ الأحمر.
15. وقف ردود الفعل من قبل تلطيخ 3 دقائق 5 × يغسل في PBST.
16. الإصلاح لمدة 20 دقيقة في PFA 4 ٪ في درجة حرارة الغرفة.
17. غسل 2 × 5 دقائق في PBST.
18. أجنة واضحة من خلال سلسلة من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ في الجلسرين PBS حتى الأجنة واستقرت في قاع الأنبوب. ويمكن تخزين الأجنة في 4 درجة مئوية لبضعة أيام.

5. فلوري التصور للمنطقة Uncaged

1. إعداد شريحة المجهر لتركيب : استخدام حقنة 1 مل تطبيق four بقع الشحوم سيليكون واضحة على الشريحة ، وضعت على مسافة 15mm ~ عن بعضها البعض. جبل الجنين في centeفي ص 200 ~ ميكرولتر من الجلسرين 75 ٪ ووضع ساترة (رقم 0 ؛ 18x18mm) على رأس ودفع برفق حتى ضد سيليكون الحل الجلسرين تحتل السطح بين الشرائح.
2. وضع الجنين شنت على خشبة المسرح وجعله هدفا التركيز باستخدام 40X. اكتساب مبائر Z - سلسلة من الصور باستخدام 488nm 543nm الليزر والأرجون HeNe كمصدر الإثارة.
3. ويمكن تحليلها على مدى ض محور مجال إعادة الإعمار باستخدام photoactivatated 3D الجنين uncaged باستخدام برمجيات تحليل الصور.

6. الحلول

7. ممثل النتائج

ويقدم مثالا على استخدام اثنين من الفوتون المجهري لphotoactivate وكلاء في لقمة العيش الأجنة الزرد. باستخدام نهج مماثل في السابق كنا تتبع نسب الأسلاف photoactivated العصبية في الدماغ المسمى ^2،3 الزرد. الشكل 1 يبين تنشيط ضوئي صبغة فلوريسئين التتبع مترافق في قفص لوحة الأمامية العصبية للأجنة الزرد يحمل neurog1 : GFP مراسل التحوير ، الذي شغل منصب معلما الجوهرية حية.

تم حقن الاجنة مع فلوريسئين قفص في مرحلة خلية واحدة وجزءا لا يتجزأ من agarose في مرحلة المهد. في 3 -- 5 الجسيدة المرحلة تم قياس الإحداثيات المكانية في neurog1 : GFP الجنين وراثيا لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لuncaging (الشكل 1A ، أ "). uncaged نحن التتبع فلوريسئين النسب في مجال معين من لوحة العصبية (1B الشكل ، B '). بعد ذلك ، تم تحديد مصير هذا المسمى نظرا فرعي السلف العصبية في prim5 (24 التسميد آخر ساعة) المرحلة التي immunostaining من فلوريسئين uncaged (الشكل 1C ، C ').

على مدى اثنين من الفوتون uncaging الليزر ، أي كثافة مضان uncaged وسمك المجال photoactivated (Z - SPAN) ، يمكن التحكم عن طريق ضبط معلمتين : كثافة الليزر ومدتها. يمكن السيطرة عليها من قبل هذه الأخيرة تعديل عدد التكرار وسرعة المسح الضوئي (انظر الجزء 3 ، الخطوة 9 ؛ Russek - بلوم ، 2009). في المثال هو موضح في الشكل 1 ، استخدمنا النسبية لانتقال السلطة ليزر AOM 12 ٪ ، 20 و تكرار سرعة المسح الضوئي 25.6 μsec / بكسل. باستخدام هذه الإعدادات لدينا المسمى ROI الخلايا التي تحتوي على 90-10 وphotoactivated Z - تمتد من 30μm (~ الخلية الصفوف 1-2).

الشكل 1. ونتيجة لتنشيط ضوئي ممثل فلوريسئين قفص في جنين يعيش الزرد باستخدام اثنين من الفوتون المجهري.

التخطيطي التوضيح (ميلان) وصور ممثل (A' - C ') عملية تنشيط ضوئي. يعيش الجنين الزرد (A ، A ') معربا عن GFP تحت سيطرة neurogenin 1 - المروج (neurog1 : GFP) التي تم حقنها في قفص الصبغة الكاشفة فلوريسئين في مرحلة الخلية 1. في 3-5 -- مرحلة الجسيدة ، كان photoactivated منطقة منفصلة من الدماغ المقدم منشم (الدماغ البيني) ، ويمكن أن يتم الكشف عن uncaged فلوريسئين الصبغة الكاشفة (B ، B '). وكان لاحقا لإجراء تنشيط ضوئي ، حضنت الجنين في 28.5 درجة مئوية وكانت تتبع وخلايا المخ التي تحتوي على فلوريسئين uncaged المضادة للفلوريسئين immunostaining في 24 التسميد آخر ساعة (HPF ؛ C ، C '). ديان ، الدماغ البيني ؛ أبيب ، Telencephalon.

الصور activatable المركبات هي عبارة عن جزيئات وظيفتها حتى تضاء ملثمين كانوا مع طول موجة معينة (وعادة ما فوق البنفسجية) ، الأمر الذي أدى إلى تفاعل كيميائي ضوئي يحول جزيئات في حالة نشطة بيولوجيا أو كيميائيا. هذه المجسات توفر أدوات قوية جدا في مجال البحث بيولوجيا الخلايا ، حيث يمكن تفعيل تسيطر على وجه التحديد زمانيا ومكانيا عن طريق الحد من تعرضها للضوء.

ميزة كبيرة متعددة الفوتون المجهري هو اختراقها البصرية العميقة نسبيا وغير محددة الضيائية مخفضة. لعملية التنشيط ، لا بد من استيعابها two فوتونات الطاقة منخفضة مجمع الصور activatable في نفس الوقت. كما أن احتمال مثل هذا الحدث يعتمد على كثافة الفوتون ، وتفعيل ما زال يقتصر على المستوى البؤري. ويمكن بالتالي تنشيط المنطقة يمكن معالجته بشكل انتقائي في حجم محدد داخل الأنسجة.

نقدم بروتوكول لتنشيط ضوئي من فلوريسئين قفص باستخدام اثنين من الفوتون المجهري في الأجنة الزرد حية. في مثال محدد هو موضح هنا نستخدم اثنين الفوتون المجهري للحث على قفص - فلوريسئين التحلل الضوئي من أجل علامة الخلايا الجنينية في مراحل مبكرة وبعد ذلك تتبع نسب الخلايا في الدماغ المسمى الزرد النامية. ويمكن مقارنة لتنشيط ضوئي بواسطة الليزر وميض مصباح ، مما يؤدي إلى تفعيل الصبغة الكاشفة في بضع عشرات من الخلايا وعدم وجود قرار في المحور Z ^4،5 ، واثنين من الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي التوصل الى حل المكاني ميكرومتر قليلة الحصول على القرار المحوري لصفوف قريب الخلية 1-2 ^2،3.

وذكرت والإجراء هنا يمكن الاستفادة منها لتفعيل مجموعة متنوعة من المركبات في قرار خلية واحدة في العينات الحية. على سبيل المثال ، يمكن للبروتين Kaede الذي يستخدم على نحو مماثل للخلايا التسمية التالية photoconversion به من الأخضر إلى الأحمر ^6،7 fluorescenct البروتين. الأخرى ضوء تنشيط البروتينات التي يمكن تطبيقها وتشمل القناة الايونية بوابات الخفيف ، Channelrhodopsin ، التي يمكن أن تعدل نشاط الخلايا العصبية ⁽⁸⁾ والضيائية مثل KillerRed ، الذي يستحث موت الخلايا عند تشعيع الضوء ^9.

وقد أبلغ عن مجموعة متنوعة من الجزيئات في قفص ، والسماح للتعديل من خلال التلاعب العمليات الفيزيولوجية للمركبات خارج الخلية وبين الخلايا ^10. وتشمل هذه ، العصبية نشطة (مثل الغلوتامات ^11،12) ورسله الثانية (مثل الكالسيوم ¹³⁾ وهرمونات الستيرويد (مثل حمض الريتينويك ^14). أخيرا ، تم عرض صور بوساطة السيطرة على تنشيط الجينات وإسكات في الزرد. ويمكن استخدام تنشيط ضوئي ثنائي الفوتون القائم على العقاقير في قفص [أليغنوكليوتيد] (morpholinos) وضربة قاضية لالرناوات الجينات واكتساب وظيفة ، في خلية السكان محدود من جنين يعيش ^15،16 الزرد.

باختصار ، واثنين من الفوتون المستندة إلى الصورة التنشيط في الأجنة الزرد يعيش هو : 1) دقيقة واحدة إلى صفوف الخلية اثنين على طول محاور ض س ، ص ،. 2) في الكمية ، يمكن التحكم مدى تنشيط ضوئي. 3) متعددة الاستخدامات ، يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من صور للتحويل البروتينات.

بفضل من المقرر أن برودسكي جينيا للرسومات الشكل ؛ فياتشيسلاف Kalchenko ، لوتز دوغلاس ، وليونيد رويتمان للحصول على المشورة والمساعدة التقنية مع uncaging اثنين الفوتون ؛ مايان Tahor وسليمان Elsadin للحصول على المساعدة التقنية ؛ أوفه Strahle لتوفير خط يرجى مراسلة وneurogenin1 عاموس Gutnick للتعليقات على هذه المخطوطة. ويدعم البحوث في المختبر Levkowitz من المؤسسة الألمانية الإسرائيلية (منحة رقم 183 / 2007) ؛ إسرائيل مؤسسة العلوم (منحة رقم 928/08) وهارييت ومارسيل ديكر مؤسسة. GL هو شاغل والتنمية تاورو الرئاسة شهادة في مجال البحوث الطبية الحيوية.