Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Fotoattivazione di composti target in un organismo vivente si è dimostrato un valido approccio per studiare vari processi biologici quali lo sviluppo embrionale, segnalazione cellulare e la fisiologia adulta. A questo proposito, l'uso del multi-fotone microscopia permette fotoattivazione quantitativa di un dato agente luce reattivo nei tessuti profondi con una risoluzione singola cella. Come embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, il loro sviluppo può essere monitorata in vivo. Queste caratteristiche rendono il pesce zebra un organismo modello perfetto per controllare l'attività di una varietà di agenti chimici e le proteine ​​dalla luce concentrata. Qui si descrivono l'uso della microscopia a due fotoni per indurre l'attivazione di chimicamente in gabbia fluoresceina, che a sua volta ci permette di seguire il destino delle cellule in vivo embrioni di zebrafish. Noi usiamo gli embrioni che esprimono un punto di riferimento vivo genetica (GFP) per individuare con precisione obiettivi e le cellule di interesse. Questa procedura può essere utilizzata allo stesso modo per un preciso attivazione luce indotta di proteine, ormoni, molecole di piccole dimensioni e altri composti in gabbia.

Descriviamo un protocollo di etichettatura delle cellule utilizzando fluoresceina in gabbia, però, altre foto-attivabili coloranti e proteine ​​possono essere utilizzate allo stesso modo.

1. L'iniezione di fluorescina Caged

1. Preparare soluzione madre 5% (5 mg in gabbia-fluoresceina / 100 microlitri KCl 0,2 M) di destrano coniugato 4,5-dimetossi-2-nitrobenzyl (DMNB) in gabbia fluoresceina (10.000 MW destrano, anionici, Invitrogen, sonde molecolari, Carlsbad, CA , cat. no. D-3310). Aliquota e conservare in -20 ° C. Si noti che DMNB-gabbia fluoresceina è sensibile alla luce e dovrebbe essere tenuto al buio.
2. Preparare un trogolo di iniezione fatti di 1% agarosio (Sigma, St. Louis, MO, cat. No. A9539), come descritto in "Il libro zebrafish" ^1.
3. Preparare 2 litri di media E3 diluendo un 100 x E3 soluzione madre.
4. La sera prima dell'iniezione, preparare gabbie accoppiamento separazione del maschio (s) dalla femmina (s) della linea desiderata transgenici che esprimono un punto di riferimento visibile fluorescente (GFP, RFP, ecc) utilizzati per localizzare le cellule bersaglio per fotoattivazione.
5. Preparare aghi da iniezione capillare (a parete sottile vetro Capillari con filamento, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, cat. No. TW100F-6) con un estrattore micropipetta (strumento Sutter, Novato, CA, P-97).
6. Scongelare una aliquota del 5% in gabbia fluorescina sul ghiaccio.
7. Diluire il 5% in gabbia soluzione madre fluoresceina in KCl 0,2 M ad una concentrazione finale di 1%, e tenere in ghiaccio. Evitare l'esposizione alla luce.
8. Accoppiamento installazione attraversa preparato al punto 4.
9. Raccogliere le uova fecondate non appena sono previste. Orientare cellule di embrioni in fase di stampo ad iniezione agarosio rivestì E3 ^1.
10. Utilizzando una punta microloader (Eppendorf, Amburgo, Germania, cat. No. 956,003 5242) riempimento un ago da iniezione con ~ 1 ml di 1% in gabbia soluzione fluoresceina.
11. Luogo carico ago in un micromanipolatore collegato a un alimentati a gas microinjector (pneumatico picopump, World Strumenti di precisione, Sarasota, FL, PV820).
12. Regolare il volume di iniezione di 2-3NL e iniettare il gabbia-fluoresceina direttamente nel citoplasma della cellula. Iniettare un minimo di 50 embrioni per sperimentare.
13. Incubare gli embrioni al buio a 28,5 ° C nella E3 allo stadio di sviluppo desiderato. Se gli embrioni più di 24 ore dopo la fecondazione vengono analizzati, aggiungere 0,1% phenylthiourea (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. No. 22290-9) per inibire la pigmentazione.

2. Embrione di montaggio

1. Preparare una soluzione fresca E2 (cfr. parte soluzioni; può essere conservato a 4 ° C per una settimana).
2. Cappotto 60 millimetri Petri con un sottile strato di agarosio 1% sciolto in media E2.
3. Preparare il 2% di agarosio a basso punto di fusione (Ultra Pure agarosio LMP, Invitrogen, Carlsbad, CA, il gatto non 16520100..) Per l'incorporamento: sciogliere l'agarosio in acqua sterile bidistillata da riscaldamento a microonde fino a ebollizione. Mantenere tappo del tubo è aperto durante il riscaldamento. Aliquota 1 ml in provette da microcentrifuga e tenere su una piastra riscaldante a 72 ° C.
4. Rimuovere il chorions degli embrioni tirando delicatamente il corion a parte con una pinza tagliente (n. 5). Mantenere gli embrioni in soluzione E2 su agar-rivestito piatto (vedi punto 2). Dechorionated embrioni devono essere trattati con il fuoco lucidato vetro pipetta Pasteur in quanto possono attenersi a pipette polipropilene. Evitare di esporre l'embrione dechorionized per aria come questi embrioni potrebbe essere danneggiato dalla tensione superficiale del liquido.
5. Raccogliere l'embrione selezionato in un piccolo volume di E2 con un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur, e posto l'embrione sul piatto 60 mm Petri. Montare una goccia (~ 150 mL) del 2% agarosio (fase 3) accanto l'embrione. Rapidamente mescolare le due gocce per ottenere una miscela omogenea finale ~ 1% di agarosio e utilizzando un microscopio da dissezione orientare l'embrione con il suo lato dorsale di fronte alla lente dell'obiettivo.
6. Attendere che l'agarosio si è solidificato e aggiungere medio E2 fino a quando l'embrione incorporato è immerso in un liquido. Si preferisce ottenere un singolo embrione per piatto come può essere liberato dal agarosio dopo il processo di fotoattivazione.

3. Fotoattivazione

1. Usiamo un Zeiss LSM 510 META NLO microscopio a due fotoni dotati di banda larga sintonizzabile (700-1020nm) Mai Tai-HP-laser al femtosecondo da Spectraphysics.
2. Posizionare l'embrione montato su un portatarga sotto il microscopio. Il punto di riferimento fluorescente negli embrioni viene visualizzato per mezzo 40x/0.8W acqua Achroplan immerso obiettivo. Per le seguenti operazioni che usiamo non descanned rivelatore (NDD) con filtro passa banda (BP) di 500-550nm.
3. Come prerequisito per il processo di fotoattivazione, ottenere informazioni spaziali fluorescenti della regione di interesse con l'acquisizione di serie di immagini dalle più ventrale alla parte dorsale del segnale rilevato fluorescente, con due-fotone di lunghezza d'onda laser di 860nm (per il rilevamento GFP). A tal fine, una risoluzione sufficiente può essere ottenuto usando un arco di 6μm tra ogni piano ha acquisito focale.
4. Selezionare la destinazionez-aereo per fotoattivazione e portare questa regione a fuoco. A seconda dello scopo dell'esperimento, la regione di interesse può essere sia all'interno o all'esterno del punto di riferimento visibile GFP. Prendete una singola immagine in questo piano z. Salvare l'immagine e tenerlo aperto in una finestra separata.
5. Impostare i due fotoni di lunghezza d'onda laser a 720nm e quando il laser è in modo bloccato aprire la 'Modifica candeggina menu'. Definire l'area di interesse (ROI) per fotoattivazione secondo l'immagine prese a 860nm (Fase 4) usando il menu 'Definire Regione'. E 'fondamentale selezionare il ROI su questa immagine dopo lo spostamento della lunghezza d'onda laser a 720nm come quest'ultima azione cambia la x, y posizioni del campo osservato.
6. Regolare i seguenti parametri per fotoattivazione nel menu 'Modifica candeggina' (vedi punto 9): a) potenza del laser relativa; b) numero di iterazioni, c) velocità di scansione.
7. 'Bleach' stampa nella finestra 'Modifica candeggina' e attende che cessi il laser.
8. Tornare a 860nm, acquisire una sola immagine aereo per valutare l'intensità del materiale risultante fotoattivati ​​e una seconda serie di acquisizione delle immagini per valutare la Z-span (spessore) del dominio attivato.
9. Considerare i seguenti parametri per fotoattivazione:
   1. Si dovrebbe empiricamente determinare le condizioni ottimali per fotoattivazione variando due parametri: intensità del laser e la durata della fotoattivazione. La potenza del laser relativa può essere controllato dal modulatore acusto-ottico (AOM) di trasmissione. La durata di fotoattivazione è una funzione del numero di iterazioni e velocità di scansione.
   2. Determinare l'intervallo lineare di intensità di fluorescenza in modo da evitare la saturazione della fluorescenza Uncaged.
   3. Esiste una correlazione lineare tra l'intensità ottenuto fluorescenza delle molecole Uncaged e l'asse z durata del clone fotoattivati ^​​2.

4. Rilevazione del Fluoresceina Uncaged

1. Dopo fotoattivazione, alzare gli embrioni al buio a 28,5 ° C in media E2 contenente 0,1% PTU per prevenire la comparsa di pigmentazione della pelle.
2. Allo stadio di sviluppo desiderato, rimuovere l'embrione dal agarosio sotto un microscopio da dissezione. Usando un bisturi sottolineato, creare una incisione a forma di "V" nel agarosio vicino l'embrione in modo che la "V" è rivolta verso la testa dell'embrione. Posizionare una pinza chiusa nel punto di "V" vicino alla testa di un embrione e spingere delicatamente aprire il forcipe che separa l'agarosio per tutta la lunghezza dell'embrione e rilasciando l'embrione nel mezzo.
3. Raccogliere gli embrioni con un fuoco lucido pipetta Pasteur e fissare con paraformaldeide (PFA, 4% nel 1 x PBS, pH 7,2) sia per 3 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
4. Rimuovere la soluzione di fissativo e sciacquare 2-3 volte in PBST per almeno 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Lavare gli embrioni con 100% di metanolo per 10 minuti, riempire con il metanolo fresco e incubare a -20 ° C per almeno 2 ore.
6. Reidratare embrioni da incubazioni consecutive (5 minuti ciascuno) in una serie di metanolo diluito in PBSTr: 80%, 60%, 40% e 20%. Lavare 2 x 10 minuti in PBSTr.
7. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in 500 ml di soluzione di blocco.
8. Aggiungi un anti-fluoresceina-fosfatasi alcalina (AP) frammenti Fab (Roche, Palo Alto, CA, cat. No. 11426338910), diluito 1:500 nella soluzione di blocco e incubare una notte a 4 ° C (tubi da microcentrifuga posto su un fianco) .
9. Lavare 5 x 15 minuti in PBST.
10. Lavare per 5 minuti in NaCl 0,2 M in TNT.
11. Lavare per 5 minuti a 0.4M NaCl in TNT.
12. Equilibrare 3 x 5 minuti in appena preparato soluzione Prestain.
13. Sciogliere un Fast Red compressa (Roche, Palo Alto, CA, cat. No. 11496549001) in 2 mL di soluzione Prestain. Si consiglia di filtrare la soluzione con carta Whatman n ° 2 di omettere un-dissolto particelle. In alternativa, spin down soluzione e utilizzare il liquido chiaro sopranatante.
14. Aggiungere 500 microlitri soluzione Fast Red per ogni tubo, incubare al buio a temperatura ambiente, e il colore sorvegliare l'evoluzione fino alla desiderata segnale-fondo il rapporto è raggiunta (20 minuti a diverse ore). Se lo sfondo si sviluppa, il trasferimento a 4 ° C. Dopo un'ora di incubazione, riempire con una nuova soluzione rapida colorazione rossa.
15. Arrestare la reazione di colorazione da 3 x 5 minuti lava in PBST.
16. Fix per 20 minuti nel 4% PFA a temperatura ambiente.
17. Lavare 2 x 5 minuti in PBST.
18. Embrioni chiaro attraverso una serie di 25%, 50% e 75% glicerolo in PBS fino a quando gli embrioni sono regolati sul fondo della provetta. Gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C per pochi giorni.

5. Visualizzazione fluorescente dello Spazio Uncaged

1. Preparare un vetrino da microscopio per il montaggio: utilizzando una siringa da 1 ml applicare quattro macchie di grasso al silicone trasparente sul vetrino, poste ad una distanza di ~ 15mm l'uno dall'altro. Montare l'embrione allo center in ~ 200 ml di 75% glicerolo e mettere un coprioggetto (n. 0; 18x18mm) in alto e spingere delicatamente contro il silicone fino a quando la soluzione di glicerolo occupa la superficie tra le diapositive.
2. Posizionare l'embrione montato sul palco e portarlo a fuoco con un obiettivo 40x. Acquisire un confocale Z-serie di immagini utilizzando 488nm e 543nm laser Argon HeNe come fonte di eccitazione.
3. L'asse z durata del dominio photoactivatated possono essere analizzati utilizzando la ricostruzione 3D di un embrione Uncaged utilizzando un software di analisi dell'immagine.

6. Soluzioni

7. Rappresentante Risultati

Un esempio di utilizzo di microscopia a due fotoni per photoactivate agenti in un embrione di zebrafish vivente è presentato. Utilizzando un approccio simile è già tracciato la stirpe dei fotoattivati ​​progenitori etichettato neurali nel cervello zebrafish ^2,3. La figura 1 mostra fotoattivazione di una gabbia colorante tracciante fluoresceina coniugato in piastra neurale anteriore di embrioni di zebrafish portando un neurog1:: GFP giornalista transgene, che serviva come punto di riferimento vivo intrinseca.

Gli embrioni sono stati iniettati con fluoresceina in gabbia in fase di una cella e incorporati in agarosio in fase di germoglio. A 3 - 5-somite fase le coordinate spaziali sono stati misurati nel neurog1:: GFP embrione transgenico per determinare la regione di interesse (ROI) per uncaging (Figura 1A, A '). Noi Uncaged il tracciante lignaggio fluoresceina in un dominio specifico della piastra neurale (Figura 1B, B '). Successivamente, il destino di questo dato sottodominio etichettati progenitrici neurali è stato determinato in prim5 (24 ore dopo la fecondazione), tappa per immunocolorazione delle Uncaged fluoresceina (Figura 1C, C ').

Il grado di due fotoni uncaging laser, cioè l'intensità della fluorescenza Uncaged e lo spessore del dominio fotoattivati ​​(z-span), può essere controllata regolando due parametri: intensità del laser e la durata. Quest'ultimo può essere controllata dalla regolazione del numero di iterazioni e la velocità di scansione (vedi parte 3, punto 9; Russek-Blum, 2009). Nell'esempio mostrato nella Figura 1, abbiamo usato potere relativo laser di trasmissione AOM 12%, 20 iterazioni e velocità di scansione di 25,6 msec / pixel. Utilizzando queste impostazioni abbiamo etichettato come contenente ROI 9-10 cellule e un fotoattivati ​​z-arco di 30μm (~ 1-2 righe delle celle).

Figura 1. Un risultato rappresentante di fotoattivazione di fluoresceina in gabbia in embrione zebrafish dal vivo utilizzando la microscopia a due fotoni.

Schematica illustrazione (AC) e immagini rappresentative (A'-C ') del processo di fotoattivazione. Vivere embrione zebrafish (A, A ') che esprimono GFP sotto il controllo di neurogenina-1 promotore (neurog1:: GFP) che è stato iniettato in gabbia con fluoresceina tracciante colorante nella fase 1 cella. Al 3-5 - fase somite, una zona discreta del primordio prosencefalo (diencefalo) è stato fotoattivati ​​e il Uncaged fluoresceina tracciante colorante potrebbe essere rilevato (B, B '). A seguito della procedura di fotoattivazione, l'embrione è stato incubato a 28,5 ° C e le cellule cerebrali contenenti la fluoresceina Uncaged sono state tracciate da anti-fluoresceina immunocolorazione a 24 ore dopo la fecondazione (HPF, C, C '). Dien, Diencefalo;. Tel., telencefalo..

Photo-attivabili composti sono molecole la cui funzione è mascherato fino a quando non sono illuminati con una specifica lunghezza d'onda (di solito UV), inducendo una reazione fotochimica che converte le molecole in uno stato chimicamente o biologicamente attive. Queste sonde forniscono strumenti molto potenti per la ricerca di biologia delle cellule, poiché l'attivazione può essere controllato con precisione temporalmente e spazialmente, limitando la loro esposizione alla luce.

Il significativo vantaggio di multi-fotone microscopia è la sua penetrazione relativamente ridotta profondità ottica e fototossicità non specifica. Per il processo di attivazione, due fotoni di bassa energia deve essere assorbita dal foto-attivabili composto allo stesso tempo. Come la probabilità di un evento dipende dalla densità di fotoni, l'attivazione resta limitato al piano focale. La regione di attivazione può quindi essere selettivamente manipolati in un determinato volume all'interno del tessuto.

Vi presentiamo un protocollo per fotoattivazione di fluoresceina in gabbia con la microscopia a due fotoni in embrioni di zebrafish vivo. Nell'esempio specifico illustrate in questo documento si usa la microscopia a due fotoni per indurre in gabbia-fluoresceina fotolisi per marcare le cellule in prime fasi embrionale e successivamente tracciare il lignaggio delle cellule etichettate nel cervello zebrafish via di sviluppo. In confronto al fotoattivazione con laser e flash-lamp, che provoca l'attivazione del colorante tracciante in poche decine di cellule e la mancanza di risoluzione l'asse z ^4,5, due fotoni basato fotoattivazione può raggiungere una risoluzione spaziale di pochi micrometri ottenere risoluzione assiale di un prossimalmente 1-2 righe delle celle ^2,3.

La procedura qui riportate può essere utilizzato per l'attivazione di una varietà di composti ad una risoluzione singola cella di esemplari vivi. Per esempio, la proteina Kaede può essere utilizzato in modo simile alle cellule etichetta successivo alla fotoconversione da una proteina verde al rosso fluorescenct ^6,7. Altri attivato dalla luce proteine ​​che possono essere applicati includono la luce-dipendenti canali ionici, Channelrhodopsin, che possono modulare l'attività neuronale ⁸ e fotosensibilizzanti come KillerRed, che induce la morte delle cellule al momento irradiazione di luce ^9.

Una varietà di molecole in gabbia sono stati segnalati, che consente la modulazione dei processi fisiologici dalla manipolazione di composti extracellulare e intracellulare ^10. Tra questi, i neurotrasmettitori attivi (es. glutammato ^11,12) e secondi messaggeri (ad esempio il calcio ¹³⁾ e degli ormoni steroidei (ad esempio l'acido retinoico ^14). Infine, foto-mediata controllo di attivazione e silenziamento genico in zebrafish è stato introdotto. Fotoattivazione due fotoni a base di oligonucleotidi antisenso in gabbia (Morpholinos) e di RNA possono essere utilizzate per knockdown gene e guadagno di funzione in ristretta popolazione di cellule di un embrione di zebrafish vivo ^15,16.

In sintesi, a due fotoni a base di foto-attivazione in embrioni di zebrafish live è: 1) precisa-1-2 righe delle celle lungo x, y, z. 2) quantitativa, il grado di fotoattivazione può essere controllato. 3) Versatile-può essere applicato per una serie di foto-convertibile proteine.

Grazie sono dovuti a Genia Brodsky per la figura grafica; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman per la consulenza tecnica e assistenza con i due fotoni uncaging; Maayan tahor e Suliman Elsadin di assistenza tecnica; Uwe Strahle per la gentile fornitura della linea neurogenin1 reporter e Amos Gutnick dei commenti a questo manoscritto. La ricerca in laboratorio Levkowitz è supportato dal tedesco-israeliano Foundation (codice di autorizzazione 183/2007); Israel Science Foundation (codice di autorizzazione 928/08) e la Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL è un operatore della Cattedra Career Development Tauro nella ricerca biomedica.