Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Многофотонная микроскопия позволяет управлять фотонами малых энергий с глубоким проникновением оптических и снижения фототоксичности. Мы описываем использование этой технологии для живых маркировки ячейку в данио эмбрионов. Этот протокол можно легко адаптировать для фото-индукции различных световых проблематику молекул.

Фотоактивация целевых соединений в живом организме оказалось ценным подход к исследованию различных биологических процессов, таких как эмбрионального развития, клеточной сигнализации и взрослых физиологии. В этом отношении использование многофотонной микроскопии позволяет количественные фотоактивации данной свет реагировать агент в глубоких тканей в одной резолюции клетки. Как эмбрионов данио оптически прозрачны, их развитие можно наблюдать в естественных условиях. Эти черты делают данио совершенный организм модели для управления деятельностью различных химических веществ и белков сфокусированный свет. Здесь мы опишем использование двух-фотонной микроскопии, чтобы побудить активации химически клетке флуоресцеина, который, в свою очередь, позволяет проследить судьбу клетки в живых эмбрионов данио. Мы используем эмбрионов выражения жить генетических ориентир (GFP), чтобы найти и точно ориентировать любой клетки интерес. Эта процедура может быть так же использован для точного света индуцированной активации белков, гормонов, малых молекул и других клетках соединений.

Мы опишем протокол клеточной маркировке использованием флуоресцеина клетке, однако, и другие фото-активируемые красители и белки могут быть использованы аналогичным образом.

1. Инъекция клетке Fluorescein

1. Подготовка 5% маточного раствора (5 мг клетке-флуоресцеина / 100 мкл 0,2 М KCl) декстрана-сопряженных 4,5-диметокси-2-нитробензиловый (DMNB) клетке флуоресцеина (10000 МВт декстран, анионные, Invitrogen, молекулярные зонды, Карлсбад, Калифорния , кот. нет. D-3310). Алиготе и хранить в -20 ° C. Обратите внимание, что DMNB-клетке флуоресцеина чувствителен к свету и должны храниться в темноте.
2. Подготовка инъекций корыта сделаны из 1% агарозы (Sigma, Сент-Луис, Миссури, кат. Нет. A9539), как описано в "данио книгу" ^1.
3. Подготовка 2 литра E3 среду путем разбавления 100 х E3 маточного раствора.
4. Вечером перед инъекцией, подготовить спаривания клетки разделяющая мужчин (ы) из женщин (ей) нужной трансгенной линии выражения видимый ориентир флуоресцентные (GFP, ППП и т.п.), используемых для локализации клеток-мишеней для фотоактивации.
5. Подготовка капиллярных игл для инъекций (Thin Wall стеклянных капилляров с нитью, инструменты Всемирного Precision, Сарасоте, штат Флорида, кот. Нет. TW100F-6) с помощью микропипетки съемник (Саттер Инструмент, Новато, Калифорния, Р-97).
6. Оттепель аликвоту 5% клетке флуоресцеина на льду.
7. Развести 5% клетке флуоресцеина маточного раствора в 0,2 М KCl до конечной концентрации 1%, и держать на льду. Избегайте воздействия света.
8. Установка крестов спаривания подготовлен в шаге 4.
9. Сбор оплодотворенных яйцеклеток, как только они проложены. Восток один-клеточной стадии эмбрионов в форме инъекций агарозном обложил E3 ^1.
10. Использование microloader наконечник (Eppendorf, Гамбург, Германия, кот. Нет. 956,003 5242) засыпки инъекционной иглой с ~ 1 мкл 1% клетке флуоресцеина решение.
11. Место загружены иглу в микроманипулятора придается газе microinjector (пневматический picopump, Всемирный точных приборов, Сарасоте, штат Флорида, PV820).
12. Отрегулируйте объемом впрыска до 2-3NL и ввести в клетке-флуоресцеина непосредственно в цитоплазме клетки. Inject минимум 50 эмбрионов в эксперименте.
13. Инкубируйте эмбрионов в темноте при 28,5 ° С в Е3, чтобы желаемое стадии развития. Если эмбрионы старше 24 часа после оплодотворения, анализируются, добавить 0,1% фенилтиомочевиной (ПТУ, Sigma, Сент-Луис, Миссури, кат. Нет. 22290-9) ингибировать пигментации.

2. Эмбрион Монтаж

1. Подготовка свежий раствор Е2 (см. решения части; можно хранить при температуре 4 ° С в течение недели).
2. Пальто 60 мм чашки Петри с тонким слоем 1% агарозном растворенных в среде E2.
3. Подготовка 2% низкой температурой плавления агарозы (Ultra Pure LMP агарозы, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, кошка не 16520100..) Для встраивания: растворить агарозы в стерильной дистиллированной воде микроволнового нагрева до кипения. Держите крышку трубки открыты во время нагревания. Алиготе 1 мл в микроцентрифужных труб и иметь в блоке нагрева при 72 ° C.
4. Удалить chorions из эмбрионов, осторожно потянув за исключением хориона с острым пинцетом (№ 5). Держите эмбрионы в раствор E2 на агар-покрытием блюдо (см. шаг 2). Dechorionated эмбрионов следует обращаться с огнем, полированное стекло пипетки Пастера, как они могут прилипнуть к полипропилена пипеток. Не подвергайте dechorionized эмбриона в воздух в эти эмбрионы могут быть повреждены поверхностного натяжения жидкости.
5. Сбор выбранного эмбриона в небольшом объеме E2 использованием пожарной полированное стекло пипетки Пастера и место эмбриона на 60 мм блюдо Петри. Горы падение (~ 150 мкл) в 2% агарозном (шаг 3) у эмбриона. Быстро перемешать две капли для получения однородной окончательного ~ 1% агарозном смеси и использовании рассекает микроскопом ориентироваться эмбриона с его спинной стороне, обращенной объектив.
6. Подождите, пока агарозном укрепил и добавить E2 среды до встроенной зародыш погружен в жидкость. Желательно, чтобы получить один эмбрион за блюдо, как оно может быть освобождено от агарозы после фотоактивации процесса.

3. Фотоактивация

1. Мы используем Zeiss LSM 510 META NLO двухфотонного микроскопа, снабженного широкополосных перестраиваемых (700-1020nm) Mai Tai-HP-фемтосекундного лазера от Spectraphysics.
2. Место установлен эмбриона на пластине держателя под микроскопом. Флуоресцентные вехой в эмбрион визуализируется использованием 40x/0.8W Achroplan воды погруженной цели. Для следующих шагов, которые мы использовать не descanned детектора (NDD) с полосовой фильтр (BP) в 500-550нм.
3. В качестве предварительного условия для фотоактивации процесса, получения пространственной информации флуоресцентные области интереса, приобретая изображение серии из наиболее вентральной к спинной части обнаружили флуоресцентный сигнал с двухфотонной лазер длиной волны 860nm (для обнаружения GFP). Для этого достаточное разрешение можно получить, используя промежуток между 6 мкм каждый приобретенный фокальной плоскости.
4. Выберите целевуюг-плоскости для фотоактивации и принести этот регион в фокусе. В зависимости от цели эксперимента, область интереса может быть внутри или вне GFP видимый ориентир. Возьмите одного изображения в этом г-плоскости. Сохранить изображение и сохранить его открыть в отдельном окне.
5. Установить двухфотонного длины волны лазера на 720nm и когда лазер в режиме синхронизации открытия меню "Изменить отбеливателя. Определить области интереса (ROI) для фотоактивации по образу принято на 860nm (Шаг 4) с помощью меню "Определить Регион». Очень важно, чтобы выбрать ROI на этом изображении после сдвига длины волны лазера на 720nm в качестве последнего действия изменения х, у позициям наблюдается поле.
6. Настройте следующие параметры для фотоактивации в меню "Изменить отбеливатель" (см. пункт 9): а) относительно мощности лазера, б) число итераций, в) скорость проверки.
7. "Bleach" Пресса в окне "Изменить отбеливатель" и ждать, пока лазер останавливается.
8. Вернитесь к 860nm, приобретают единый образ плоскости для оценки интенсивности в результате фотоактивируемые материала и второй серии получения изображений для оценки Z-диапазона (толщина) активированного домена.
9. Рассмотрим следующие параметры для фотоактивации:
   1. Надо эмпирически определить оптимальные условия для фотоактивации путем изменения двух параметров: интенсивности лазерного излучения и продолжительность фотоактивации. Относительная мощность лазера можно управлять с помощью акустооптического модулятора (АОМ) передачи. Продолжительность фотоактивации является функцией от числа итераций и скорости проверки.
   2. Определить линейный диапазон интенсивности флуоресценции, чтобы избежать насыщения Uncaged флуоресценции.
   3. Существует линейная корреляция между полученными интенсивности флуоресценции Uncaged молекул и оси промежуток фотоактивируемые клон ^2.

4. Обнаружение Uncaged Fluorescein

1. После фотоактивации, поднять эмбрионов в темноте при температуре 28,5 ° С в среде E2, содержащий 0,1% ПТУ, чтобы предотвратить появление пигментации кожи.
2. В нужном стадии развития, удалить эмбрион из агарозы при вскрытии микроскопом. Использование отметил скальпель, создать "V" образный разрез в агарозном возле эмбриона, так что "V" направлен к голове эмбриона. Место закрытых щипцов в точке "В" у изголовья эмбриона и аккуратно нажмите на открытом щипцы разделения агарозы по длине эмбриона и выпуская эмбрион в среду.
3. Сбор эмбрионов с огневой полировкой пипетки Пастера и зафиксировать параформальдегида (PFA; 4% в 1 х PBS, pH 7,2) либо 3-х часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
4. Удалить фиксирующий раствор и полоскать 2-3 раза в PBST, по крайней мере, 5 минут при комнатной температуре.
5. Вымойте эмбрионов со 100%-ного метанола в течение 10 мин, пополнить свежими метанола и инкубировать при температуре -20 ° С в течение не менее 2 часов.
6. Увлажняет эмбрионов последовательными инкубации (5 минут каждая), в серию разбавленные метанола в PBSTr: 80%, 60%, 40% и 20%. Вымойте 2 х 10 минут в PBSTr.
7. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре в 500 мкл блокирующего раствора.
8. Добавить анти-флуоресцеин-щелочной фосфатазы (AP) Fab фрагментов (Roche, Пало-Альто, Калифорния, кот. Нет. 11426338910), разбавленного 1:500 в блокировании решения и инкубировать в течение ночи при 4 ° С (место микроцентрифужных труб на боку) .
9. Вымойте 5 х 15 минут в PBST.
10. Вымойте течение 5 минут в 0,2 М NaCl в тротиловом эквиваленте.
11. Вымойте течение 5 минут в 0,4 М NaCl в тротиловом эквиваленте.
12. Равновесия 3 х 5 минут в свежеприготовленных Prestain решение.
13. Растворите один быстрый Красная таблетка (Roche, Пало-Альто, Калифорния, кот. Нет. 11496549001) в 2 мл раствора Prestain. Рекомендуется для фильтрации раствора с использованием Ватман № 2 бумаги опускать не-растворенных частиц. Кроме того, спином вниз решения и использования ясно надосадочной жидкости.
14. Добавить 500 мкл Быстрый Красный решение для каждой трубки, инкубировать в темноте при комнатной температуре, и развитие цветной монитор, пока на сигнал к фону достигается (20 минут до нескольких часов). Если фоне развивается, передачи до 4 ° C. После одного часа инкубации, пополнится новыми Быстрый раствор красного окрашивания.
15. Остановите окрашивание реакции на 3 х 5 минут моет в PBST.
16. Fix течение 20 минут в 4% PFA при комнатной температуре.
17. Вымойте 2 х 5 минут в PBST.
18. Очистить эмбрионы через серию 25%, 50% и 75% глицерина в ФСБ пока эмбрионы поселились в нижней части трубы. Эмбрионы могут храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких дней.

5. Флуоресцентные Визуализация Uncaged Площадь

1. Подготовка стекло микроскопа для монтажа: с помощью 1 мл шприца применяются четыре места четких силиконовой смазкой на слайде, расположенный на расстоянии ~ 15 мм друг от друга. Горы эмбриона на-центрыГ в ~ 200 мкл 75% глицерина и место покровное (№ 0; 18x18mm) сверху и аккуратно нажмите на его против силиконовых пока глицерин занимает поверхность между слайдами.
2. Место установлен эмбриона на сцену и привести его в фокусе использовании 40x цели. Приобретать конфокальной Z-серии изображений с использованием аргона и 488nm 543nm гелий-неонового лазера в качестве источника возбуждения.
3. Оси Z. промежуток photoactivatated домен может быть проанализированы с помощью 3D-реконструкция Uncaged эмбриона использованием программного обеспечения для анализа изображений.

6. Решения

7. Представитель Результаты

Пример использования двух-фотонной микроскопии для photoactivate агентов в эмбрион полосатого данио жизни представлена. Используя аналогичный подход, который мы ранее проследить линию фотоактивируемые меченых предшественников в нейронных мозга данио ^2,3. На рисунке 1 показана фотоактивации клетке флуоресцеина сопряженных красителя примеси в передней нервной пластинки из эмбрионов данио проведения neurog1:: GFP репортер трансгенов, которые служили в качестве живого внутреннего ориентира.

Эмбрионы были введены с клетками флуоресцеина на одну ячейку стадии и встроенных в агарозном на стадии бутона. Через 3 - 5-сомитов пространственные координаты были измерены в neurog1:: GFP трансгенных эмбрионов, чтобы определить область интереса (ROI) для uncaging (рис. 1А, '). Мы Uncaged трассирующими флуоресцеина линии в конкретной области нервной пластинки (рис. 1B, B '). Впоследствии судьба этого данный помечены нейронных поддомен предшественников была определена в prim5 (24 часа после оплодотворения) стадии иммунной из Uncaged флуоресцеина (рис. 1С, С).

Степень двухфотонного uncaging лазера, т.е. интенсивность флуоресценции и Uncaged толщина фотоактивируемые домена (г-диапазона), можно управлять путем изменения двух параметров: интенсивность лазерного и продолжительности. Последний можно управлять с помощью регулировки количества итераций и скорость сканирования (см. часть 3, шаг 9; Russek-Blum, 2009). В примере, показанном на рисунке 1, мы использовали относительную мощность лазера 12% ОСО передачи, 20 итераций и скорость сканирования в 25,6 мкс / пиксель. С помощью этих установок мы обозначили ROI содержащие 9-10 клеток и фотоактивируемые г-оболочка 30 мкм (~ 1-2 ряда клеток).

Рисунок 1. Представителю результате фотоактивации клетке флуоресцеина в живых эмбрионов данио с помощью двух-фотонной микроскопии.

Схематическое изображение (АС) и представитель изображений (Х-С ") из фотоактивации процесса. Живая данио эмбриона (А, А '), выражающая GFP под контролем neurogenin-1 промотора (neurog1:: GFP), который был введен с клетками флуоресцеина трассирующими красителя на 1-клеточной стадии. На 3-5 - сомитов, отдельный участок переднего мозга зачаток (промежуточный мозг) был фотоактивируемые и Uncaged флуоресцеина трассирующими красителя может быть обнаружен (В, В '). После фотоактивации процедуры, эмбрион инкубировали при 28,5 ° С, а клетки мозга содержащие Uncaged флуоресцеина были прослежены анти-флуоресцеин иммуноокрашивания через 24 часа после оплодотворения (ФВЧ, C, C '). Дьен, промежуточного мозга;. Тел, конечного мозга..

Фото-активируемые соединения молекул, функция которого состоит в маске, пока они не освещены с определенной длиной волны (как правило, УФ), вызывающие фотохимические реакции, которая преобразует молекулы в биологически или химически активном состоянии. Эти зонды обеспечивают очень мощные инструменты в ячейке исследования биологии, так как активация может точно управлять во времени и пространстве, ограничивая их воздействие света.

Существенным преимуществом многофотонной микроскопии является его относительно глубоких оптических проникновения и снижается неспецифическая фототоксичности. Для активации процесса, два фотона низкой энергии должны быть поглощены фото-активируемые соединение в то же время. Как вероятность такого события, зависит от плотности фотонов, активация остается ограниченным до фокальной плоскости. Активация регионе может быть выборочно манипулировать в определенном объеме в ткани.

Мы представляем протокол для фотоактивации клетке флуоресцеина с использованием двух-фотонной микроскопии в живых эмбрионов данио. В конкретном примере, показанном здесь мы используем двухфотонной микроскопии, чтобы побудить клетку-флуоресцеина фотолиза для того, чтобы отметить клетки на ранних эмбриональных стадиях, а затем проследить линию меченых клеток в развивающемся мозге рыбок данио. По сравнению с фотоактивации лазерным и флэш-лампы, что приводит к активации трассирующими красителя в несколько десятков ячеек и отсутствие разрешения в ось г ^4,5, двухфотонное основе фотоактивации может достичь пространственного разрешения несколько микрометров получения осевых разрешение проксимально 1:59 ячейки строк ^2,3.

Процедура в настоящем докладе может быть использован для активации различных соединений на одной резолюции ячейку в живых экземпляров. Например, Kaede белок может быть так же используется для обозначения клетки после ее фотопреобразования от зеленого до красного fluorescenct белка ^6,7. Другие свет активированных белков, которые могут быть применены включают свет закрытого ионного канала, Channelrhodopsin, которые могут модулировать активность нейронов ⁸ и фотосенсибилизаторов, таких как KillerRed, что вызывает гибель клеток при облучении светом ^9.

Различных клетках молекул были зарегистрированы, позволяя модуляции физиологических процессов путем манипулирования внеклеточных и внутриклеточных соединений ^10. К ним относятся, активных медиаторов (например, глютамат ^11,12) и вторичных мессенджеров (например, кальция ¹³⁾ и стероидных гормонов (например, ретиноевая кислота ^14). Наконец, фото-опосредованный контроль активации гена и глушителей в данио рерио был введен. Двухфотонное основе фотоактивации клетке антисмысловые олигонуклеотиды (morpholinos) и РНК, могут быть использованы для нокдаун гена и получить-функции в ограниченной популяции клеток из живого эмбриона полосатого данио ^15,16.

В общем, двухфотонного основе фото-активации в живых эмбрионов данио является: 1) Точное-1:59 ячейки рядами вдоль х, у, Z осей. 2) Количественный-степень фотоактивации можно управлять. 3) Универсальность-может быть применена для различных фото-кабриолет белков.

Выражаем благодарность Женя Бродского для фигурного графика; Вячеслав Кальченко, Дуглас Лутц, и Леонид Ройтман о технической консультации и помощь в двухфотонного uncaging; Мааян тахор и Сулиман Elsadin в технической помощи; Уве Strahle за любезно предоставленные neurogenin1 линии репортер и Амос Гутник комментариев к этой рукописи. Исследования в лаборатории Levkowitz поддерживается германо-израильского фонда (грант № 183/2007); Израиль научного фонда (грант № 928/08) и Харриет и Марсель Деккер Foundation. GL является Сотрудник развития Тауро Карьера кафедрой биомедицинских исследований.