Visualisierung von Bodenmikroorganismen mit dem Contact Slide Assay und Mikroskopie

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Bradley Schmitz

Boden umfasst die dünne Schicht an der Erdoberfläche, mit biotischen und abiotischen Faktoren, die dazu, Leben beitragen. Der abiotische Anteil umfasst anorganischer Partikeln bis hin in Form und Größe, die Beschaffenheit des Bodens zu bestimmen. Die biotische Teil beinhaltet Pflanzenreste, Wurzeln, organischen Stoffen und Mikroorganismen. Boden Mikrobe Fülle und Vielfalt ist weiträumig, da ein Gramm Boden 10^7-8 Bakterien, 10^6-8 Aktinomyceten 10^5-6 Pilze, 10³ Hefe, 10^4-6 Protozoen, 10^3-4 Algen und 5³ Nematoden enthält. Zusammen bilden die biotischen und abiotischen Faktoren Architekturen um Pflanzenwurzeln, bekannt als der Rhizosphäre, die günstige Bedingungen für Bodenmikroorganismen zu bieten.

Biotische und abiotische Faktoren fördern, Leben im Boden. Allerdings tragen sie auch stressig Dynamik, die Mikroben zu begrenzen. Biotischen Stress beinhaltet Wettbewerb zwischen den Leben anzupassen und Umweltbedingungen zu überleben. Zum Beispiel können Mikroben hemmende oder toxische Substanzen zu benachbarten Mikroorganismen Schaden absondern. Penicillium Notatum ist ein berühmt-berüchtigten Pilz, da es Konkurrenz um Nährstoffe reduziert durch die Herstellung einer antimikrobielles, welche Menschen zu ernten, um die pharmazeutischen Penicillin zu erstellen. Abiotische Belastungen ergeben sich aus physikalischen oder chemischen Eigenschaften, die Begrenzung der mikrobiellen überleben, wie Licht, Feuchtigkeit, Temperatur, pH-Wert, Nährstoffe und Textur.

Direkt beobachten die Zusammenhänge zwischen Bodenorganismen, Partikel und Verhaltensweisen innerhalb unterschiedlicher Boden Umgebungen ist schwierig, aber der Kontakt Folie Test, auch bekannt als die begraben-Slide-Technik, entwickelt von Rossi Et al. (1936) bietet einen Momentaufnahme Aussichtspunkt in Bodenmikrobiologie. Diese Methode eignet sich für die Beobachtung Bodenpilze, Actinomyceten und Bakterien über Mikroskopie. Obwohl es nicht für mikrobielle Quantifizierungen vorgesehen ist, impliziert als es nur ein kleinen Teil einer größeren heterogenen Umgebung.

Diese Methode wird leicht durch vergraben einen Objektträger in Boden für mehrere Tage, dann befestigen die Mikroorganismen auf der Folie mit Essigsäure durchgeführt. Die Mikroben sind mit Rose Bengal Farbstoff gefärbt und über Mikroskopie mit Ölimmersion auf dem 100 X Objektiv beobachtet. Drei mikrobielle Gruppen lassen sich unterscheiden, wie Bakterien als kleine abgerundete Formen, Actinomyceten Filamente als dünne Saiten und pilzliche Hyphen als dicke Fäden erscheinen. Im Boden, fast alle Bakterien sind kleiner und runder als diejenigen in Reinkultur durch Ernährung Stress, wodurch schrumpfen und Rundung für eine günstigere Oberfläche: Volumen-Verhältnis. Die unregelmäßigen dunklen Formen nicht befleckt sind Bodenteilchen. Verschiedenen Nährstoffen Änderungsanträge können hinzugefügt werden, auf den Boden, Kohlenstoff und Glukose Quellen bereitzustellen, die Wachstum von Mikroorganismen und Interaktionen zu fördern. Diese Technik ermöglicht eine einfache Beobachtung der Bodenmikrobiologie und hilft, um mehrere Organismen in der Umwelt zu identifizieren.

1. Folie Mikrokosmos Bodenbearbeitung

1. Gartenerde zu sammeln, von der Oberfläche (0-6 "Tiefe), und wiegen 150 g Boden in zwei separaten Tassen.
   1. Wenn Boden hohen Dichte an organischer Substanz hat, wiegt 100 g.
2. Beschriften Sie eine Tasse "Behandlung" und die anderen "Kontrolle."
3. Berechnen Sie die Menge an Wasser benötigt, um Feuchtigkeit-Inhalt zu verändern.
   1. Feuchtigkeit-Inhalt ist oft in der Nähe von Feldkapazität.
      
4. Maßnahme Menge von destilliertem Wasser mit einem Messzylinder.
5. Zwei Fläschchen Gießen Sie Menge von destilliertem Wasser.
6. Label ein Fläschchen "Behandlung" und die anderen "Kontrolle."
7. Ändern Sie das Wasser in der "Behandlung" Durchstechflasche mit genügend Glukose für eine endgültige Boden Glukosekonzentration von 1 %, nach einer trockenen Gewicht-Basis im Boden "Behandlung".
8. 200 mg NH₄Nr.₃ in der "Behandlung" Fläschchen und rühren um die Änderungen zu lösen. Das Nitrat dient als Stickstoffquelle von Nährstoffen für die Bodenmikroben.
9. Ändern Sie das "Control"-Fläschchen nicht.
10. In kleinen Aliquote von etwa 50 mg Mischen der Inhalt der Durchstechflasche "Behandlung" in die "Behandlung"-Tasse. Rühren Sie mit einem Spatel nach jeder Aliquote Zugabe.
11. In kleinen Aliquote Mischen der Inhalt der Durchstechflasche "Control" in der "Control"-Tasse. Rühren Sie mit einem Spatel nach jeder Aliquote Zugabe.
12. Vier saubere Objektträger beschriften: zwei "Behandlung" und zwei "Steuern" Folien.
13. Stecken Sie die beiden Folien "Behandlung" in der "Behandlung" Boden-Cup, und stecken Sie die beiden "Control"-Folien in der "Control" Boden-Cup. Lassen Sie 2 cm auf jeder Folie über der Bodenoberfläche zu projizieren, und achten Sie darauf, eine Lücke zwischen den beiden Folien zu verlassen.
14. Die Tassen mit Plastikfolie abdecken und mit einem Gummiband befestigen.
15. Punktion der Wrap mehrmals, damit die Luft, aber nach wie vor übermäßiger Verdunstung zu verhindern.
16. Nehmen Sie das Gewicht der beiden Tassen.
17. 7 Tage inkubieren Sie die Erde gefüllten Tassen bei Raumtemperatur in einem dafür vorgesehenen Bereich/Inkubator.

2. Folie Färbung und Mikroskopie

1. Nehmen Sie das Gewicht der beiden Tassen.
2. Berechnen Sie die Bodenfeuchtigkeit zum Zeitpunkt der Folie entfernen.
3. Entfernen Sie die beiden Folien aus jede Tasse indem Sie auf jeder Folie in eine Schräglage und zurückziehen, so dass die obere Fläche der Folie nicht gestört wird.
4. Identifizieren Sie und markieren Sie die Seite des Schlittens gebeizt und beobachtet werden.
5. Klopfen Sie leicht die Folien auf der Bank-Oberseite, große Schmutzpartikel zu entfernen.
6. Mit einem feuchten Papiertuch reinigen Sie die untere Fläche der Folien. Trocknen Sie die Folien bei Zimmertemperatur.
7. Schutzbrille trägt und hält jede Folie mit der Pinzette, tauchen die Folien in 40 % (V/V) Essigsäure für 1-3 min unter einem Abzug.
8. Waschen Sie die überschüssige Säure unter einem sanften Strahl des Wassers.
9. Bedecken Sie mit Hilfe einer Tropfflasche, die Oberfläche der Folien mit phenolischen Rose Bengal. Unterstützen Sie die Folie auf einem Färbung Gestell über einen Behälter, den überschüssige Fleck zu fangen. Seien Sie vorsichtig, nicht mit Kraft, die Mikroorganismen von der Oberfläche der Folien entfernen kann waschen.
10. Fleck, die Folien für 5-10 min. nicht lassen Sie die Folie werden, trocken. Mehr Fleck nach Bedarf hinzufügen.
11. Waschen Sie vorsichtig die Folien um überschüssige Fleck zu entfernen.
12. Lassen Sie die Folien bei Zimmertemperatur trocknen.
13. Mit der Öl-Immersion-Ziel, beobachten Sie die Folie mit einem Mikroskop (Abbildung 1).

Abbildung 1. Eine Folie unter dem Mikroskop.

Pilze zeigen Dicke, faserigen Hyphen (Abbildung 2). Aktinomyceten anzeigen dünne, filamentöse Hyphen. Bakterien zeigen kleine Kokken oder Stab Formen. Sie sind oft in Büscheln an Bodenpartikel oder Futter pilzliche Hyphen gefunden. Erde-Teilchen zeigen unregelmäßige, dunkle Formen (Abbildung 3).

Abbildung 2. Kontaktieren Sie Diabild mit 100 X Objektiv.
Foto mit freundlicher Genehmigung w.h. Fuller.

Abbildung 3. Kontaktieren Sie Diabild mit 100 X Objektiv.
Foto mit freundlicher Genehmigung w.h. Fuller.

Kontakt Folie-Assay, auch bezeichnet als begraben-Folie, ist eine einfache Technik genutzt, um qualitativ Bodenlebewesen beobachten. Dieser Test zeigt qualitativ die räumlichen Interaktionen zwischen pilzliche Hyphen, gelangte Filamente, Bakterien und Schmutzpartikel. Einzelpersonen oder Industrie kann dieser Test wissen auf einem bestimmten Boden Gesundheit in Bezug auf die Landwirtschaft, zu sammeln beschäftigen, Gartenarbeit, Kompostierung, Lehre und Studium. Diese Technik zu Mikro Bodenlebewesen, jedoch nicht quantifizieren, da es nur ein kleines Portrait von einer größeren heterogenen Umgebung umfasst.

Boden Organismus Beziehungen können beobachtet werden, indem Sie Kontakt Folie Test ausführen und Anzeigen der Ergebnisse durch 100 X Öl Immersion Mikroskopie (Abbildungen 2 und 3). Der Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit für die Durchführung dieses Tests ist es eine tolle Technik für diejenigen, die nie Mikrobiologie ausgesetzt waren und möglicherweise anzeigen Mikroorganismen durch ein Mikroskop zum ersten Mal.

1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).