iPSC 유래 3D 인간 간 오가노이드 생성을 위한 통합 프로토콜

인간 iPSC 유래 3D 간 오가노이드는 갑상선 호르몬이 간 발달에 미치는 작용을 이해하기 위한 잠재적인 도구입니다.

배양에서 안정적인 간 세포를 얻는 것은 간 연구에 중요한 도전이 됩니다. 이를 염두에 두고 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 활용하여 인간 간 오가노이드(HHO)의 3D 배양을 생성하는 최적화된 방법을 설명합니다. HHO의 활용은 간 발달을 이해하고, 간 질환을 풀고, 약물 개발을 위한 고처리량 연구를 수행하고, 간 이식의 가능성을 탐색하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다. 이전 조사에서는 면역형광 및 정량적 RT-PCR 기술을 통해 진행을 모니터링하여 서로 다른 발달 단계에 걸쳐 간아세포와 같은 다양한 세포 집단과 두 가지 유형의 간세포 유래 세포(담관세포 또는 간세포 유사 세포)의 존재를 확인했습니다. 이 보고서는 hiPSC에서 시작하여 인간 배아 발달 단계를 반영하는 HHO를 획득하는 간단한 3D 프로토콜을 제시합니다. 46-50일에 걸친 프로토콜은 (i) HHO를 생성하기 위한 hiPSC 배양의 세심한 관리, (ii) 2D에서 세포 분화 시작 및 이후 3D로의 전환, (iii) 단일 세포 RNA 염기서열분석을 위해 HHO를 단일 세포로 분해하기 위한 최적화된 해리 전략. 이 접근법의 광범위한 적용에 대한 예시로서, 본 프로토콜은 이전에 간 세포 발달에서 갑상선 호르몬 신호의 역할을 밝히기 위해 적용되었습니다.

간은 포도당 및 케톤체와 같이 쉽게 사용할 수 있는 에너지 기질의 가용성을 조절하고 생체 이종 화합물을 해독하는 등 다양한 대사 기능을 수행합니다. 최근 몇 년 동안 간 질환의 유병률이 크게 증가했는데, 이는 주로 비알코올성 지방간염(NASH)에 기인하며, 이를 치료하지 않으면 간경변이나 암으로 발전할 수 있습니다¹. 따라서 효과적인 치료법의 개발을 촉진하기 위해 간 및 관련 질환의 대사 기능을 이해하는 것이 필수적입니다 ^2,3.

3차원(3D) 배양의 출현으로 오가노이드 모델이 탄생했으며, 이는 장기 발달의 기능과 복잡성을 해결하기 위한 획기적이고 혁신적인 접근 방식을 나타냅니다⁴. 오가노이드(organoid)는 각 기관의 기능과 세포구조를 모방하는 분화된 세포의 3D 자기 조직화된 응집체로 정의됩니다⁵.

지난 수십 년 동안 다양한 인간 iPSC 유래 세포⁶ 또는 단층⁷ 또는 전구 세포를 분화시키는 ^{것7 등} 수많은 인간 간 오가노이드(HHO) 프로토콜이 광범위한 관심을 끌었습니다. 이러한 접근법은 고처리량^{약물 스크리}닝9부터 간 질환의 기저에 있는 메커니즘에 대한 추가 통찰력 확보에 이르기까지 다양한 잠재적 목표에 적합합니다¹⁰.

여기에서는¹¹ 에 언급된 화학적 단서를 기반으로 한 HHO 감별의 단계별 프로토콜이 방법론적으로 조정된 변형과 함께 수행됩니다. 이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 적절한 취급 및 배양으로 시작하여 세포외 기질 겔 조작, 세포 통과 및 HHO로의 분화를 위한 기술을 자세히 설명합니다. 이 과정은 hiPSC의 분화를 최종 내배엽(DE)¹² 으로 자극하고 이후 FGF 및 BMP의 생체 내 효과를 모방하여 후배엽(PFG) 단층 세포의 발달을 촉진하는 것으로 시작됩니다¹³. 3D 구조는 PFG 세포가 담관세포와^{간세포 2}의 태아 전구세포인 간아세포가 될 미성숙 간기로 분화되는 10일째에 달성됩니다. 마지막으로, 3D 구조는 RNA 염기서열분석 연구를 위해 단일 세포로 해리됩니다. 이 프로토콜의 적용 가능성에 대한 예로서, 이 HHO 모델이 간세포와 담관세포의 발달에 대한 갑상선 호르몬 작용 및 유형 2 데이오디나제(D2)의 연구에 어떻게 적합한지 입증되었습니다¹⁴.

1. hiPSC 관리

참고: hiPSC(CS03iCTR-n3 세포주)를 상업적으로 구매했습니다. 세포외 기질 겔 코팅과 hiPSC 배지의 적절한 관리는 hiPSC를 플레이트에 부착하고 공급하는 데 중요합니다. 여기에서는 하나의 6-well 플레이트에 필요한 부피가 설명되었습니다. 오가노이드로 분화하지 않는 6-well 플레이트의 나머지 hiPSC는 장기 보관을 위해 액체 질소에 보관할 수 있습니다.

1. 세포외 기질 겔 및 hiPSC 배지 분주
   1. 세포외 기질 젤의 병을 얼음이 든 용기에 넣고 밤새 4°C에서 적절하게 해동합니다.
      참고: 부분 견적을 작성하기 전에 분석 성적서를 확인하여 희석 계수의 부피를 확인하십시오. 이것은 세포외 기질 젤의 단백질 농도를 나타냅니다. 따라서 로트마다 다릅니다.
   2. 사전 냉각 및 라벨링된 튜브를 사용하여 희석 계수(4x, 2x 및 1x)에 따라 세포 외 매트릭스 겔을 적절한 부분 표본으로 분배합니다. 25mL의 저온 DMEM/F12에 세포외 매트릭스 겔의 4배 희석 계수를 추가하여 4개의 6-well 플레이트를 코팅합니다. 즉시 실험실 밀봉 필름으로 뚜껑을 밀봉하고 -80 °C에서 동결하십시오. 공기에 장기간 노출되거나 부분 표본에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
   3. hiPSC 보충제 배지 100mL를 4°C에서 하룻밤 동안 해동합니다. 400mL의 hiPSC 기초 배지에 첨가합니다. 50 mL 혈청학적 피펫으로 균질화한 후, hiPSC 배지를 40 mL 튜브에 분취하고 사용할 때까지 -20 °C에서 동결합니다.
2. hiPSC 배양을 위한 플레이트 코팅
   1. 6웰 플레이트에 숫자를 매기고 라벨을 붙입니다. 세포 외 매트릭스 젤 부분 표본 하나를 드라이 아이스에 담근 상태로 근처에 두십시오.
   2. 6웰 플레이트 1개를 코팅하려면 세포 외 매트릭스 겔 분취량(1x) 1개를 6.25mL의 차가운 DMEM/F12(2x는 12.5mL로, 4x는 25mL의 DMEM/F12)로 희석합니다.
   3. 소량의 DMEM/F12(~500 μL)를 세포외 매트릭스 겔 튜브에 피펫으로 주입합니다. 위아래로 소용돌이쳐 저온 DMEM/F12로 세포외 기질 겔을 해동 및 균질화하여 기포 생성을 방지하고, 혈청학적 피펫을 사용하여 저온 DMEM/F12 함유 튜브의 나머지 부분으로 되돌려 완전히 혼합합니다.
   4. 6웰 플레이트를 코팅하기 위해 DMEM/F12의 세포외 매트릭스 겔 1mL를 하나의 웰에 삽입합니다(전체 플레이트의 경우 6mL). 플레이트가 완전히 덮일 때까지 흔들지 않고 플레이트를 움직여 1mL를 표면에 고르게 분배합니다.
   5. 사용하기 전에 1시간 동안 실온(RT)에 두십시오. 6웰 플레이트를 완전히 사용하지 않은 경우 실험실용 밀봉 필름으로 밀봉하고 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
      알림: 코팅된 플레이트는 1°C의 냉장고에서 4주일 동안 보관할 수 있습니다.
3. hiPSC의 해동과 배양
   1. hiPSC 배지의 부피를 미리 계산하고 사용 1시간 전에 6웰 코팅 플레이트와 함께 RT에서 데웁니다(웰당 2mL).
      참고: 차갑거나 얼린 부분 표본의 경우 사용 15분 전에 37°C 인큐베이터 또는 수조에 담그십시오.
   2. cryovial의 액체 N₂ 에 있는 hiPSC 1mL를 6웰 플레이트의 3웰로 분리합니다(1:3 비율). 전체 6웰 플레이트의 경우 2개의 cryovials를 사용합니다. 여기서, 프로토콜은 하나의 극저온에서 hiPSC의 해동 및 배양을 설명합니다. 2번의 cryovials에 대해 이 과정을 반복합니다.
   3. 약 1mL의 냉동 hiPSC가 들어 있는 냉동 식품을 캡을 통해 잡고 표재성 물을 통해 밀어 넣고, 바이알 바닥을 37°C의 수조에 담가 해동할 때까지 주입합니다.
   4. 해동되면 cryovial에 에탄올을 분사하고 hiPSC 1mL를 피펫팅합니다. 빈 원뿔형 15mL 튜브에 천천히 분주합니다. 튜브를 부드럽게 흔들면서 따뜻한 hiPSC 중간 5mL를 한 방울 떨어뜨립니다.
   5. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 튜브를 원심분리하고, 펠릿을 방해하지 않고 약간의 잔류 매체를 남기지 않고 진공에 연결된 유리 피펫으로 흡입하여 상층액을 섬세하게 제거합니다. 펠릿을 6mL의 배지에 조심스럽게 재현탁시킨 다음 6웰 플레이트의 3웰에 웰당 2mL를 추가합니다.
      참고: 올바른 성장을 위해 hiPSC의 작은 응집체를 남겨 두십시오.
   6. 6-well 플레이트를 구부리고 팁을 웰 바닥까지 건드리지 않고 이전에 코팅된 플레이트에서 세포외 매트릭스 겔을 흡인합니다.
   7. 웰당 hiPSC가 있는 배지 2mL를 옮깁니다. 플레이트를 앞, 뒤, 좌우로 부드럽게 흔들어 hiPSC 응집체가 플레이트에 고르게 분포되도록 합니다.
   8. 6웰 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도의 인큐베이터에 넣습니다. 배지를 매일 교체하고(웰당 2mL) 점진적인 성장을 확인합니다.
   9. 80%의 성장 합류점이 획득되었을 때(4-5일 후, 그림 1A 참조) 통과 hiPSCs. 건강하고 증식하는 hiPSC의 특징은 뚜렷한 경계와 성장하는 세포 응집체의 중심에 있는 큰 핵의 촘촘한 포장을 포함합니다.
4. hiPSC의 패시에이징
   1. hiPSC가 웰당 약 1.2 x 10⁶ 세포를 나타내는 80% 포화도에 도달하면 새로운 6-well 플레이트로 통과합니다. 1:3의 비율로 분할하거나(1개의 웰에서 3으로) 실험의 요구 사항에 따라 비율(1:4, 1:6)을 조정합니다.
   2. 계대형성 전에 1.2단계에서 설명한 대로 적절한 수의 6-well 플레이트에 필요한 세포 외 매트릭스 겔 임베딩을 준비합니다.
   3. 각 웰에서 상등액을 제거하고 웰당 PBS 2mL를 추가합니다. PBS를 흡입한 다음 웰당 1mL의 hiPSC 분리 배지를 1분 동안 추가합니다. 그런 다음 1mL의 hiPSC 분리 배지를 제거합니다.
   4. 6웰 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 7분 동안 놓습니다. 웰당 1mL의 hiPSC 배지를 추가합니다. 세포가 있는 hiPSC 배지 1mL를 15mL 튜브에 피펫팅하여 분리 및 수집합니다.
   5. 상온에서 5분 동안 300 x g 에서 튜브를 원심분리합니다. 세포를 6웰 플레이트에 플레이트하려면 1.3.5-1.3.7 단계를 반복합니다. 6웰 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도의 인큐베이터에 넣습니다. 1.5단계로 이동합니다. 필요한 경우 hiPSC를 동결합니다.
5. hiPSC 동결(선택 사항)
   참고: HO로 승격시키는 데 필요한 hiPSC의 수는 장기간 저장할 수 있는 남은 웰을 초래할 수 있습니다. 냉동 보관을 위한 계대를 확장해야 하는 경우, hiPSC를 장기간 유지할 수 있습니다.
   1. 필요한 부피의 동결 보존 배지(세포 웰당 1mL)를 4°C의 얼음에 해동합니다. cryotubes에 계대 수, 날짜 및 세포주를 표시합니다. 1.4단계에서와 같이 hiPSC 분리 배지로 세포를 분리합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 있습니다.
   2. 상온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리기. 상층액을 완전히 흡입하고 세포 펠릿을 방해받지 않도록 조심스럽게 둡니다. hiPSC 응집체를 남겨 1mL의 저온 동결 보존 배지(웰당)에 펠릿을 신중하게 재현탁합니다.
      참고: 웰의 밀도가 낮고 유입률이 50% 미만인 경우 웰 2개당 1mL의 동결 보존 매체를 사용할 수 있습니다.
   3. hiPSC가 포함된 동결 보존 배지 1mL를 극저온 튜브로 옮깁니다. 세포 함량을 균질화하기 위해 cryotube를 부드럽게 교반합니다.
      알림: 냉동 보존할 튜브를 더 준비하는 경우 이미 준비된 튜브를 얼음 속에 두십시오.
   4. 튜브를 -80°C의 제어 속도 냉동 용기에 밤새 놓습니다. 24시간 후에 튜브를 액체 질소 탱크로 옮깁니다.

2. hiPSC에서 간 오가노이드로의 단계적 분화

참고: 시약의 재구성은 제조업체의 지침에 따라 수행되고 수행되었습니다.

1. hiPSC에서 DE로의 2D 분화(0일-4일(D-0에서 D-4); 그림 1B)
   1. 3회 계대 후 세포가 건강하고 잘 성장하고 빠르게 성장하면 hiPSC의 분화를 진행합니다. 1.2단계에서 설명한 대로 6웰 플레이트를 코팅합니다. hiPSC를 DE로 구별하려면 제조업체의 지침에 따라 DE 키트를 활용하십시오.
   2. 분화를 시작하기 전에 24시간 동안 2:1(6웰에서 3웰을 얻어 분화를 시작함)의 통과 비율로 hiPSC를 배양하여 DE 지침에 표시된 웰의 세포 농도를 달성합니다.
   3. 다음과 같은 수정 사항을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 차별화를 수행합니다.
      1. hiPSC에 첨가된 Y-27632의 농도를 10μM에서 50μM로 높입니다(분화 시작 하루 전).
      2. 해리 시약의 웰당 1.5 mL와 DMEM/F12의 부피를 해리 시약과 동일한 양으로 증가시킵니다. 각 웰에 1mL의 DMEM/F12(1.5 중)를 추가하고 15 또는 50mL 튜브에 0.5mL를 추가로 추가합니다.
2. DE 세포를 PFG 세포로 분화(D-4에서 D-10; 그림 1C)
   1. PFG로 유도하기 며칠 전에 DE 세포의 분화를 위해 PFG 배지(기초 배지로 Advanced DMEM/F12, 1x Glutamax 보충제, 1x B27 보충제, 20 ng/mL BMP4, 10 ng/mL FGF2)를 준비하고 4 °C에서 보관합니다.
      참고: B27은 구성의 일부로 T3를 포함합니다. 갑상선 호르몬(TH) 연구의 경우, 여기서부터 B27을 TH가 포함되지 않은 수제 B26¹⁵ 로 대체해야 합니다.
   2. PFG 배지(웰당 2mL)와 고급 DMEM/F12를 37°C에서 15분 동안 또는 RT로 1시간 동안 가열합니다. 플레이트를 구부리고 셀을 긁지 않고 진공 청소기에 연결된 유리 피펫을 사용하여(또는 P1000 피펫을 사용하여 수동으로) 웰에서 DE 매체를 흡인합니다.
   3. 웰당 따뜻한 고급 DMEM/F12 2mL를 추가한 다음 흡입합니다. 6-well 플레이트에 웰당 2mL의 따뜻한 PFG 배지를 추가합니다. 다음 6일 동안 매일 배지를 교체하십시오.
3. 2D PFG 세포에서 3D 미성숙 간 오가노이드(IHO; D-10에서 D-18)
   참고: 96웰 ULA 플레이트의 각 웰에 첨가된 30μL에는 거의 30,000-35,000개의 셀이 필요합니다. 통과 비율은 2 : 1이며, 분화 된 PFG 세포의 단층이있는 2 웰 (6 웰 플레이트)에서; 완전한 96웰 ULA(Ultra-Low Attachment) 플레이트를 제공합니다(그림 1D).
   1. 3D 오가노이드를 시작하기 전 또는 그 초기에 IHO 배지(기초 배지로 Advanced DMEM/F12, 1x N2 보충제, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM 덱사메타손, 5 μM CHIR99021, 500 nM 발프로산, 50 ng/mL 인간 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/mL 인간 간세포 성장 인자(HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclic 35 monophosphate sodium salt (dbCAMP), 10 μM Nicotinamide)를 사용하여 4 °C에서 보관합니다.
   2. 96웰 ULA(Ultra-Low Attachment) 플레이트에 라벨을 붙입니다. PFG 세포를 분리하려면 제조업체의 지침에 따라 세포 해리 효소를 사용하십시오.
   3. 사용하기 전에 해리 효소, 고급 DMEM/F12 및 PBS를 37°C에서 가열합니다. 웰의 PFG 매체를 흡입하고 폐기합니다. 웰당 PBS 2mL를 추가한 다음 흡입합니다.
   4. 웰당 1.5mL의 세포 해리 효소를 37°C에서 7분 동안 첨가하여 웰에서 세포를 분리합니다. 세포 해리 효소를 제거하지 않고 1mL의 고급 DMEM을 추가합니다. 모든 세포를 모아 50mL 튜브에 넣습니다.
   5. 세포 계수기 또는 혈구계로 mL당 세포 수를 계산합니다. 150 x g 에서 8분 동안 원심분리기
   6. 펠릿에 적절한 부피(전체 96-well ULA 플레이트에 대한 IHO 배지 3mL)와 1x 세포외 매트릭스 겔을 추가하여 필요한 최종 세포 수(30,000-35,000 세포)에 맞게 조정합니다.
   7. 96웰 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 24시간(D-11) 후 세포는 원형으로 재편성됩니다. IHO 배지의 웰당 50μL를 추가합니다.
   8. 다음 날(D-12)에는 웰당 100μL의 IHO 배지로 증가시킵니다. D14에서 진공 청소기에 연결된 유리 피펫 또는 피펫을 하나씩 사용하여 각 웰에서 ~100-120 μL를 제거합니다. 오가노이드를 흡인하지 않도록 주의하세요. D-14 및 D-16에 100μL의 IHO 배지를 추가합니다.
      주석: D-16 이후에는 움직임 중이 아니기 때문에 과도한 성장이 나타나다가 D18 이후에는 사라진다.
4. 간아세포 오가노이드(HBO, D-18 to D-26)
   참고: 이 단계에서는 96웰 ULA 플레이트의 IHO가 6웰 ULA 플레이트로 재배치됩니다. 이전 단계의 96개 IHO에 대해 웰당 10개의 오가노이드를 배치했으며, 이는 숙성을 진행하기 위해 총 1 및 1/2 6웰 ULA 플레이트를 나타냅니다(그림 1E).
   1. 이전 차별화 단계에서 수행한 것처럼 이전 날에 HBO 차별화 매체를 준비합니다.
      1. HBO로 분화하는 데 사용되는 시약의 칵테일은 2.3단계에서 설명합니다. 발프로산을 제거하고 BMP7, BMP4 및 FGF7과 같은 생화학 물질을 칵테일에 통합합니다. 최종 조성물은 기초 배지로서의 Advanced DMEM/F12, 1x N2 보충제, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM 덱사메타손, 5 μM CHIR99021, 500 nM 발프로산, 50 ng/mL 인간 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/mL 인간 간세포 성장 인자(HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclic 35 monophosphate sodium salt (dbCAMP)입니다. 10μM 니코틴아미드, 25ng/mL FGF7, 50ng/mL BMP4, 20ng/mL BMP7.
   2. 이전 HBO 배지(웰당 3mL) 및 Advanced DMEM/F12(웰당 3mL)를 37°C에서 예열합니다. 각 웰에 3mL의 따뜻한 고급 DMEM/F12를 추가합니다.
   3. 200mL 너비의 보어 팁이 있는 96웰 플레이트에서 웰당 10개의 IHO 오가노이드를 분배합니다. 플레이트를 구부리고 진공 청소기에 연결된 유리 피펫으로 흡입하여(또는 P1000을 사용하여 수동으로) 고급 DMEM/F12를 제거합니다.
   4. 웰당 따뜻한 HBO 배지 3mL를 추가합니다. 6-well ULA 플레이트를 켜고 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도로 설정된 인큐베이터 내부의 65rpm으로 다중 플랫폼 셰이커에 놓습니다. 4일(D-22) 및 6일(D-24) 후에 HBO 배지(웰당 3mL)를 교체합니다.
5. 2가지 다른 단계를 통해 간 오가노이드(HO)로 성숙(D-26 - D-46)
   참고: 이것은 배지의 내용물과 시약의 유형으로 인해 두 번의 분화 기간에 발생하는 마지막 성숙 과정입니다.
   1. 첫 번째 HO(HO1) 매체를 미리 준비하고 4°C에서 보관하십시오. Jagged1을 제거하고 HBO 배지에 비해 CHIR99021의 농도를 줄입니다. 최종 조성은 다음과 같습니다: 기초 배지로서의 고급 DMEM/F12, 1x N2 보충제, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM 덱사메타손, 2 μM CHIR99021, 50 ng/mL 인간 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/mL 인간 간세포 성장 인자(HGF), 300 ng/mL N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclic 35 monophosphate sodium salt (dbCAMP), 10 μM 니코틴아미드, 25ng/mL FGF7, 20ng/mL BMP4, 20ng/mL BMP7.
   2. 사용하기 전에 Advanced DMEM/F12 및 HO1 매체를 37°C에서 예열하십시오. 동일한 6-well ULA 플레이트에서 플레이트를 구부리고 진공 청소기에 연결된 유리 피펫의 팁을 벽에 대고 배치하여(또는 P1000 피펫을 사용하여 수동으로) 이전 HBO 매체를 조심스럽게 흡입합니다.
   3. 웰당 따뜻한 Advanced DMEM/F12 3mL를 추가하고 흡입합니다. 웰당 따뜻한 HO1 배지 3mL를 추가합니다. 샘플 채취와 함께 HO1 배지를 3일마다(D-29, D-32, D-35, D-38) 교체합니다.
   4. D 38에서 CHIR99021, BMP4, dbcAMP 및 FGF7을 제거하고 FGF19 및 DAPT로 대체하여 HO(HO2)의 두 번째 기간에 대한 시약의 칵테일을 수정합니다. 최종 배지 조성은 기초 배지로서의 Advanced DMEM/F12, 1x N2 보충제, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM 덱사메타손, 50 ng/mL 인간 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/mL 인간 간세포 성장 인자(HGF), 10 μM 니코틴아미드, 20 ng/mL BMP7, 25 ng/mL FGF19, 5 μM DAPT입니다.
   5. 사용하기 전에 Advanced DMEM/F12 및 HO2 매체를 37°C에서 예열하십시오. 6-well ULA 플레이트를 동일하게 계속하고 이전 HO1 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 웰당 3mL의 Advanced DMEM/F12를 추가하고 제거합니다.
   6. 웰당 따뜻한 HO2 배지 3mL를 추가합니다. HO2 배지를 4일마다(D-42, D-46, D-50 등) 교체하고 배지를 교체한 당일에 샘플을 채취합니다.

3. 단일 세포 해리

참고: 이 단계는 단일 세포 RNA 염기서열분석 기술에 매우 중요합니다. 오가노이드의 수는 크기에 따라 달라질 수 있으며, 해리 날짜가 오래될수록 오가노이드의 세포 수가 많아집니다. 초기에는 해리된 오가노이드의 수가 증가했고, 해리 시간도 같은 양으로 감소했습니다. D-14 및 D-17에서 10개의 오가노이드, D-23 및 D-26에서 8개의 오가노이드, D-30 및 D-45에서 6개의 오가노이드로 해리를 수행했습니다. 오가노이드의 한 클러스터에 대한 절차가 자세히 설명되어 있습니다(그림 1F).

1. 시약의 준비
   1. 최종 농도가 7.5% BSA(Bovine Albumin Fraction V)인 Advanced-DMEM을 준비하고 균질화 후 여과합니다.
   2. 1mL의 트립신 0.5% - EDTA(10x)를 기초 배지로 사용하고, 50 μM Y-27632, 40 U/μL RNase 억제제 및 1 U/μL DNase I를 사용하여 해리 효소 배지 1 mL를 준비합니다.
   3. 2 mL의 Advanced DMEM/F12 + 7.5% BSA를 기초 배지로 사용하고, 50 μM Y-27632, 40 U/μL RNase 억제제 및 1 U/μL DNase I를 사용하여 트립신 불활성화 배지를 준비합니다.
   4. 시작하기 전에 미디어와 PBS를 모두 37°C에서 예열합니다.
2. HHO의 해리
   1. RNase 클리너로 작업장과 도구를 청소하십시오. 팁이 활짝 열린 15mL 폴리프로필렌 튜브에서 분화 날짜에 따른 오가노이드 수를 수집합니다.
   2. PBS 2x-3x로 세척하십시오. 수집된 오가노이드가 있는 15mL 튜브에 1mL의 해리 효소 배지를 추가하고 30rpm의 로커에서 5분 동안 37°C를 유지합니다.
      주의 : 로커에서 튜브를 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.
   3. 5분 후 먼저 캡에 남아 있는 오가노이드가 있는지 확인한 다음 오가노이드당 10회(총 60회) 위아래로 소용돌이쳐 P1000으로 오가노이드를 기계적으로 파괴합니다. P200으로 동일한 중단을 반복합니다. 오가노이드가 튜브 캡에 끼어 있는지 확인하십시오.
   4. 15mL 튜브를 로커에 다시 올려 놓고 5분 동안 인큐베이터에 넣습니다. P200을 위아래로 소용돌이치는 것부터 시작하여 P10 팁에 연결된 1mL 혈청학적 피펫으로 계속하여 포인트 4의 과정을 반복합니다.
   5. 마지막 5분 동안 로커의 15mL 튜브를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 해리가 없는 경우 추가로 5분 동안 그대로 두고 수동 중단을 반복합니다.
   6. 1mL의 트립신 불활성화 배지를 첨가하고 균질화합니다. 40μm 세포 여과기가 있는 새 15mL 폴리프로필렌 튜브를 놓습니다. 40μm 세포 여과기를 통해 2mL(해리 효소 배지와 트립신 불활성화 배지가 있는 세포)를 15mL 튜브로 여과합니다.
   7. 1mL의 트립신 불활성화 배지를 더 추가하여 40μm 세포 스트레이너에서 남아 있는 세포를 회수합니다.
   8. 5μL의 염료 용액과 혼합된 5μL의 단일 세포 배지를 취하여 고정을 진행하기 위해 해리된 세포의 수를 계산합니다. Fixation Kit의 첫 번째 시약으로 원심분리 및 재부유 후 세포를 계수하고 40μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포 여과를 수행합니다.

hiPSC에서 HHOs로의 단계적 분화에 대한 이 프로토콜의 각 단계는 qPCR에 의한 정량적 측정과 참고 문헌에서 알려진 단계 특이적 마커의 면역형광을 사용하여 정의되었습니다(그림 2). 두 기술의 단계별과 HO로의 올바른 분화와 관련하여 달성된 결과는¹⁴에 설명되어 있습니다. 이전 연구에서 hiPSC는 POU5F1(OCT4라고도 함) 및 SOX2의 mRNA 수준을 통해 정의되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 감소하는 잘 알려진 두 가지 Yamanaka 인자¹⁶를 통해 정의되었습니다(그림 2A). 그 후, OTX2, CER1 및 FOXA2 및 PFG¹¹ 마커 HNF4A, CDX2 및 TBX3와 같은 DE¹¹ 마커의 mRNA 수준을 면역형광에 의한 OTX2, HNF4A 및 TBX3의 국소 발현과 함께 측정했습니다(그림 2A, B). 3D 승격 후, 알부민과 HNF4a의 면역형광 진행을 따르기 위해(그림 2C); 간세포¹⁸(그림 2D)의 조절에 중요한 증식 마커인 MKI67¹⁷ 및 TBX3은 D-18에서 D-46까지 수행되었습니다. 특히, HNF4a와 공동 국소화된 알부민(그림 2C); 한편, MKI67은 D-46에 산발적으로 등장했다(그림 2D). 또한 D-46에서 HNF4A¹⁹ 및 KRT7¹⁸의 mRNA 수준과 면역형광을 통해 간세포 및 담관세포 유사 세포를 확인했습니다(그림 2E).

개발 중인 오가노이드의 부피는 D-14에서 D-38로 점진적으로 증가했으며, 이는 D-10에 비해 D-22의 증식 마커 MKI67 에 대한 mRNA 수치가 ~2배 증가한 것에서 알 수 있습니다. 배지에 T4가 없기 때문에 10일째에 비해 D-14 및 D-18에서 MKI67 mRNA 수치가 각각 ~20% 및 ~75% 증가했습니다(그림 3A). 간 오가노이드의 기능을 입증하기 위해 ELISA를 사용하여 간 오가노이드의 배지에서 수집한 알부민, 아포지단백 B 및 A1¹⁴ 의 수준을 측정했습니다. D-42 및 D-46에서 ALB mRNA 수치는 T3-HO 또는 V-HO에 비해 T4-HO에서 각각 3.0배 및 2.5배 더 높게 유지되었습니다(그림 3B). 반면, APOB 수치는 D-42와 D-46에서 각각 ~10배 및 3배 높았고(그림 3C), APOA1 수치는 각각 ~3배 및 ~2배 높았습니다(그림 3D).

그림 1: hiPSC에서 간 오가노이드로의 분화 단계. (A) hiPSC(CS03iCTR-n3 라인)의 전이 성장은 0시간에서 96시간으로 증가하여 한 플레이트의 웰에서 약 70%-80% 합류점에 도달합니다. 스케일 바: 125 μm. (B) hiPSC 분화의 초기 단계가 확정 내배엽(DE)으로 진행, 24시간 후 전날(D - 1)에 100% 합류를 보이고 D4(D-0에서 D-4)까지 분화. 눈금 막대 : 300 μm. (C) DE (D-4)에서 후방 foregut (PFG)로의 분화; D-10)에 B26을 추가한 T4와 함께 사용할 수 있습니다. 스케일 바: 300 μm. (D) D-13을 제외한 D-10에서 D-18까지 단일 세포로 T4가 첨가된 B26을 사용하여 2D-PFG를 3D 미성숙 간 오가노이드(IHO)로 변환. 스케일 바: 300μm. (E) D-20, D-22, D-24 및 D-26에서 T4가 첨가된 B26을 사용한 간아세포 오가노이드(HBO)의 유지 및 성장. 눈금 막대: 300 μm. (F) D-26(750 μL의 ~2.5 x 10⁵ 셀, 왼쪽) 및 D-30의 HO1(750 μL의 ~4 x 10⁵ 셀, 오른쪽)에서 HBO를 T4가 첨가된 B26이 있는 단일 세포로 해리. 삽입은 Neuebauer의 챔버의 1mm 정사각형 크기를 보여주며, 여기서 더 작은 정사각형은 250μm를 측정합니다. 이미지는 미디어에 사용된 T4의 자유 농도가 ~15pM인 HHO로 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: HHO의 차별화에 대한 모니터링 및 특성화. (A) hiPSC 마커의 mRNA 수준 발현(POU5F1, SOX2), 확정 내배엽(DE; OTX2, CER1, FOXA2) 및 후방 앞장(PFG; TBX3, HNF4A, CDX2)입니다. (iPSC, n=8; DE 및 PFG n=7; PFG의 HNF4A, n=6). (B) OTX2(위, 빨간색), HNF4A(중간, 녹색) 및 TBX3(아래, 빨간색)의 hiPSC, DE 및 PFG에서의 면역형광. (C) "알부민(빨간색) 및 HNF4A(녹색)의 D-18, D-26 및 D-46에서의 면역형광. (D) MKI67(녹색) 및 TBX3(빨간색)의 D-18, D-26 및 D-46에서의 면역형광. (E) 알부민(간세포 마커, 빨간색) 및 KRT7(담관세포 마커, 녹색)의 D-46에서의 면역형광. 핵은 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)로 표시됩니다. 이 그림은¹⁴에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: HHO의 성숙 분석. (A) TH(검은색)가 없는 경우 증식 마커 MKI67의 상대적 mRNA 수준 대 D-10에서 D-46까지의 매체에서 ~15pM(빨간색)의 유리 T4(빨간색)에서 D-42, n=2 및 D-46, n=3의 T4-HO를 제외한 n=4). (B) 알부민 수치는 D-35에서 D-50까지의 배지에서 세 가지 조건으로 측정되었습니다 : TH (검정색)의 부재, ~ 15 pM (빨간색)에서 자유 T4 및 ~ 10 pM (파란색, n = 4)에서 자유 T3. (C, D) Apolipoprotein B (APOB) 및 A1 (APOA1) 수준은 세 가지 조건에서 D-35에서 D-50까지의 배지에서 측정되었습니다 : TH (검정색) 부재; ~15pM(빨간색)에서 무료 T4가 있습니다. 웰당 10개의 오가노이드에서 얻은 데이터(n=4). V-HO와 T4-HO 일수를 비교하기 위한 양측 학생 t-검정과 단방향 분산 분석 및 Tukey 검정을 다중 비교에 사용했습니다. 데이터는 중복의 평균으로, 정렬된 산점도와 그 평균으로 표시됩니다. *: p<0.05; **: p<0.01; : 피<0.001; : p<0.0001. x축은 차별화 일수를 나타냅니다. 이 그림은¹⁴에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

현재 프로토콜은 hiPSC 및 후속 3D 오가노이드 배양을 처리하는 방법에 대한 다양한 방법론적 세부 정보를 제공합니다. 여기에는 두 가지 주요 중요 단계가 포함됩니다: (i) 2D 배양물을 분리한 다음 10일 후에 3D 간 오가노이드로 발전시키는 단계와 (ii) 3D 구조를 단일 세포로 섬세하게 해리하는 것입니다. 이용 가능한 정보에 근거하여, 이것은 갑상선 호르몬 작용을 연구하기 위한 3D HHO 모델의 첫 번째 보고서이며, P1 간 마우스²⁰에서 원래 확인된 바와 같이 간아세포^{유사 세포 14}에서 DIO2의 최대 발현을 입증합니다.

세포에 적용된 골격을 활용하는 다른 많은 기술과 마찬가지로, 세포외 기질 겔을 사용하여 세포외 기질²¹을 모방하여 오가노이드의 특징적인 3D 구조로의 조립을 용이하게 했습니다. 이 시약의 열에 민감한 특성은 시약을 냉동 상태로 유지하고 취급하는 동안 얼음에 담그는 조작의 중요성을 강조합니다. 결과적으로, 다른 세포외 기질 겔을 사용하는 것이 가능하지만,²² 이 프로토콜에서는 hiPSC가 스캐폴드 부재 플레이트에 부착 및 증식하지 않았기 때문에 3D 오가노이드 생성과 함께 프로토콜 초기에 적절한 관리가 중요한 측면이 되었습니다.

HO의 분화를 완료한 후, 오가노이드가 단일 세포로 실행 가능한 해리되는 것은 기계적 파괴가 세포 사멸을 유발할 수 있기 때문에 저품질의 RNA 염기서열 분석 데이터²³까지 극복해야 할 또 다른 주요 장애물을 나타냈습니다. 최적의 결과를 보장하기 위해 본 프로토콜은 후속 바코드를 위해 고정 전후에 10개 이상의⁵ 개 세포를 해리하여 70% 이상의 단일 세포 생존력을 달성할 수 있음을 보여주었습니다.

오가노이드에서 단 하나의 세포 유형만을 기술하고 있는 다른 원고들과는^달리7, HHO의 분화는 적어도 두 개의 간세포 유래 세포, 즉 간세포와 담관세포 유사 세포를 포함한다. 간세포의 형성을 담당하는 두 가지 시약인 HFG²⁴ 및 EGF²⁵, 그리고 간세포의 성숙을 촉진하는 덱사메타손²⁶, 담관세포로 이어지는 노치 신호를 활성화하는 Jagged-1¹⁸ 의 통합. HO 개발에서 이러한 얽힌 신호 네트워크를 통해 3D 구조를 달성하고 생체 내 실험을 모방할 수 있을 뿐만 아니라 1차 간세포의 장기 배양 분화 감소라는 단점을 극복할 수 있습니다²⁷. 전형적인 성인 간 마커의 발현에도 불구하고, 오가노이드²⁸의 진행된 단계에서 태아 마커의 존재가 여전히 검출될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이는 실제로 인간의 정상적인 간 발달을 반영하며, 태아 간 표지자는 생후 1년까지 정상적으로 검출될 수 있다²⁹.

hiPSC가 HHO로 발달하는 동안(특히 IHO 및 일부 HBO 및 HO1의 마지막 날과 같이 HO의 미성숙 기간 동안) 관찰되는 드문 발생은 과도하게 발달된 낭포 구조의 출현이었으며, 플레이트를 셰이커에 놓으면 결국 사라졌습니다. 낭성 구조의 이러한 불균형적인 진행은 괴사 코어가 그때쯤이면 더 빈번한 매체 변화와 함께 더 높은 관개³⁰ 의 필요성 또는 과도한 낭종 성장을 제거하기 위해 소량의 세포 외 기질 겔의 추가가 필요함을 시사합니다.

고처리량 약물 스크리닝을 위한 마지막 분화 기간 동안 오가노이드의 수가 증가한 것에 초점을 맞춘 기존 간행물과는 달리,¹¹ 현재 보고된 방법은 대형 3D 오가노이드의 조기 형성을 촉진하고 HHO의 처리를 용이하게 하기 위해 ULA 플레이트의 사용을 도입했습니다. 이러한 조정은 이 간단한 프로토콜을 통해 수행할 수 있는 유연성과 광범위한 연구를 보여줍니다.

안토니오 C. 비앙코(Antonio C. Bianco)는 애브비(Abbvie), 아셀라(Acella), 알리고스(Aligos), 신토닉스(Synthonics)의 컨설턴트입니다. 다른 저자는 관련 공개 내용이 없습니다.

이 연구는 미국 국립당뇨병·소화기·신장질환 연구소(NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB)에 있습니다.