De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

La fotoactivación de compuestos de interés en un organismo vivo ha demostrado ser un enfoque valioso para investigar diversos procesos biológicos como el desarrollo embrionario, la señalización celular y la fisiología del adulto. En este sentido, el uso de multi-fotón microscopio permite fotoactivación cuantitativa de un determinado agente de la luz sólo responde en los tejidos profundos en una resolución única célula. Como embriones de pez cebra son ópticamente transparente, su desarrollo puede ser monitoreado en vivo. Estas características hacen que el pez cebra un organismo modelo ideal para el control de la actividad de una variedad de agentes químicos y proteínas de la luz enfocada. A continuación se describe el uso de la microscopía de dos fotones para inducir la activación de la jaula químicamente con fluoresceína, que a su vez nos permite seguir el destino de células en embriones de pez cebra en vivo. Nosotros usamos embriones expresar un punto de referencia en vivo genética (GFP) para localizar y orientar con precisión la presencia de células de interés. Este procedimiento también se puede utilizar para la activación inducida por la luz precisa de proteínas, hormonas, moléculas pequeñas y otros compuestos enjaulados.

Se describe un protocolo de marcado de células con fluoresceína en jaulas, sin embargo, otra foto activable por los tintes y las proteínas también se puede utilizar.

1. La inyección de fluoresceína Caged

1. Prepare solución al 5% de acciones (5 mg enjaulado-fluoresceína / 100 KCl 0,2 M l) de dextrano conjugado con 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB) enjaulados fluoresceína (10.000 MW dextrano, aniónicos, Invitrogen, sondas moleculares, Carlsbad, CA , cat.. D-3310). Alícuota y almacenar a -20 ° C. Tenga en cuenta que DMNB-jaula con fluoresceína es sensible a la luz y se debe mantener en la oscuridad.
2. Prepare una cubeta de inyección hechos de agarosa al 1% (Sigma, St. Louis, MO, cat.. A9539) como se describe en "El libro de pez cebra" ^1.
3. Preparar 2 litros de medio E3 mediante la dilución de una solución de 100 x acciones E3.
4. En la noche antes de la inyección, preparar las jaulas de apareamiento que separa el hombre (s) de la hembra (s) de la línea deseada transgénicos que expresan un punto de referencia visible fluorescente (GFP, RFP, etc) que se utiliza para localizar las células diana para la fotoactivación.
5. Prepare las agujas de inyección capilar (pared delgada capilares de vidrio de filamento, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, cat.. TW100F-6) con un extractor micropipeta (Instrumento Sutter, Novato, CA, P-97).
6. Descongelar una alícuota de 5% enjaulados fluoresceína en el hielo.
7. Diluir la solución al 5% enjaulados acciones de fluoresceína en KCl 0,2 M a una concentración final de 1%, y mantener en hielo. Evitar la exposición a la luz.
8. Apareamiento de configuración cruza preparado en el paso 4.
9. Recoge los huevos fertilizados en cuanto se establecen. Orientar de una célula de embriones etapa en el molde de inyección de agarosa recubierta de ^un E3.
10. Con una punta de microloader (Eppendorf, Hamburgo, Alemania, cat.. 5242 956.003) relleno de una aguja de inyección con aproximadamente 1 l de 1% enjaulados solución de fluoresceína.
11. Lugar cargado de aguja en un micromanipulador unido a una gasolina microinyector (neumático picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820).
12. Ajustar el volumen de inyección de 2-3NL e inyectar la jaula-fluoresceína directamente en el citoplasma de la célula. Inyectar un mínimo de 50 embriones por experimento.
13. Incubar los embriones en la oscuridad a 28,5 ° C en el E3 a la etapa de desarrollo deseado. Si los embriones de más de 24 horas después de la fecundación se analizan, añadir 0,1% feniltiourea (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat.. 22290-9) para inhibir la pigmentación.

2. Embrión de montaje

1. Prepare una solución fresca E2 (véase la parte de soluciones, se pueden almacenar a 4 ° C durante una semana).
2. Una capa de 60 mm cajas de Petri con una fina capa de agarosa al 1% disuelta en medio de E2.
3. Prepare 2% bajo punto de fusión de agarosa (Ultra Pure LMP agarosa, Invitrogen, Carlsbad, CA, el gato no 16520100..) Para incrustar: disolver la agarosa en agua destilada estéril doble por calentamiento por microondas hasta que hierva. Mantenga la tapa del tubo está abierto durante el calentamiento. Alícuota de 1 ml en tubos de microcentrífuga y mantenerse en un bloque de calentamiento a 72 º C.
4. Retire el corion de los embriones tirando suavemente del corion además con unas pinzas cortantes (No. 5). Mantener los embriones en la solución de E2 en un plato de agar-revestido (ver paso 2). Dechorionated embriones deben ser manejados con fuego pulido pipeta Pasteur de vidrio, ya que puede adherirse a las pipetas de polipropileno. Evite la exposición del embrión dechorionized a la atmósfera, estos embriones podrían ser dañados por la tensión superficial de líquidos.
5. Recoge los embriones seleccionados en un pequeño volumen de E2 con un fuego cristal pulido pipeta Pasteur, y el lugar en el embrión de 60 mm placa de Petri. Monte una gota (~ 150 l) de agarosa al 2% (paso 3) al lado del embrión. Rápidamente mezclar las dos gotas de obtener una homogeneidad final de ~ 1% de agarosa y se mezcla con un microscopio de disección orientar el embrión con la cara dorsal frente a la lente del objetivo.
6. Espere hasta que la agarosa se ha solidificado y se añade medio de E2 hasta que el embrión embebido está sumergido en un líquido. Es preferible obtener un solo embrión por placa, ya que puede ser liberado de la agarosa después de que el proceso de fotoactivación.

3. Fotoactivación

1. Utilizamos un Zeiss LSM 510 META NLO de dos fotones microscopio equipado con una banda ancha ajustable (700 1020nm) Mai Tai-HP-láser de femtosegundos de Spectraphysics.
2. Lugar al embrión montado en un soporte de la placa bajo el microscopio. La señal fluorescente en el embrión se visualiza usando 40x/0.8W agua Achroplan inmersos objetivo. Para los siguientes pasos que utilizamos no descanned detector (NDD) con filtro de paso de banda (BP) de 500-550nm.
3. Como requisito previo para el proceso de fotoactivación, obtener información espacial fluorescente de la región de interés mediante la adquisición de una serie de imágenes de la más ventral a la parte dorsal de la señal detectada fluorescente con dos fotones de longitud de onda del láser de 860nm (para la detección de buenas prácticas agrarias). Con este fin, la resolución se puede obtener suficiente con un período de 6μm entre cada plano focal adquirido.
4. Seleccione el destinoplano z para la fotoactivación y traer a esta región en foco. Dependiendo del propósito del experimento, la región de interés puede realizarse dentro o fuera de la señal GFP visible. Tomar una imagen en este plano-z. Guardar la imagen y mantenerla abierta en una ventana separada.
5. La longitud de onda de láser de dos fotones de 720nm y cuando el láser está en modo bloqueado abrir el 'Editar blanqueo "del menú. Definir la región de interés (ROI) para la fotoactivación de acuerdo con la imagen tomada en 860nm (paso 4) utilizando el menú "Definir la Región". Es crucial seleccionar el retorno de la inversión en esta imagen después de cambiar la longitud de onda de láser de 720nm, como la acción de este último cambia la x, y las posiciones del campo observado.
6. Ajustar los siguientes parámetros para la fotoactivación en el menú "Edición lejía" (ver paso 9): un poder) láser relativa, b) número de iteraciones, c) la velocidad de escaneo.
7. 'Bleach' de prensa en la ventana "Editar lejía" y esperar hasta que deje de láser.
8. Volver a 860nm, adquirir una imagen de un solo plano para evaluar la intensidad de los materiales que le correspondan fotoactivado y una segunda serie de la adquisición de imágenes para evaluar la Z-span (espesor) del dominio activado.
9. Considere los siguientes parámetros para la fotoactivación:
   1. Una forma empírica debe determinar las condiciones óptimas para la fotoactivación variando dos parámetros: la intensidad del láser y la duración de la fotoactivación. La potencia del láser relativa puede ser controlado por el acústico-óptica modulador (OMA) de transmisión. La duración de la foto-es una función del número de iteraciones y la velocidad de escaneo.
   2. Determinar el rango lineal de la intensidad de fluorescencia con el fin de evitar la saturación de la fluorescencia uncaged.
   3. Existe una correlación lineal entre la intensidad de fluorescencia obtenida de las moléculas uncaged y la duración del eje z de el clon fotoactivado ^2.

4. La detección de la fluoresceína Uncaged

1. Después de fotoactivación, aumentar los embriones en la oscuridad a 28,5 ° C en medio de E2 contiene 0,1% de PTU para prevenir la aparición de la pigmentación de la piel.
2. En la etapa de desarrollo deseado, extraer el embrión de la agarosa con un microscopio de disección. El uso de un bisturí señaló, crear una "V" en la incisión en forma de agarosa cerca del embrión, de manera que la "V" está apuntando hacia la cabeza del embrión. Coloque una pinza cerrada en el momento de la "V" cerca de la cabeza del embrión y empuje suavemente abra la pinza que separa la agarosa a lo largo de la longitud del embrión y la liberación del embrión en el medio.
3. Recoger los embriones con una pipeta Pasteur pulida al fuego y fijar con paraformaldehído (PFA, 4% en 1 x PBS, pH 7,2) ya sea para 3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
4. Retire la solución de fijación y enjuague 2-3 veces en PBST durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.
5. Lavado de embriones con el 100% de metanol durante 10 minutos, añada el metanol fresco y se incuba a 20 ° C durante al menos 2 horas.
6. Rehidratar embriones por incubaciones sucesivas (5 minutos cada uno) en una serie de metanol diluido en PBSTr: 80%, 60%, 40% y 20%. Lavado de 2 x 10 minutos en PBSTr.
7. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en 500 l de solución de bloqueo.
8. Añadir un anti-fosfatasa alcalina fluoresceína (AP) Los fragmentos Fab (Roche, Palo Alto, CA, cat.. 11426338910), diluido 1:500 en solución de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C (tubos de microcentrífuga a cabo en sus lados) .
9. Lavado de 5 x 15 minutos en PBST.
10. Lavar durante 5 minutos en 0,2 M de NaCl en TNT.
11. Lavar durante 5 minutos en 0,4 M de NaCl en TNT.
12. Equilibre 3 x 5 minutos en una solución recién preparada Prestain.
13. Disuelva una tableta de rápida Red (Roche, Palo Alto, CA, cat.. 11496549001) en 2 ml de solución Prestain. Se recomienda filtrar la solución utilizando papel Whatman N º 2 para omitir sin disolver las partículas. Por otra parte, la desaceleración de soluciones y utilizar el líquido sobrenadante claro.
14. Añadir 500 l solución Fast Red a cada tubo, se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente y el desarrollo del color del monitor hasta que aparezca la señal de fondo proporción se alcanza (20 minutos a varias horas). Si el fondo se desarrolla, la transferencia a 4 ° C. Después de una hora de incubación, añada una nueva solución rápida coloración roja.
15. Detener la reacción de tinción de 3 x 5 minutos lavados en PBST.
16. Fijar durante 20 minutos en PFA al 4% a temperatura ambiente.
17. Lavado de 2 x 5 minutos en PBST.
18. Embriones claro a través de una serie de 25%, 50% y 75% de glicerol en PBS hasta que los embriones se establecieron en la parte inferior del tubo. Los embriones pueden ser almacenados a 4 ° C durante unos días.

5. La visualización fluorescente de la zona Uncaged

1. Preparar un portaobjetos de microscopio para el montaje: el uso de una jeringa de 1 ml se aplican cuatro manchas de grasa de silicona transparente en la diapositiva, colocado a una distancia de unos 15 mm uno del otro. Monte el embrión en el Center en ~ 200 l de 75% de glicerol y colocar un cubreobjetos (n º 0; 18x18mm) en la parte superior y empuje suavemente contra la silicona hasta que la solución de glicerol ocupa la superficie entre las diapositivas.
2. Lugar al embrión montado en el escenario y lo pongo en foco con un objetivo de 40x. Adquirir una confocal Z-serie de imágenes con 488nm de argón y láser HeNe 543nm como la fuente de excitación.
3. El período de eje-z del dominio photoactivatated pueden ser analizadas utilizando la reconstrucción en 3D del embrión uncaged utilizando un software de análisis de imágenes.

6. Soluciones

7. Resultados representante

Un ejemplo de la utilización de la microscopía de dos fotones de photoactivate agentes en un embrión de pez cebra de vida se presenta. Utilizando un enfoque similar que ya trazó el linaje de los fotoactivado etiquetados progenitores neurales en el cerebro del pez cebra ^2,3. La figura 1 muestra fotoactivación de un colorante marcador fluoresceína conjugado enjaulados en la placa anterior neural de los embriones de pez cebra que lleva un neurog1:: GFP reportero transgén, que sirvió como un punto de referencia intrínseco en vivo.

Los embriones fueron inyectados con fluoresceína enjaulados en la etapa de célula y embebidas en agarosa en fase de capullo. A los 3 - 5-somite etapa de las coordenadas espaciales se midieron en el neurog1:: GFP embriones transgénicos para determinar la región de interés (ROI) para uncaging (Figura 1 A, A '). Nos uncaged el marcador linaje de fluoresceína en un dominio específico de la placa neural (fig. 1B, B '). Posteriormente, el destino de este subdominio dado etiquetados progenitoras neurales se determinó en prim5 (24 horas después de la fecundación), etapa por inmunotinción de la uncaged fluoresceína (Figura 1 C, C ').

La extensión de dos fotones uncaging láser, es decir, la intensidad de la fluorescencia uncaged y el espesor del dominio fotoactivado (z-span), se puede controlar mediante el ajuste de dos parámetros: la intensidad del láser y la duración. Este último puede ser controlado por el ajuste del número de iteración y la velocidad del análisis (véase la parte 3, el paso 9; Russek-Blum, 2009). En el ejemplo que se muestra en la Figura 1, se utilizó la potencia del láser con respecto de la transmisión de la OMA 12%, 20 repeticiones y velocidad de escaneado de 25,6 mseg / pixel. El uso de estos parámetros nos etiquetado como un retorno de la inversión que contiene las células y un 10.9 fotoactivado z útil de 30μm (~ 1-2 hileras de células).

Figura 1. Un resultado Representante de fotoactivación de fluoresceína enjaulado en embrión de pez cebra en vivo utilizando microscopía de dos fotones.

Representación esquemática (AC) y las imágenes representativas (A'-C ') del proceso de fotoactivación. Vivir embrión de pez cebra (A, A ') que expresa GFP bajo el control de neurogenina-1 promotor (neurog1:: GFP), que fue inyectado con jaula fluoresceína trazador en la fase de la celda 1. En el 3-5 - somite etapa, un área discreta del primordio del cerebro anterior (diencéfalo) fue fotoactivado y el uncaged fluoresceína trazador de tinta puede ser detectado (B, B '). Después del procedimiento fotoactivación, el embrión se incuba a 28,5 º C y las células cerebrales que contienen la fluoresceína uncaged fueron rastreadas por los anti-fluoresceína inmunotinción a 24 horas después de la fecundación (HPF, C, C '). Dien, Diencéfalo;. Tel, telencéfalo..

Foto activable compuestos son moléculas cuya función es enmascarados hasta que se ilumina con una longitud de onda específica (generalmente UV), que induce una reacción fotoquímica que convierte las moléculas en un estado biológicamente o químicamente activos. Estas sondas proporcionan herramientas muy poderosas en la investigación de biología celular, ya que la activación puede ser controlada con precisión temporal y espacialmente, al limitar su exposición a la luz.

La ventaja significativa de multi-fotón microscopio óptico es la penetración relativamente profundas y fototoxicidad inespecíficos reducido. Para el proceso de activación, dos fotones de baja energía debe ser absorbido por el compuesto foto-activable, al mismo tiempo. Como la probabilidad de un evento depende de la densidad de fotones, la activación se mantiene restringida al plano focal. La región de activación por lo tanto puede ser manipulado de forma selectiva en un volumen definido en el tejido.

Se presenta un protocolo para la fotoactivación de fluoresceína enjaulado con microscopia de dos fotones en embriones de pez cebra en vivo. En el ejemplo específico que se muestra en este documento se utiliza la microscopía de dos fotones para inducir la jaula-fluoresceína fotólisis con el fin de marcar las células en las primeras etapas embrionarias y, posteriormente, trazar el linaje de las células marcadas en el cerebro del pez cebra en desarrollo. En comparación con la fotoactivación por láser y lámpara de flash, lo que se traduce en la activación de la tinta del marcador en unas pocas decenas de células y la falta de resolución en el eje z ^4,5, dos fotones basado en foto-puede llegar a una resolución espacial de unos pocos micrómetros de obtener una resolución axial de hileras de células proximal uno hasta dos ^2,3.

El procedimiento descrito en este documento puede ser utilizado para la activación de una variedad de compuestos con una resolución única célula de especímenes vivos. Por ejemplo, la proteína Kaede también se puede utilizar a las células de la etiqueta a partir de su fotoconversión de un color verde a rojo proteína fluorescenct ^6,7. Otras proteínas activadas por la luz que se pueden aplicar son el canal de iones de luz cerrada, canalrodopsina, que pueden modular la actividad neuronal ⁸ y fotosensibilizadores como KillerRed, que induce la muerte celular a la irradiación de la luz ^9.

Una gran variedad de moléculas de jaula han sido reportados, lo que permite la modulación de procesos fisiológicos por la manipulación de compuestos extracelulares e intracelulares ^10. Estos incluyen, los neurotransmisores activos (por ejemplo, el glutamato ^11,12) y segundos mensajeros (por ejemplo, calcio ¹³⁾ y las hormonas esteroides (por ejemplo, ácido retinoico ^14). Por último, la foto-mediada por el control de la activación de genes y silenciar en el pez cebra se ha introducido. Fotoactivación de dos fotones basados ​​en jaulas de oligonucleótidos antisentido (morfolinos) y ARN pueden ser utilizados para derribo de genes y ganancia de función de la población celular restringida de un embrión de pez cebra en vivo ^15,16.

En resumen, dos fotones basados ​​en la foto-activación en embriones de pez cebra en vivo es: 1) precisa de una a dos hileras de células a lo largo de x, y, z.. 2) cuantitativo-en la medida de fotoactivación se puede controlar. 3) Versátil: se puede aplicar para una variedad de foto-convertible proteínas.

Se agradece a Genia Brodsky de la figura de gráficos, Vyacheslav Kalchenko, Lutz Douglas, y Leonid Roitman de asesoramiento y asistencia técnica con el uncaging de dos fotones, Maayan Tahor y Suliman Elsadin de asistencia técnica; Uwe Strähle por la amabilidad de ofrecer la línea de reportero y neurogenin1 Amos Gutnick a los comentarios de este manuscrito. La investigación en el laboratorio Levkowitz con el apoyo de la Fundación alemana-israelí (el número de concesión 183/2007), Israel Science Foundation (subvención número 928/08) y la Harriet y Marcel Dekker Fundación. GL es un titular de la Cátedra de Desarrollo Tauro carrera en la investigación biomédica.