Интегративный протокол для получения 3D-органоидов печени человека, полученных из ИПСК

Полученные из ИПСК 3D органоиды печени человека представляют собой потенциальный инструмент для понимания действия гормона щитовидной железы на развитие печени.

Получение стабильных клеток печени в культуре представляет собой значительную проблему для исследований печени. Учитывая это, был представлен оптимизированный метод с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) для получения 3D-культур органоидов печени человека (ГХО). Использование HHO предлагает ценный подход к пониманию развития печени, разгадке заболеваний печени, проведению высокопроизводительных исследований для разработки лекарств и изучению потенциала трансплантации печени. В первом исследовании, с помощью иммунофлюоресценции и количественных методов ОТ-ПЦР, отслеживалось прогрессирование, выявляя присутствие различных клеточных популяций, таких как гепатобласты и два типа клеток, полученных из гепатобластов: холангиоциты или гепатоцитоподобные клетки, на разных стадиях развития. В этом отчете представлен простой 3D-протокол, начиная с ИПСК и заканчивая приобретением HHO, которые отражают стадии развития человеческого эмбриона. Протокол, охватывающий 46-50 дней, включает в себя несколько этапов: (i) тщательное управление культурой hiPSC для получения HHOs, (ii) инициирование дифференцировки клеток в 2D и последующий переход к 3D, и (iii) оптимизированная стратегия диссоциации для расщепления HHO на одиночные клетки для секвенирования РНК одиночных клеток. В качестве иллюстрации широкого применения этого подхода данный протокол ранее применялся для раскрытия роли передачи сигналов гормонов щитовидной железы в развитии клеток печени.

Печень выполняет различные метаболические функции, такие как регулирование доступности легкоусвояемых энергетических субстратов, таких как глюкоза и кетоновые тела, а также детоксикация ксенобиотических соединений. В последние годы наблюдается значительный рост распространенности заболеваний печени, в основном связанных с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ), который при отсутствии лечения может развиться в цирроз или рак¹. Поэтому крайне важно понимать метаболические функции печени и связанные с ней заболевания, чтобы способствовать разработке эффективных методов лечения ^2,3.

Появление трехмерных (3D) культур привело к созданию модели органоида, представляющей собой революционный и инновационный подход к рассмотрению функциональности и сложности развития органов⁴. Органоиды определяются как трехмерные самоорганизованные агрегаты дифференцированных клеток, которые имитируют функции и цитоархитегерство соответствующего органа⁵.

За последние десятилетия мириады протоколов по органоидам печени человека (HHO) приобрели широкий интерес, начиная от использования различных человеческих клеток, полученных из iPSC6, или только гепатоцитоподобных^{клеток7}, до включения разнообразных сложных микроокружений факторов роста или ингибиторов и дифференцировочных клеток-предшественников в монослое⁷ или 3D⁸. Эти подходы позволяют решать множество потенциальных задач, от высокопроизводительного скрининга лекарств⁹ до получения более глубокого понимания механизмов, лежащих в основе заболеваний печени¹⁰.

Здесь выполнен пошаговый протокол дифференцировки HHO на основе химических сигналов, упомянутых¹¹ , с методологически адаптированными вариациями. Этот протокол начинается с надлежащей обработки и культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC), подробно описывая методы манипуляций с гелем внеклеточного матрикса, пассирования клеток и дифференцировки в HHO. Процесс начинается со стимуляции дифференцировки ИПСК в дефинитивную энтодерму (ДЭ)¹² и последующего имитации in vivo эффектов FGF и BMP для содействия развитию монослойных клеток задней передней кишки (ПФГ)¹³. 3D-архитектура достигается на 10-й день, когда клетки ПФГ дифференцируются в незрелую печеночную фазу, которая станет гепатобластами, фетальными клетками-предшественниками холангиоцитов и гепатоцитов². Наконец, 3D-структуры диссоциируются на отдельные клетки для исследований секвенирования РНК. В качестве примера применимости данного протокола было продемонстрировано, как данная модель HHO подходит для изучения действия гормонов щитовидной железы и дейодиназы 2 типа (D2) на развитие гепатоцитов и холангиоцитов¹⁴.

1. Лечение гипертока крови

ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК (клеточная линия CS03iCTR-n3) были коммерчески закуплены. Надлежащее управление гелевым покрытием внеклеточного матрикса и средой ИПСК является ключом к прикреплению ИПСК к пластинам и их питанию. Здесь были описаны объемы, необходимые для одного 6-луночного планшета. Оставшиеся ИПСК из 6-луночного планшета, которые не будут дифференцироваться в органоиды, могут быть сохранены в жидком азоте для длительного хранения.

1. Дозирование геля с внеклеточным матриксом и среды hiPSC
   1. Правильно разморозьте флакон геля с внеклеточным матриксом, поместив в емкость со льдом при температуре 4 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выделением квотирования проверьте сертификат анализа, чтобы проверить объем для коэффициента разрежения. Это представляет собой концентрацию белка геля внеклеточного матрикса; Поэтому он варьируется от одного лота к другому.
   2. Распределите гель с внеклеточным матриксом в подходящие аликвоты в соответствии с коэффициентом разбавления (4x, 2x и 1x) с помощью предварительно охлажденных и помеченных пробирок. Добавьте 4-кратный коэффициент разбавления геля внеклеточного матрикса к 25 мл холодного DMEM/F12, чтобы покрыть четыре 6-луночные планшеты. Своевременно запечатайте крышки лабораторной герметизирующей пленкой и заморозьте при температуре -80 °C. Избегайте длительного нахождения на воздухе и образования пузырьков в аликвотах.
   3. Разморозьте 100 мл добавки hiPSC при температуре 4 °C на ночь. Добавьте его в 400 мл базальной среды hiPSC. После гомогенизации с помощью серологической пипетки объемом 50 мл поместите среду hiPSC в пробирки объемом 40 мл и заморозьте при температуре -20 °C до использования.
2. Покрытие пластинами для культуры hiPSC
   1. Нумеруйте и промаркируйте 6-луночные планшеты. Держите рядом одну гелевую аликвоту внеклеточного матрикса, погруженную в сухой лед.
   2. Для покрытия одного 6-луночного планшета разбавьте одну аликвоту геля внеклеточного матрикса (1x) в 6,25 мл холодного DMEM/F12 (2x в 12,5 мл и 4x в 25 мл DMEM/F12).
   3. Пипеткой введите небольшой объем DMEM/F12 (~500 μл) в гелевую пробирку с внеклеточным матриксом. Поворачивайте вверх и вниз, чтобы разморозить и гомогенизировать гель внеклеточного матрикса холодным DMEM/F12, предотвращая образование пузырьков, и верните его в остальную часть холодной пробирки, содержащей DMEM/F12, с помощью серологической пипетки для полного перемешивания.
   4. Внесите 1 мл геля внеклеточного матрикса в DMEM/F12 в одну лунку для покрытия 6-луночной пластины (6 мл для всей пластины). Равномерно распределите 1 мл по поверхности, перемещая, не встряхивая, пластину до полного ее покрытия.
   5. Дайте постоять при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа перед использованием. Если 6-луночный планшет используется не полностью, закройте его лабораторной герметизирующей пленкой и храните в холодильнике при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелку с покрытием можно хранить в холодильнике в течение 1 недели при температуре 4 °C.
3. Размораживание и культивирование гиПСК
   1. Заранее рассчитайте объем среды hiPSC и прогрейте при РТ вместе с 6-луночным покрытием планшета за 1 ч до применения (2 мл на лунку).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае холодных или замороженных аликвот погрузите их в инкубатор с температурой 37 °C или водяную баню за 15 минут до использования.
   2. Разделите 1 мл ИПСК в жидкости N₂ из криовиала на 3 лунки 6-луночного планшета (соотношение 1:3). Для целого 6-луночного планшета используйте 2 криовалиала. Здесь в протоколе описывается размораживание и культивирование ИПСК из одного криовиала. Повторите процесс для 2 криовалиалов.
   3. Введите криовиал, содержащий примерно 1 мл замороженных ИПСК через колпачок и пропустив его через поверхностную воду, при этом дно флакона погрузить на водяную баню при температуре 37 °C до размораживания.
   4. После размораживания распылите на криовиал этанол и пипеткой нанесите 1 мл ИПСК с пипеткой. Медленно дозируйте в пустую коническую пробирку объемом 15 мл. Добавляйте 5 мл теплой среды hiPSC по каплям, осторожно встряхивая пробирку.
   5. Центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 5 мин при RT. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации стеклянной пипеткой, подключенной к вакууму, не разрушая гранулу, оставляя некоторое количество остаточной среды. Осторожно ресуспендируйте гранулу в 6 мл среды, а затем добавьте по 2 мл на лунку в 3 лунки 6-луночного планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставляйте небольшие скопления иПСК для правильного роста.
   6. Согните 6-луночную пластину и аспирируйте гель внеклеточного матрикса с ранее покрытой пластины, не касаясь кончика до дна лунки.
   7. Переведите 2 мл среды с ИПСК на лунку. Осторожно встряхните пластину вперед, назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить агрегаты hiPSC на пластине.
   8. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%_CO2 и влажности 95%. Ежедневно меняйте среду (2 мл на лунку), проверяя прогрессирующий рост.
   9. Пассаж ИПСК при приобретении 80% слияния роста (через 4-5 дней; см. рисунок 1А). Характеристики здоровых и пролиферативных ИПСК включают четкие границы и плотную упаковку крупных ядер в центре растущих клеточных агрегаций.
4. Пассирование ИПСК
   1. Как только hiPSCs достигнут 80% конфлюенции, что указывает примерно на 1,2 x 10⁶ клеток на лунку, они проходят в новую 6-луночную пластину. Разделите в соотношении 1:3 (от 1 лунки к 3), или отрегулируйте соотношение (1:4; 1:6) в соответствии с требованиями эксперимента.
   2. Перед сдачей необходимо провести заделку геля из внеклеточного матрикса для соответствующего количества 6-луночных планшетов, как описано в шаге 1.2.
   3. Удалите надосадочную жидкость из каждой лунки и добавьте 2 мл PBS на лунку. Аспирация PBS с последующим добавлением 1 мл отслаивающей среды hiPSC в лунку в течение 1 мин. Затем удалите 1 мл отслаивающей среды с ИПСК.
   4. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 7 минут. Добавьте 1 мл среды hiPSC на лунку. Отделите и соберите путем пипетирования 1 мл среды hiPSC с клетками в пробирку объемом 15 мл.
   5. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при RT. Чтобы поместить клетки в 6-луночный планшет, повторите шаги 1.3.5-1.3.7. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%_CO2 и влажности 95%. Перейдите к шагу 1.5. для замораживания hiPSC при необходимости.
5. Замораживание hiPSC (по желанию)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ИПСК необходимое, необходимое для продвижения в НО, может привести к образованию остаточных скважин, которые могут храниться в течение длительного времени. Если возникает необходимость в расширении прохода для криовиального хранения, ИПСК могут поддерживаться в течение длительного времени.
   1. Разморозьте необходимый объем криоконсервирующей среды (1 мл на лунку клеток) в лед при температуре 4 °С. Маркировка криопробирок с указанием количества пассажей, даты и клеточной линии. Отсоедините ячейки с помощью отсоединяющей среды hiPSC, как показано на шаге 1.4. в конической пробирке объемом 15 мл.
   2. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость, осторожно оставляя клеточную гранулу нетронутой. Предусмотрительно ресуспендировать гранулу в 1 мл холодной криоконсервирующей среды (на лунку), оставив агрегаты hiPSC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если лунки имеют низкую плотность, менее 50% сливаемости, на каждые 2 лунки можно использовать 1 мл среды для криоконсервации.
   3. Перенесите 1 мл среды для криоконсервации с ИПСК в криопробирку. Осторожно взбалтывайте криопробирку, чтобы гомогенизировать содержимое клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы готовите больше пробирок для криоконсервации, оставьте уже подготовленные пробирки во льду.
   4. Поместите пробирки в контейнер для заморозки с контролируемой скоростью при температуре -80 °C на ночь. Перенесите трубки в бак с жидким азотом через 24 часа.

2. Пошаговая дифференциация от ИПСК в печеночные органоиды

ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление реагентов было выполнено и соблюдалось в соответствии с рекомендациями производителя.

1. 2D-дифференциация от hiPSC до DE (день 0-день 4 (от D-0 до D-4); Рисунок 1В)
   1. После 3 пассажей, если клетки здоровы и растут хорошо и быстро, приступают к дифференцировке ИПСК. Покройте 6-луночный планшет, как описано в шаге 1.2. Чтобы дифференцировать hiPSC и DE, используйте набор DE, следуя инструкциям производителя.
   2. Перед началом дифференцировки культивируют ИПСК в соотношении пассажей 2:1 (из 6 лунок получить 3 для начала дифференцировки) в течение 24 ч до достижения концентрации клеток в лунке, указанной в инструкции к ДЭ.
   3. Выполните дифференциацию в соответствии с протоколом производителя со следующими изменениями.
      1. Увеличьте концентрацию Y-27632, добавляемого в hiPSC, с 10 мкМ до 50 мкМ (за сутки до начала дифференцировки).
      2. Увеличьте дозу диссоциационного реагента на 1,5 мл на лунку, а также объем DMEM/F12 до того же количества на лунку в расчете на реагент диссоциации. Добавьте 1 мл DMEM/F12 (из 1,5) в каждую лунку, и еще 0,5 мл скопируйте в пробирку объемом 15 или 50 мл.
2. Дифференцировка клеток ДЭ в клетки ПФГ (от D-4 до D-10; Рисунок 1С)
   1. Приготовьте среду PFG (Advanced DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавку Glutamax, 1x добавку B27, 20 нг/мл BMP4, 10 нг/мл FGF2) для дифференцировки клеток DE за несколько дней до индукции в PFG и храните ее при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: B27 содержит T3 в своем составе. В случае исследования гормонов щитовидной железы (ТГ) с этого момента B27 следует заменить на домашний B26¹⁵ , который не содержит TH.
   2. Прогрейте среду PFG (2 мл на лунку) и продвинутый DMEM/F12 при 37 °C в течение 15 мин или RT в течение 1 ч. Наклонитесь над планшетом и аспирируйте среду ДЭ из лунок с помощью стеклянной пипетки, подключенной к вакууму (или вручную с помощью пипетки Р1000), не царапая клетки.
   3. Добавьте 2 мл теплого усовершенствованного DMEM/F12 на лунку, а затем аспирируйте его. Добавьте 2 мл теплой среды PFG на лунку в 6-луночный планшет. Меняйте средство ежедневно в течение следующих 6 дней.
3. Индукция из 2D клеток ПФГ в 3D незрелые органоиды печени (IHO; с Д-10 по Д-18)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется около 30 000-35 000 элементов в 30 μл, добавляемых в каждую лунку 96-луночного планшета ULA. Коэффициент прохода составляет 2:1, из 2 лунок (6-луночный планшет) с монослоем дифференцированных клеток ПФГ; он обеспечит полноценную 96-луночную пластину со сверхнизким прикреплением (ULA) (Рисунок 1D).
   1. Перед началом приема 3D органоидов или в более ранние дни предварительно приготовьте среду IHO (Advanced DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавка N2, 1x B27, 50 нМ A83-01, 30 мкМ дексаметазон, 5 мкМ CHIR99021, 500 нМ вальпроевая кислота, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 40 нг/мл Jagged-1, 300 нг/мл N-6,20-О-дибутириладенозина 30,50-циклической 35-монофосфатной натриевой соли (dbCAMP), 10 мкМ никотинамида) и хранить его при 4 °С.
   2. Наклейте этикетку на 96-луночную пластину со сверхнизким креплением (ULA). Для отделения клеток ПФГ используйте фермент диссоциации клеток в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Перед использованием нагрейте фермент диссоциации, усовершенствованный DMEM/F12 и PBS до 37 °C. Отсадите и выбросьте среду ПФГ из лунок. Добавьте 2 мл PBS на лунку, затем аспирируйте его.
   4. Добавьте 1,5 мл фермента диссоциации клеток в лунку при температуре 37 °C в течение 7 минут, чтобы отделить клетки от лунки. Не удаляя фермент диссоциации клеток, добавьте 1 мл усовершенствованного DMEM. Соберите все клетки и добавьте их в пробирку объемом 50 мл.
   5. Подсчитайте количество клеток на мл с помощью клеточного счетчика или гемоцитометра. Центрифугируйте при 150 x g в течение 8 мин.
   6. К грануле добавьте соответствующий объем (3 мл среды IHO для всего 96-луночного планшета ULA) и 1x гель внеклеточного матрикса, чтобы довести до конечного необходимого количества клеток (30 000-35 000 клеток).
   7. Поместите планшет на 96 лунок в инкубатор с температурой до 37 °C, 5%_CO2 и влажностью 95%. Через 24 ч (D-11) клетки перегруппируются в круглую форму; добавьте 50 мкл на лунку среды IHO.
   8. На следующий день (D-12) увеличьте до 100 мкл среды IHO на лунку. В D14 удалите ~100-120 мкл из каждой лунки либо с помощью стеклянной пипетки, подключенной к вакууму, либо с помощью пипетки по одной. Следите за тем, чтобы не допустить аспирации органоидов. Добавьте 100 мкл среды IHO в D-14 и D-16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После D-16, из-за отсутствия движения, появляется чрезмерный рост, который исчезает после D18.
4. Органоиды гепатобластов (ГБО, от D-18 до D-26)
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе IHO с 96-луночной пластины ULA будут перемещены в 6-луночную пластину ULA. Для 96 IHO, полученных на предыдущей стадии, в каждую скважину было помещено 10 органоидов, что в общей сложности представляет собой 1 и 1/2 6-луночных планшетов ULA для продолжения созревания (Рисунок 1E).
   1. Как и на предыдущих этапах дифференцировки, подготовьте среду для дифференцировки ГБО в предыдущие дни.
      1. Коктейль реагентов, используемых для дифференцировки в ГБО, описан на шаге 2.3. Удалите вальпроевую кислоту и включите в коктейль следующие биохимические вещества: BMP7, BMP4 и FGF7. Окончательный состав представляет собой усовершенствованный DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавку N2, 1x B27, 50 нМ A83-01, 30 мкМ Дексаметазон, 5 мкМ CHIR99021, 500 нМ вальпроевую кислоту, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 40 нг/мл Jagged-1, 300 нг/мл N-6,20-O-дибутириладенозин 30,50-циклический 35 монофосфат натрия соль (dbCAMP), 10 мкМ никотинамид, 25 нг/мл FGF7, 50 нг/мл BMP4, 20 нг/мл BMP7.
   2. Предварительно подогрейте HBO medium (3 мл на лунку) и Advanced DMEM/F12 (3 мл на лунку) при 37 °C. Добавьте в каждую лунку по 3 мл теплого усовершенствованного DMEM/F12.
   3. Распределите 10 органоидов IHO в лунку из 96-луночного планшета с наконечником шириной 200 мл. Извлеките усовершенствованный DMEM/F12, наклонившись над пластиной и отсосав его с помощью стеклянной пипетки, подключенной к вакууму (или вручную с помощью P1000).
   4. Добавьте 3 мл теплой среды ГБО на лунку. Включите и поместите 6-луночные планшеты ULA на мультиплатформенный шейкер при 65 об/мин внутри инкубатора, установленного при температуре 37 °C, 5%_CO2 и влажности 95%. Через 4 дня (Д-22) и 6 дней (Д-24) замените среду ГБО (3 мл на лунку).
5. Созревание в печеночные органоиды (ГО) в 2 различные фазы (от D-26 до D-46)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это последний процесс созревания, который происходит в два периода дифференцировки в зависимости от содержания и типа реагентов в среде.
   1. Заранее приготовьте первую среду HO (HO1) и храните ее при температуре 4 °C. Удалите Jagged1 и уменьшите концентрацию CHIR99021 по сравнению со средой HBO. Окончательный состав: Advanced DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x N2 добавка, 1x B27, 500 нМ A83-01, 30 мкМ Дексаметазон, 2 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 300 нг/мл N-6,20-О-дибутирилиладенозин 30,50-циклической 35 монофосфатной натриевой соли (dbCAMP), 10 мкМ никотинамида, 25 нг/мл FGF7, 20 нг/мл BMP4, 20 нг/мл BMP7.
   2. Нагрейте среду Advanced DMEM/F12 и HO1 до 37 °C перед использованием. В том же 6-луночном планшете ULA осторожно отсасывайте предыдущую среду HBO, наклонившись над пластиной и поместив кончик стеклянной пипетки, подключенной к вакууму, к стене (или вручную с помощью пипетки P1000).
   3. Добавьте 3 мл теплого Advanced DMEM/F12 на лунку и аспирируйте его. Добавьте 3 мл теплой среды HO1 на лунку. Меняйте среду HO1 каждые 3 дня (D-29, D-32, D-35, D-38) вместе со сбором образца.
   4. На этапе D 38 модифицируйте коктейль реагентов для второго периода HO (HO2), удаляя CHIR99021, BMP4, dbcAMP и FGF7 и заменяя их FGF19 и DAPT. Конечная композиция среды представляет собой усовершенствованный DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавку N2, 1x B27, 500 нМ A83-01, 30 мкМ дексаметазона, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 10 мкМ никотинамида, 20 нг/мл BMP7, 25 нг/мл FGF19, 5 мкМ DAPT.
   5. Нагрейте среду Advanced DMEM/F12 и HO2 до 37 °C перед использованием. Продолжайте с помощью 6-луночного планшета ULA и осторожно аспирируйте предыдущую среду HO1. Добавьте 3 мл Advanced DMEM/F12 в лунку и удалите его.
   6. Добавьте 3 мл теплой среды HO2 на лунку. Меняйте носитель HO2 каждые 4 дня (D-42, D-46, D-50, ...) и отбирайте образцы в те же дни, что и носитель.

3. Диссоциация одиночных клеток

Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для метода секвенирования РНК одиночных клеток. Количество органоидов может варьироваться в зависимости от размера, и чем старше день диссоциации, тем больше количество клеток в органоидах. В прежние времена количество диссоциированных органоидов увеличивалось, а время диссоциации уменьшалось в равных количествах. Диссоциацию проводили с 10 органоидами в D-14 и D-17, 8 органоидами в D-23 и D-26 и 6 органоидами в D-30 и D-45. Процедуры для одного кластера органоидов подробно описаны (рис. 1F).

1. Приготовление реагентов
   1. Приготовьте Advanced-DMEM с конечной концентрацией 7,5% бычьего альбумина фракции V (BSA) и отфильтруйте после гомогенизации.
   2. Приготовьте 1 мл среды фермента диссоциации с 1 мл трипсина 0,5% - ЭДТА (10х) в качестве базальной среды, 50 мкМ Y-27632, 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы и 1 Ед/мкл ДНКазы I.
   3. Приготовьте среду для инактивации трипсина с 2 мл Advanced DMEM/F12 + 7,5% BSA в качестве базальной среды, 50 мкМ Y-27632, 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы и 1 Ед/мкл ДНКазы I.
   4. Перед началом работы нагрейте фильтрующий материал и PBS до 37 °C.
2. Диссоциация HHO
   1. Очистите рабочее место и инструменты с помощью очистителя РНКаза. Соберите количество органоидов в соответствии со днем дифференцировки в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл с широко открытым наконечником.
   2. Постирайте PBS 2x-3x. Добавьте 1 мл среды диссоциации фермента в пробирку объемом 15 мл с собранными органоидами и выдержите при температуре 37 °C в коромысле при 30 об/мин в течение 5 минут.
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны и не роняйте трубку с коромысла.
   3. Через 5 минут сначала проверьте колпачок на наличие оставшихся органоидов, затем механически разрушьте органоиды с помощью P1000, вращая вверх и вниз 10 раз для каждого органоида (всего 60 раз). Повторите то же самое нарушение с P200. Проверьте крышку трубки на случай, если на ней не застрянут органоиды.
   4. Поместите пробирку объемом 15 мл снова на коромысле в инкубатор еще на 5 минут. Повторите процесс, описанный в пункте 4, начиная с вращения P200 вверх и вниз и продолжая серологической пипеткой объемом 1 мл, подключенной к наконечнику P10.
   5. Снова поместите пробирку объемом 15 мл на коромысле в инкубатор на последние 5 минут. В случае отсутствия диссоциации оставьте еще на 5 минут и повторите ручное прерывание.
   6. Добавьте 1 мл инактивирующей среды трипсина и гомогенизируйте ее. Поместите новую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл с клеточным фильтром 40 μм сверху. Отфильтруйте 2 мл (клетки со средой для диссоциации фермента и средой для инактивации трипсина) через клеточный фильтр 40 мкм в пробирку объемом 15 мл.
   7. Добавьте еще 1 мл инактивирующей среды для трипсина, чтобы извлечь все оставшиеся клетки из клеточного фильтра размером 40 мкм.
   8. Возьмите 5 мкл одноклеточной среды, смешанной с 5 мкл раствора красителя, чтобы подсчитать количество диссоциированных клеток, чтобы приступить к их фиксации. Подсчитайте клетки после центрифугирования и ресуспензии с помощью первого реагента из набора для фиксации и выполните фильтрацию клеток с помощью клеточного фильтра 40 мкм.

Каждый этап этого протокола ступенчатой дифференцировки от ИПСК в ГОК определяли с помощью количественных измерений методом количественной ПЦР и иммунофлюоресценции специфичных для стадий маркеров, известных из библиографии (рис. 2). Пошаговая последовательность обоих методов и достигнутые результаты, связанные с правильной дифференциацией на ОО, были изображены в¹⁴. В предыдущем исследовании ИПСК определялись по уровням мРНК POU5F1 (также известного как OCT4) и SOX2, двух хорошо известных факторов Яманаки¹⁶, которые снижались с течением времени (рис. 2A). Впоследствии были измерены уровни мРНК маркеров DE¹¹ , таких как OTX2, CER1 и FOXA2, а также маркеров PFG¹¹ HNF4A, CDX2 и TBX3, а также локализованная экспрессия OTX2, HNF4A и TBX3 с помощью иммунофлуоресценции (рис. 2A, B). После 3D продвижения, следить за прогрессированием иммунофлюоресценции альбумина и HNF4a (рисунок 2С); пролиферативный маркер MKI67¹⁷ и TBX3, важный в регуляции гепатобласта¹⁸ (рисунок 2D), был выполнен из D-18 в D-46. В частности, альбумин колокализован с HNF4a (рисунок 2C); между тем, MKI67 время от времени появлялся на D-46 (рисунок 2D). Кроме того, гепатоцитарные и холангиоцитоподобные клетки были идентифицированы по уровням мРНК и иммунофлуоресценции HNF4A¹⁹ и KRT7¹⁸ в D-46 (рис. 2E).

Объем развивающихся органоидов прогрессивно увеличивался от D-14 к D-38, о чем свидетельствует ~2-кратное увеличение уровней мРНК пролиферативного маркера MKI67 на D-22 по сравнению с D-10. Отсутствие Т4 в среде приводило к повышению уровня мРНК MKI67 на ~20% и ~75% на D-14 и D-18 соответственно по сравнению с 10-м днем (рис. 3А). Чтобы доказать функциональность печеночного органоида, с помощью иммуноферментного анализа были измерены уровни альбумина, аполипопротеина B и A1¹⁴ , собранных из среды печеночных органоидов. На D-42 и D-46 уровни мРНК ALB оставались значительно выше в T4-HO по сравнению с T3-HO или V-Ho в 3,0 и 2,5 раза соответственно (рис. 3B). С другой стороны, уровни APOB были в ~10 и 3 раза выше (рисунок 3C), а уровни APOA1 были в ~3 раза и ~2 раза выше (рисунок 3D) у D-42 и D-46 соответственно.

Рисунок 1: Стадии дифференцировки от hiPSC к печеночным органоидам. (A) Переходный рост hiPSC (линия CS03iCTR-n3) от 0 ч до 96 ч, достигающий примерно 70%-80% слияния в лунках одного планшета. Масштабная линейка: 125 мкм. (B) Прогрессирование начальной стадии дифференцировки гиПСК в дефинитивную энтодерму (ДЭ), показывающее 100% слияние в предыдущий день (D минус 1) через 24 ч и дифференцировку до D4 (от D-0 до D-4). Масштабная линейка: 300 мкм. (C) Дифференцировка от DE (D-4) в заднюю переднюю кишку (PFG; D-10) с T4 добавлен B26. Масштабная линейка: 300 мкм. (D) Трансформация 2D-PFG в 3D незрелые органоиды печени (IHO) с добавлением T4-B26 из D-10 в виде одиночных клеток до D-18, за исключением D-13. Масштабная линейка: 300 мкм. (E) Поддержание и рост органоидов гепатобластов (ГБО) с добавлением Т4 B26 в D-20, D-22, D-24 и D-26. Масштабная линейка: 300 мкм. (F) Диссоциация HBO в D-26 (~2,5 x 10⁵ клеток в 750 μL; слева) и HO1 в D-30 (~4 x 10⁵ клеток в 750 μL; справа) на одиночные клетки с добавлением T4-B26. На врезке показан квадратный размер камеры Нойбауэра 1 мм, в то время как меньший квадрат имеет размер 250 мкм. Изображения были сделаны в HHO, у которых свободная концентрация Т4, используемая в среде, составляла ~15 пМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Мониторинг и характеристика дифференциации HHO. (A) Экспрессия уровней мРНК маркеров hiPSC (POU5F1, SOX2), определенной энтодермы (DE; OTX2, CER1, FOXA2) и задней передней кишки (PFG; TBX3, HNF4A, CDX2). (iPSC, n=8; DE и PFG n=7; HNF4A в ПФГ, n=6). (B) Иммунофлюоресценция при hiPSC, DE и PFG OTX2 (вверху, красный), HNF4A (средний, зеленый) и TBX3 (внизу, красный). (C) «Иммунофлюоресценция на D-18, D-26 и D-46 альбумина (красный) и HNF4A (зеленый). (D) Иммунофлюоресценция на D-18, D-26 и D-46 MKI67 (зеленый) и TBX3 (красный). (E) Иммунофлуоресценция на уровне D-46 альбумина (маркер гепатоцитов; красный) и KRT7 (маркер холангиоцитов; зеленый). Ядра показаны с помощью 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Эта цифра была изменена по сравнению с^{цифрой 14}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ созревания HHO. (A) Относительные уровни мРНК пролиферативного маркера MKI67 в отсутствие TH (черный) по сравнению со свободным T4 при ~15 pM (красный) в среде от D-10 до D-46 (n=4, за исключением T4-HOs при D-42, n=2; и при D-46, n=3). (B) Уровни альбумина измеряли в среде от D-35 до D-50 в трех условиях: отсутствие TH (черный), со свободным T4 при ~15 pM (красный) и свободным T3 при ~10 pM (синий; n=4). (С, Г) Уровни аполипопротеинов B (APOB) и A1 (APOA1) измерялись в среде от D-35 до D-50 в трех условиях: отсутствие TH (черный); и со свободным T4 при ~15 pM (красный). Данные с 10 органоидов на лунку (n=4). Двусторонний t-критерий Стьюдента для сравнения V-HO с T4-HO днями и односторонний ANOVA и тест Тьюки были использованы для множественных сравнений. Данные представляют собой среднее значение дубликатов, представленное в виде выровненных точечных диаграмм и их среднего значения. *: p<0.05; **: p<0.01; : р<0,001; : p<0.0001. Ось x указывает дни дифференцировки. Эта цифра была изменена по сравнению с^{цифрой 14}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Текущий протокол предлагает различные методологические детали того, как работать с гиПСК и последующими 3D-культурами органоидов. Это включает в себя два основных критических этапа: (i) отделение двухмерных культур и последующее их развитие в трехмерные органоиды печени через 10 дней, а также (ii) тонкая диссоциация трехмерной структуры на отдельные клетки. Основываясь на имеющейся информации, это первый отчет о 3D-модели HHO для изучения действия гормонов щитовидной железы, демонстрирующий пиковую экспрессию DIO2 в гепатобластоподобных клетках¹⁴ , как это первоначально было идентифицировано у мышей²⁰ печени P1.

Как и во многих других методах, использующих каркасы, наносимые на клетки, гель внеклеточного матрикса был использован для имитации внеклеточного матрикса²¹, тем самым облегчая сборку в характерную трехмерную структуру органоидов. Термочувствительный характер этого реагента подчеркивает важность манипуляций с ним, сохраняя его замороженным и, во время работы, погруженным в лед. Следовательно, использование другого геля с внеклеточным матриксом^{возможно22}, хотя в этом протоколе ИПСК не прикреплялись и не пролиферировали в пластине с отсутствием каркаса, что делает его надлежащее управление решающим аспектом в начале протокола, наряду с генерацией трехмерных органоидов.

После завершения дифференцировки ГК жизнеспособная диссоциация органоидов в отдельные клетки представляла собой еще одно серьезное препятствие, которое необходимо было преодолеть, поскольку механические нарушения могут спровоцировать гибель клеток, к тому времени данные секвенирования РНК низкого^{качества.} Для обеспечения оптимальных результатов настоящий протокол показал, что может быть достигнуто более 70% жизнеспособности одиночных клеток с диссоциацией более 10⁵ клеток до и после фиксации для последующего штрихкодирования.

В отличие от других рукописей, описывающих только один тип клеток в органоидах⁷, дифференцировка HHO включает по крайней мере две клетки, происходящие из гепатобластов: гепатоциты и холангиоциты. Включение двух реагентов, ответственных за их образование, HFG²⁴ и EGF²⁵, а также дексаметазона²⁶, который способствует созреванию гепатоцитов, и Jagged-1¹⁸, который активирует передачу сигналов Notch, ведущую к холангиоцитам. Эта переплетенная сигнальная сеть при разработке ОГ позволяет достичь 3D-структуры и мимикрировать эксперименты in vivo, в дополнение к преодолению недостатка снижения дифференцировки долговременных культур первичных гепатоцитов27. Примечательно, что, несмотря на экспрессию типичных для взрослых печеночных маркеров, присутствие фетальных маркеров в поздних фазах органоидов²⁸ все еще может быть обнаружено, как это демонстрирует данный протокол. Это, по сути, отражает нормальное развитие печени у человека, у которого печеночные маркеры плода могут быть в норме обнаружены до 1 года^жизни29.

Нечастым явлением, наблюдаемым во время развития ИПСК в ГОО (особенно в незрелые периоды ГО, например, в последние дни ИГО и некоторых ГБО и ГО1), было появление чрезмерно развитых кистозных структур, которые в конечном итоге исчезали, как только пластины помещались на шейкер. Это непропорциональное прогрессирование кистозных структур предполагает наличие некротического ядра к тому времени, необходимость более высокого орошения³⁰ с более частыми изменениями среды или добавление небольших объемов геля внеклеточного матрикса для устранения чрезмерного роста кисты.

В отличие от первоначальной публикации, в которой основное внимание уделялось увеличению числа органоидов в последний период дифференцировки для высокопроизводительного скрининга лекарственных^{средств11}, метод, о котором сообщается, представил использование планшетов ULA для содействия раннему образованию 3D-органоидов большого размера и облегчения работы с HHO. Эти корректировки демонстрируют гибкость и широкий спектр исследований, которые могут быть выполнены с помощью этого простого протокола.

Антонио К. Бьянко является консультантом компаний Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics. У других авторов нет соответствующих разоблачений.

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).