Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Photoaktivierung von Zielverbindungen in einem lebenden Organismus hat ein wertvoller Ansatz erwiesen, um verschiedene biologische Prozesse wie der embryonalen Entwicklung, zelluläre Signalwege und Erwachsenen Physiologie zu untersuchen. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie quantitative Photoaktivierung von einem bestimmten Licht reagieren Agenten in tiefe Gewebe auf einer einzigen Zelle Auflösung. Als Zebrafischembryonen optisch transparent sind, kann ihre Entwicklung in vivo beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen den Zebrafisch einen perfekten Modell-Organismus für die Steuerung der Aktivität einer Vielzahl von chemischen Stoffen und Proteine, die durch konzentriertes Licht. Hier beschreiben wir den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Aktivierung von chemisch Käfig Fluorescein, was wiederum ermöglicht es uns, Zell-Schicksal in lebenden Zebrafisch-Embryonen folgen zu induzieren. Wir verwenden Embryonen Ausdruck einer Live-genetische Wahrzeichen (GFP) zu lokalisieren und zielgenauer alle Zellen von Interesse. Dieses Verfahren kann in ähnlicher Weise für präzise Licht induzierte Aktivierung von Proteinen, Hormonen, kleinen Molekülen und anderen Käfig-Verbindungen verwendet werden.

Wir beschreiben ein Protokoll der Markierung von Zellen mit Käfig Fluorescein, können jedoch auch andere photoaktivierbare Farbstoffe und Proteine ​​in ähnlicher Weise verwendet werden.

1. Die Injektion von Caged Fluorescein

1. Bereiten Sie 5% Stammlösung (5mg Käfig-Fluorescein / 100 ul 0,2 M KCl) von Dextran-konjugierten 4,5-Dimethoxy-2-Nitrobenzyl (DMNB) caged Fluorescein (10.000 MW Dextran, anionische, Invitrogen, molekulare Sonden, Carlsbad, CA , cat. Nr. D-3310). Aliquotieren und lagern in -20 ° C. Beachten Sie, dass DMNB-Käfig Fluorescein lichtempfindlich und sollte im Dunkeln gehalten werden.
2. Bereiten Sie eine Injektion Trog 1% Agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Nr. A9539), wie in "Der Zebrafisch Buch" ¹ beschrieben.
3. Bereiten Sie 2 Liter E3 Medium durch Verdünnen einer 100 x E3 Stammlösung.
4. Am Abend vor der Injektion, bereiten Paarung Käfigen Trennung der männlichen (n) aus der weiblichen (n) des gewünschten transgenen Linie Ausdruck einer sichtbaren fluoreszierenden Wahrzeichen (GFP, RFP etc.) zur Lokalisierung der Zielzellen für Photoaktivierung.
5. Bereiten Kapillare Injektionsnadeln (Thin Wall Glaskapillaren mit Filament, World Precision Instruments, Sarasota, FL, cat. Nr. TW100F-6) mit einer Mikropipette Puller (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97).
6. Tauwetter ein Aliquot von 5% im Käfig Fluorescein auf Eis.
7. Verdünnen Sie die 5% Käfig Fluorescein Stammlösung in 0,2 M KCl bis zu einer Endkonzentration von 1%, und halten Sie auf dem Eis. Vermeiden Sie Belichtung.
8. Setup-Paarung Kreuze vorbereitet in Schritt 4.
9. Sammeln Sie die befruchteten Eier, sobald sie festgelegt sind. Orient one-Zell-Stadium Embryos in die Agarose Spritzgießwerkzeug mit E3 ¹ überlagert.
10. Mit einem Microloader Spitze (Eppendorf, Hamburg, Deutschland, Katze. Nr. 5242 956,003) Verfüllung einer Injektionsnadel mit ~ 1 ul 1% Käfig Fluorescein-Lösung.
11. Ort geladen Nadel in einem Mikromanipulator an einem gasbetriebenen Mikroinjektor (pneumatisch picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820).
12. Passen Sie das Injektionsvolumen zu 2-3NL und spritzen den Käfig-Fluorescein direkt in das Zellplasma. Anschließend muss ein Minimum von 50 Embryonen pro Versuch.
13. Inkubieren Embryonen im Dunkeln bei 28,5 ° C in E3, um die gewünschte Entwicklungsstadium. Wenn Embryonen älter als 24 Stunden nach der Befruchtung untersucht werden, fügen Sie 0,1% Phenylthioharnstoff (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Nr. 22290-9), um Pigmentflecken zu hemmen.

2. Embryo Montage

1. Bereiten Sie frische E2-Lösung (siehe Lösungen Teil; kann bei 4 ° C für eine Woche gelagert werden).
2. Coat 60 mm Petrischalen mit einer dünnen Schicht von 1% Agarose in E2 Medium gelöst.
3. Bereiten Sie 2% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (Ultra Pure LMP Agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, Kat. Nr. 16520100..) Für die Einbettung: Man löst die Agarose in sterilem doppelt destilliertem Wasser durch Mikrowellenheizung zum Kochen bringen. Halten Sie den Schlauch der Kappe öffnen während der Erwärmung. Aliquot 1 mL in Mikrozentrifugenröhrchen und halten in einem Heizblock bei 72 ° C.
4. Entfernen Sie das Chorion der Embryonen durch leichtes Ziehen des Chorion auseinander mit scharfen Pinzette (Nr. 5). Keep Embryonen in E2-Lösung auf einem Agar-beschichtete Schale (siehe Schritt 2). Dechorionated Embryonen sollten mit dem Feuer-poliertem Glas Pasteurpipette behandelt werden, da sie auf Polypropylen Pipette kann bleiben. Vermeiden Sie es, die dechorionized Embryo in die Luft als diese Embryonen durch die Flüssigkeit Oberflächenspannung beschädigt werden könnte.
5. Sammeln Sie die ausgewählten Embryo in einem kleinen Volumen E2 mit einem Feuer-poliertem Glas Pasteurpipette und Ort der Embryo auf 60 mm Petrischale. Montieren Sie einen Tropfen (~ 150 mL) von 2% Agarose (Schritt 3) neben dem Embryo. Schnell mischen die zwei Tropfen zu einem homogenen letzten ~ 1% igen Mischung zu erhalten und mit einem Binokular Orientierung der Embryo mit seiner dorsalen Seite nach dem Objektiv.
6. Warten Sie, bis die Agarose erstarrt ist, und fügen E2 medium bis die eingebettete Embryo in Flüssigkeit eingetaucht ist. Es wird bevorzugt auf einen einzigen Embryo pro Schale erhalten, wie es aus der Agarose nach der Photoaktivierung freigesetzt werden.

3. Photoaktivierung

1. Wir verwenden ein Zeiss LSM 510 META NLO Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Breitband-abstimmbaren (700-1020nm) Mai Tai-HP-Femtosekunden-Laser aus SpectraPhysics ausgestattet.
2. Setzen Sie den montierten Embryo auf einem Teller Halter unter dem Mikroskop. Die fluoreszierenden Meilenstein in der Embryo wird visualisiert 40x/0.8W Achroplan Wasser getaucht Ziel. Für die folgenden Schritte, die wir verwenden nicht-descanned Detektor (NDD) mit Bandpassfilter (BP) von 500-550nm.
3. Als Voraussetzung für die Photoaktivierung Prozess erhalten räumliche fluoreszierenden Informationen der Region von Interesse durch den Erwerb von Bildserien aus den ventral nach dorsal Teil des detektierten Fluoreszenzsignal mit Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge von 860nm (für GFP-Detektion). Zu diesem Zweck kann eine ausreichende Auflösung unter Verwendung einer Spannweite von 6μm zwischen den einzelnen erworbenen Brennebene werden.
4. Wählen Sie das Zielz-Ebene für die Photoaktivierung und bringen diese Region in den Fokus. Je nach Zweck des Experiments kann die Region von Interesse entweder innerhalb oder außerhalb der GFP sichtbares Wahrzeichen werden. Nehmen Sie ein einzelnes Bild in diesem z-Ebene. Speichern Sie das Bild und halten Sie sie öffnen sich in einem separaten Fenster.
5. Stellen Sie die Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge 720 nm und wenn der Laser in modengekoppelten öffnen Sie das 'Edit bleach "-Menü ist. Definieren Sie die Region of Interest (ROI) für die Photoaktivierung nach dem Bild bei 860nm (Schritt 4) mit dem "Define Region"-Menü. Es ist entscheidend, um den ROI auf das Bild nach der Verschiebung der Wellenlänge des Lasers bis 720 nm, wie diese Aktion ändert die x-, y-Positionen der beobachteten Feld auszuwählen.
6. Passen Sie die folgenden Parameter für Photoaktivierung in der 'Edit bleach "-Menü (siehe Schritt 9): a) relativ Laserleistung; b) Anzahl der Iterationen; c) Scan-Geschwindigkeit.
7. Drücken Sie 'Bleach' in der 'Edit Bleiche "Fenster und bis der Laser aufhört zu warten.
8. Wechseln Sie wieder zu 860nm, erwerben eine einzige Ebene Bild, um die Intensität des resultierenden photoaktivierte Material und eine zweite Reihe von Bildaufnahme, die Z-span (Dicke) der aktivierten Domain bewerten zu bewerten.
9. Betrachten Sie die folgenden Parameter für Photoaktivierung:
   1. Man sollte empirisch ermitteln die optimalen Bedingungen für die Photoaktivierung durch Variation zwei Parameter: Laser-Intensität und Dauer der Photoaktivierung. Die relative Laserleistung kann durch den akusto-optischen Modulator (AOM) Übertragung gesteuert werden. Die Dauer der Photoaktivierung ist eine Funktion der Anzahl der Iterationen und Scan-Geschwindigkeit.
   2. Bestimmen Sie den linearen Bereich der Fluoreszenz-Intensität, um die Sättigung des uncaged Fluoreszenz zu vermeiden.
   3. Es gibt eine lineare Korrelation zwischen den erhaltenen Fluoreszenz-Intensität des uncaged Moleküle und die z-Achse Spannweite der photoaktivierte Klon ^2.

4. Nachweis der Uncaged Fluorescein

1. Nach Photoaktivierung, heben die Embryonen im Dunkeln bei 28,5 ° C in E2-Medium mit 0,1% PTU, um das Aussehen der Pigmentierung der Haut zu verhindern.
2. Bei der gewünschten Entwicklungsstadium, entfernen Sie den Embryo aus der Agarose unter einem Binokular. Mit einem spitzen Skalpell, ein "V"-förmigen Einschnitt in die Agarose in der Nähe des Embryo, so dass die "V" ist auf den Embryo Kopf zeigt. Legen Sie eine geschlossene Pinzette an der Spitze des "V" in der Nähe des Kopfes des Embryos und vorsichtig öffnen Sie die Zange Trennung der Agarose entlang der Länge des Embryos und die Freigabe der Embryo in das Medium.
3. Sammeln Sie die Embryonen mit einem feuerpolierte Pasteurpipette und fix mit Paraformaldehyd (PFA, 4% in 1 x PBS, pH 7,2) entweder für 3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
4. Entfernen Sie die Fixierlösung und spülen Sie 2-3 mal in PBST für mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Wash Embryonen mit 100% Methanol für 10 min, füllen mit frischem Methanol und Inkubieren bei -20 ° C für mindestens 2 Stunden.
6. Rehydrieren Embryonen durch aufeinanderfolgende Inkubationen (5 min jeweils) in einer Reihe von verdünntem Methanol in PBSTr: 80%, 60%, 40% und 20%. Wash 2 x 10 Minuten in PBSTr.
7. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 500 ul der Blocking-Lösung.
8. Fügen Sie ein Anti-Fluorescein-alkalische Phosphatase (AP) Fab-Fragmente (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nr. 11426338910), verdünnt 1:500 in Blocking-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C (statt Mikrozentrifugenröhrchen auf ihren Seiten) .
9. Wash 5 x 15 Minuten in PBST.
10. Wash für 5 Minuten in 0,2 M NaCl in TNT.
11. Wash für 5 Minuten in 0,4 M NaCl in TNT.
12. Lösungen 3 x 5 Minuten in frisch zubereiteten Prestain Lösung.
13. Lösen Sie eine Fast Red Tablette (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nr. 11496549001) in 2 mL Prestain Lösung. Es wird empfohlen, die Lösung mit Whatman Nr. 2 Papier zu un-gelösten Teilchen weglassen Filter. Alternativ-Spin-Down-Lösung und die klare Flüssigkeit.
14. Add 500 mL Fast Red-Lösung in jedes Röhrchen im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren und überwachen Farbentwicklung, bis das gewünschte Signal-Hintergrund-Verhältnis erreicht ist (20 Minuten bis zu mehreren Stunden). Wenn Hintergrund entwickelt, bis 4 Transfer ° C. Nach einer Stunde Inkubation mit einem neuen Fast Red-Färbelösung wieder aufzufüllen.
15. Stoppen Sie die Farbreaktion mit 3 x 5 Minuten Waschen in PBST.
16. Fix für 20 Minuten in 4% PFA bei Raumtemperatur.
17. Wash 2 x 5 Minuten in PBST.
18. Klare Embryonen durch eine Reihe von 25%, 50% und 75% Glycerin in PBS bis Embryonen werden am Ende des Rohres nieder. Embryonen können bei 4 ° C für ein paar Tage gelagert werden.

5. Fluorescent Visualisierung der Uncaged Bereich

1. Bereiten Sie einen Objektträger für die Montage: mit einer 1 ml Spritze gelten vier Punkten klarer Silikonfett auf der Folie, in einem Abstand von ~ 15mm voneinander entfernt. Montieren Sie den Embryo in der center in ~ 200 ul von 75% Glycerin und setzen Sie ein Deckglas (Nr. 0; 18x18mm) auf der Oberseite und schieben Sie es gegen das Silikon, bis die Glycerin-Lösung nimmt eine Fläche zwischen den Folien.
2. Setzen Sie den montierten Embryo auf die Bühne und bringen sie in den Fokus mit einem 40x-Objektiv. Erwerben eines konfokalen Z-Serie von Bildern mit 488nm und 543nm Argon HeNe-Laser als Anregungsquelle.
3. Die z-Achse Spannweite der photoactivatated Domain kann unter Verwendung 3D-Rekonstruktion der uncaged Embryo mit Hilfe eines Bildanalyse-Software.

6. Lösungen

7. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für die Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie an Agenten in einem lebenden Zebrafisch-Embryos photoaktivieren vorgestellt. Mit einem ähnlichen Ansatz, den wir bisher verfolgt die Linie der photoaktivierte gekennzeichnet neuronalen Vorläuferzellen im Zebrafisch Gehirn ^2,3. Abbildung 1 zeigt Photoaktivierung von einem umzäunten Fluorescein-konjugierten Markierungsfarbstoff in vorderen Neuralplatte der Zebrafisch-Embryonen Tragen einer neurog1:: GFP-Reporter-Transgen, das als Live-intrinsische Wahrzeichen diente.

Die Embryonen wurden mit Käfig Fluorescein auf der einen Zell-Stadium injiziert und eingebettet in Agarose bei Knospe. Bei 3 bis 5-Somiten-Stadium die räumlichen Koordinaten wurden in den neurog1 gemessen:: gfp transgenen Embryos in die Region of Interest (ROI) für Uncaging (Abbildung 1A, A ') zu bestimmen. Wir uncaged die Fluorescein Linie Tracer in einer bestimmten Domäne der Neuralplatte (Abb. 1B, B '). Anschließend wurde das Schicksal dieser gegebenen gekennzeichnet neuralen Vorläuferzellen Subdomain bei prim5 (24 Stunden nach der Befruchtung) Stufe durch Immunfärbung der uncaged Fluorescein (Abbildung 1C, C ') bestimmt.

Das Ausmaß der Zwei-Photonen-Laser-Uncaging, dh die Intensität des uncaged Fluoreszenz und die Dicke der photoaktivierte Domain (z-span), kann durch Verstellen zwei Parameter gesteuert werden: Laser-Intensität und Dauer. Letzteres kann durch Anpassung der Iteration Nummer und Scan-Geschwindigkeit gesteuert werden (siehe Teil 3, Schritt 9; Russek-Blum, 2009). In dem Beispiel in Abbildung 1 dargestellt, haben wir relativ Laserleistung von 12% AOM Transmission, 20 Iterationen und Scan-Geschwindigkeit von 25,6 us / Pixel. Mit diesen Einstellungen haben wir beschriftet einen ROI mit 9-10 Zellen und einer photoaktivierte z-Spannweite von 30 um (~ 1-2 Zellreihen).

Abbildung 1. Ein repräsentatives Ergebnis der Photoaktivierung von caged Fluorescein in Live Zebrafischembryo mit Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Schematische Darstellung (AC) und repräsentative Bilder (A'-C ') der Photoaktivierung Prozess. Live-Zebrafischembryo (A, A '), die GFP unter der Kontrolle von Neurogenin-1-Promotor (neurog1:: gfp), die mit Käfig Fluorescein Markierungsfarbstoff an der 1-Zell-Stadium injiziert wurde. Bei der 3-5 - Somiten-Stadium wurde ein diskreter Bereich des Vorderhirns Primordium (Zwischenhirn) photoaktivierte und die uncaged Fluorescein Markierungsfarbstoff nachgewiesen werden (B, B ') werden. Im Anschluss an die Photoaktivierung Verfahren wurde der Embryo bei 28,5 ° C inkubiert und Gehirnzellen mit dem uncaged Fluorescein durch anti-Fluorescein Immunfärbung wurden 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf; C, C ') zurückgeführt. Dien, Diencephalon;. Tel, Telencephalon..

Foto-aktivierbaren Verbindungen sind Moleküle, deren Funktion es ist maskiert, bis sie mit einer bestimmten Wellenlänge (in der Regel UV), induzieren eine photochemische Reaktion, dass die Moleküle umgewandelt in eine biologisch oder chemisch aktiven Zustand sind beleuchtet. Diese Sonden liefern eine sehr mächtige Werkzeuge in der zellbiologischen Forschung, da die Aktivierung genau gesteuert werden zeitlich und räumlich durch die Begrenzung ihrer Belichtung.

Der wesentliche Vorteil der Multi-Photonen-Mikroskopie ist die relativ tiefen optischen Durchbruch und reduzierte unspezifische Phototoxizität. Für die Aktivierung müssen zwei Photonen niedriger Energie durch die photoaktivierbare Verbindung zur selben Zeit aufgenommen werden. Da die Wahrscheinlichkeit eines solchen Ereignisses ist abhängig von der Photonendichte, bleibt die Aktivierung beschränkt auf die Bildebene. Die Aktivierung Region kann daher gezielt in ein definiertes Volumen innerhalb des Gewebes manipuliert werden.

Wir präsentieren ein Protokoll für die Photoaktivierung von caged Fluorescein mit Zwei-Photonen-Mikroskopie in lebenden Zebrafisch-Embryonen. In dem konkreten Beispiel hier verwenden wir zwei-Photonen-Mikroskopie zum Käfig-Fluorescein Photolyse induzieren, um Zellen in einem frühen embryonalen Stadien markieren und danach verfolgen die Linie der markierten Zellen in den Entwicklungsländern Zebrafisch Gehirn dargestellt. Im Vergleich zu Photoaktivierung durch Laser-und Flash-Lampe, die in der Aktivierung der Markierungsfarbstoff Ergebnisse in ein paar Dutzend Zellen und der Mangel an Auflösung in der z-Achse ^4,5, Zwei-Photonen-basierte Photoaktivierung erreichen eine räumliche Auflösung von wenigen Mikrometern zu erhalten axiale Auflösung eines proximal 1-2 Zellreihen ^2,3.

Das Verfahren berichtet, können die hierin für die Aktivierung einer Vielzahl von Verbindungen in einer einzigen Zelle Auflösung in lebende Exemplare genutzt werden. Zum Beispiel kann die Kaede Protein ähnlich wie Label-Zellen werden nach ihrer Photokonversion von einem grün auf rot fluorescenct Protein ^6,7 verwendet. Andere Licht-aktivierte Proteine, die angewendet werden können, sind die Licht-Ionenkanal, Channelrhodopsin, die modulieren neuronale Aktivität ⁸ und Photosensibilisatoren wie KillerRed, die Zelltod nach Bestrahlung mit Licht ⁹ kann.

Eine Vielzahl von Käfig-Moleküle sind berichtet worden, so dass Modulation von physiologischen Prozessen durch Manipulation der extra-und intrazellulären Verbindungen ^10. Dazu zählen aktive Neurotransmitter (zB Glutamat ^11,12) und sekundäre Botenstoffe (z. B. Calcium ¹³⁾ und Steroidhormone (zB Retinsäure ^14). Schließlich hat Foto-vermittelte Kontrolle der Gen-Aktivierung und dem Silencing in Zebrafisch eingeführt. Zwei-Photonen-basierte Photoaktivierung von caged Antisense-Oligonukleotiden (Morpholino) und RNAs kann für die Gen-Knockdown und gain-of-function in eingeschränkten Zellpopulation einer Live Zebrafischembryo ^15,16 verwendet werden.

In der Summe ist der Zwei-Photonen-basierten Foto-Aktivierung in lebenden Zebrafisch-Embryonen: 1) Precise-01.59 Zellreihen entlang x, y, z-Achsen. 2) Quantitative-das Ausmaß der Photoaktivierung gesteuert werden kann. 3) Versatile-kann für eine Vielzahl von Foto-Cabrio Proteine ​​angewendet werden.

Dank gebührt Genia Brodsky für Bild-Grafikprozessor; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, und Leonid Roitman für technische Beratung und Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Uncaging; Maayan Tahor und Suliman Elsadin für technische Hilfe, Uwe Strähle für die freundliche Bereitstellung der neurogenin1 Reporter Linie und Amos Gutnick für Kommentare zu diesem Manuskript. Israel Science Foundation (Grant-Nummer 928/08) und die Harriet & Marcel Dekker Foundation; Die Forschung in der Levkowitz Labor wird durch die Deutsch-Israelische Stiftung (Förderkennzeichen 183/2007) unterstützt. GL ist ein Inhaber des Tauro Career Development Lehrstuhls für Biomedizinische Forschung.