Isolamento e Cultura de Células Epiteliais Mamárias Humanas Primárias

O presente estudo relata um protocolo mais fácil, que economiza tempo e é econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias (HMECs) a partir de pequenas quantidades de tecido mamário. Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários, tanto para aplicações laboratoriais quanto clínicas.

A glândula mamária é uma estrutura fundamental da mama e desempenha um papel essencial na reprodução. As células epiteliais mamárias humanas (HMECs), que são as células de origem do câncer de mama e outras doenças inflamatórias relacionadas à mama, têm atraído atenção considerável. No entanto, isolar e cultivar HMECs primários in vitro para fins de pesquisa tem sido um desafio devido à sua natureza altamente diferenciada e queratinizada e sua curta vida útil. Portanto, desenvolver um método simples e eficiente para isolar e cultivar HMECs é de grande valor científico para o estudo da biologia da mama e doenças relacionadas à mama. Neste estudo, isolamos com sucesso os HMECs primários de pequenas quantidades de tecido mamário por digestão com uma mistura de enzimas combinada com uma cultura inicial em soro fetal bovino-DMEM a 5% contendo o inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de expansão da cultura em meio de queratinócitos sem soro. Essa abordagem promove seletivamente o crescimento de células epiteliais, resultando em um rendimento celular otimizado. A simplicidade e conveniência desse método o tornam adequado para pesquisas laboratoriais e clínicas, que devem fornecer informações valiosas sobre essas importantes áreas de estudo.

O câncer de mama é o principal tipo de câncer diagnosticado em mulheres em todo o mundo e é a principal causa de morte por câncer¹. A patogênese do câncer de mama é complexa, envolvendo múltiplos fatores, como genética, ambiente e estilo de vida. HMECs, células produtoras de leite ativas, são um dos componentes mais importantes do tecido mamário e provavelmente são as células originais envolvidas na carcinogênese do câncer de mama. Portanto, os HMECs têm recebido mais atenção dos pesquisadores para o estudo do câncer de mama². Além disso, as células primárias têm a capacidade de fornecer uma caracterização biologicamente relevante de processos celulares complexos devido à retenção de estabilidade genética, morfologia normal e um conjunto mais completo de funções celulares básicas que não podem ser alcançadas com linhagens celulares imortalizadas³. Portanto, o isolamento e a cultura de HMECs primários são uma etapa essencial para o estudo da maioria das doenças relacionadas à mama, como câncer de mama e doenças inflamatórias da mama.

Atualmente, um sistema estável e reprodutível para o isolamento, cultura e identificação de células epiteliais mamárias de ratos, vacas, porcos e cabras foi estabelecido 4,5,6,7. No entanto, o isolamento e a cultura de HMECs primários são desafiadores devido ao microambiente complexo e ao baixo rendimento das células. Durante décadas, os cientistas têm procurado o método mais eficaz para isolar e cultivar HMECs, embora um sistema de cultura para HMECs tenha sido estabelecido há quase 20 anos. Por exemplo, Hammond et al. desenvolveram um meio de cultura sem soro no qual os HMECs cresceram eficientemente⁸. Recentemente, Zubeldia-Plazaola et al. testaram quatro métodos de isolamento diferentes usando procedimentos de digestão enzimática rápida/lenta combinados com filtração sequencial ou etapas de centrifugação diferencial para obter HMECs⁹. Eles descobriram que o método de digestão lenta, juntamente com a centrifugação diferencial, é o método mais eficiente para isolar HMECs do tecido mamário fresco. No entanto, esse método de isolamento requer grandes pedaços de tecido (40-75 g) e usa maiores quantidades de enzimas de digestão. Seu procedimento é complicado (pelo menos três centrifugações diferentes para obter diferentes frações celulares), além de demorado. Portanto, ainda é necessário um método simples e rápido para obter eficientemente populações de HMECs a partir de pequenas quantidades de tecido mamário para pesquisa e aplicações clínicas⁹.

Nossos estudos anteriores mostraram que a adição do inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632 no meio de cultura inicial pode simplificar o processo de isolamento de células epidérmicas da pele humana¹⁰, que também tem sido usado com sucesso para o isolamento de células epiteliais gengivais¹¹. Além disso, pesquisas anteriores conduzidas pelo grupo de Zubeldia-Plazaola e pelo grupo de Jin indicaram que o Y-27632 tem a capacidade de estimular o crescimento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliais primárias derivadas do tecido mamário ^9,12. O presente estudo teve como objetivo testar se o uso de Y-27632 simplificaria o isolamento e a cultura de HMECs e estabelecemos com sucesso um método simples e de fácil execução para isolar HMECs de pequenos pedaços (1 g) de tecido mamário.

Os tecidos mamários normais frescos usados neste protocolo são coletados da cirurgia ao redor da lesão de mastite lobular granulomatosa refratária no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang, de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Protocolo No. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).

1. Aquisição de tecido

1. Colete tecidos mamários frescos de espécimes cirúrgicos retirados de mulheres adultas em tubos estéreis contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com penicilina/estreptomicina a 3% (P/S).
   NOTA: Os tecidos mamários devem ser manuseados de acordo com os seguintes detalhes dentro de 24 horas após a coleta da cirurgia.

2. Pré-tratamento do tecido

1. Remova o tecido adiposo do tecido mamário com dois pares de pinças, garantindo que o tecido mamário restante tenha ~ 1 g de peso.
2. Enxaguar o tecido mamário em solução de etanol a 75% (5 mL) por 5 s e depois lavar com 20 mL de solução de lavagem (Tabela 1) por 2 x 5 min.

3. Digestão do tecido

1. Corte o tecido mamário em fragmentos menores, triturando o tecido usando duas lâminas cirúrgicas por um período de 15 min para obter o homogeneizado do tecido. Transfira os pedaços de tecido para um tubo de centrífuga de 50 mL.
2. Adicione 10 mL de dispase 5,0 mg/mL + solução de colagenase 5,0 mg/mL, 3 mL de tripsina a 0,25% e 7 mL de PBS a um total de 20 mL de solução de digestão em um tubo de centrifugação de 50 mL que contém os fragmentos de tecido mamário. Colocar o tubo em banho-maria a 37 °C e incubar durante 1,5 h; agite o tubo a cada 20 min.
3. Pare o processo de digestão injetando 20 mL da solução neutralizante. Misture o conteúdo pipetando ~ 15x.
4. Filtrar a mistura através de um filtro de malha de 100 μm. Centrifugue a 156 × g por 5 min.
5. Remover o sobrenadante e repetir a incubação do sedimento com 20 ml de solução neutralizante. Misture o conteúdo pipetando 15x e centrifugue a 156 × g por 5 min.
6. Remova o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda o pellet celular com 10 mL de meio de cultura inicial. Colocar a suspensão de células numa placa de cultura de células de 100 mm.
7. Cultive as células em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C. Substitua o meio de cultura original por meio de células epiteliais frescas a cada três dias. Verifique as células e atualize o meio a cada 2 dias.

4. Passagem celular

1. Remova o prato de 100 mm da incubadora quando as células atingirem 80%-90% de confluência, descarte o meio usado e enxágue o prato 2x com 2 mL de PBS. Remova o PBS e, em seguida, adicione 2 mL de tripsina a 0,05% em cada placa de 100 mm.
   NOTA: Agite o prato para certificar-se de que a solução de tripsina tenha contato suficiente com o fundo do prato.
2. Coloque o prato de 100 mm em uma incubadora a 37 °C por ~7 min para o processo de digestão.
3. Examine as células com um microscópio usando uma objetiva de 40x para garantir que a maioria das células tenha sido dissociada do fundo do prato.
4. Pare o processo de digestão adicionando 8 mL de solução neutralizante e transfira as células para um tubo de 15 mL. Misture as células pipetando para cima e para baixo 10-15x. Centrifugue as células a 156 × g durante 5 min.
5. Remova o sobrenadante com cuidado, ressuspenda as células com 10 mL de meio de células epiteliais e conte o número de células.
6. Adicionar 1 × 10⁶ células em 10 ml de meio de células epiteliais numa placa de 100 mm.
7. Atualize o meio celular epitelial e observe as células a cada 2 dias.

5. Criopreservação celular

1. Repita as etapas 4.1-4.4.
2. Remova o sobrenadante com cuidado e ressuspenda as células em 2 mL de solução de criopreservação celular.
3. Transfira 1 mL da solução de criopreservação contendo as células para cada frasco criogênico.
4. Registre os nomes das células criopreservadas, os números das passagens e as datas.
5. Coloque os frascos para injetáveis em um recipiente de congelamento a -80 °C durante a noite.
6. Remova os frascos criogênicos do freezer a -80 ° C e transfira-os rapidamente para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

A Figura 1 mostra um esquema do procedimento. O protocolo envolve o uso de uma combinação de enzimas, a saber, dispase, colagenase e tripsina. Essa combinação é utilizada com o objetivo de separar a folha epitelial da camada de fibroblastos abaixo dela e, posteriormente, utilizar a tripsina para dissociar as células epiteliais mamárias em uma suspensão. Além disso, o crescimento de células epiteliais foi efetivamente promovido pela adição de Y-27632 ao meio de cultura inicial. Como resultado, esse método produz um grande número de HMECs, atendendo aos requisitos de aprovação em apenas 10 dias.

Para testar o papel crucial do Y-27632 no crescimento celular após o isolamento, dividimos as células recém-isoladas em dois grupos: um grupo foi plaqueado com o meio inicial contendo 10 mM de Y-27632 (Figura 2A); o outro grupo foi plaqueado com o meio inicial sem adição de Y-27632 como grupo controle (Figura 2B). Após 2 dias de cultivo, as células de ambos os grupos foram trocadas para meio de células epidérmicas (Figura 1). A partir da Figura 2, podemos observar que, em comparação com o terceiro dia, o método com Y-27632 aumentou visivelmente o número de HMECs no nono dia. Os HMECs formaram um grupo coeso semelhante a uma ilha que tinha limites distintos e fortes conexões entre as células. Essas células se expandiram para o ambiente circundante. As células revestidas com Y-27632 (Figura 2A) cresceram muito mais rápido do que as células do grupo controle (Figura 2B). Para confirmar que o Y-27632 aumenta o crescimento do HMEC, as células P0 congeladas foram descongeladas e plaqueadas com ou sem adição de 10 mM de Y-27632, e as células de passagem 1 (P1) foram coletadas em dias diferentes, conforme mostrado na Figura 3. As células foram analisadas quanto à viabilidade e proliferação usando o kit de contagem de células-8 (CCK-8). Conforme mostrado na Figura 3, a taxa de crescimento das células tratadas com meio contendo Y-27632 foi significativamente maior do que a das células do grupo controle sem Y-27632. Tomando esses dados juntos, pode-se ver que a adição de Y-27632 no meio inicial aumenta significativamente o crescimento das células anexadas após o isolamento.

Para verificar se as células obtidas por este método são HMECs, realizamos a análise de imunofluorescência de HMECs P0 para dois marcadores de células epiteliais mamárias: CK7 e GATA3. A CK7, uma citoqueratina diagnosticamente importante, é um marcador de diferenciação glandular no epitélio mamário normal e seus processos epiteliais proliferativos¹³. Além disso, Kouros-Mehr et al. relataram que o GATA3 funciona como um fator de transcrição dentro das células epiteliais mamárias e está envolvido na sustentação da diferenciação epitelial luminal em glândulas mamárias totalmente desenvolvidas¹⁴. Conforme mostrado na Figura 3, as células que cultivamos e expandimos expressam fortemente CK7 ( Figura 4A ) e GATA3 ( Figura 4B ). A análise de quantificação de células positivas para CK7 e GATA3 mostrou que mais de 98% das células expressaram CK7 e GATA3 (Figura 4C), indicando contaminação limitada de outros tipos de células, como fibroblastos. Ocasionalmente, observamos um número limitado de células semelhantes a fibroblastos (morfologia alongada) na cultura inicial (P0, Figura 2), mas raramente vemos essas células aparecerem nas células passadas (P3, Figura 4D).

Para testar se a característica epitelial dos HMECs pode ser mantida após várias passagens, realizamos a análise qRT-PCR dos marcadores de células epiteliais mamárias CK7 e GATA3 nas células cultivadas com ou sem Y-27632 (Figura 5). Os níveis de expressão de CK7 e GATA3 não foram significativamente diferentes nas células P0 e P3, com ou sem Y-27632, indicando que suas características fenotípicas e de diferenciação não se alteraram ao longo do tempo durante a expansão da cultura.

Figura 1: Fluxograma do protocolo de isolamento e cultura de HMECs. Inicialmente, fragmentos de tecido mamário feminino foram fatiados com lâminas cirúrgicas e digeridos com uma combinação de enzimas. Posteriormente, os pellets celulares obtidos foram cultivados em meio de cultura inicial contendo 10 mM de Y-27632. Após 2 dias, o meio de cultura inicial foi substituído por meio de células epiteliais. As células epiteliais mamárias foram cultivadas em meio de células epidérmicas para atingir cobertura satisfatória após ~8 dias, agora adequadas para passagem. Se necessário, algumas células podem ser submetidas à criopreservação celular. Abreviatura: HMECs = células epiteliais mamárias humanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens de HMECs obtidas após a inoculação inicial. Dentro de 2 dias após a inoculação, (A) HMECs primários foram cultivados em meio inicial contendo Y-27632 e (B) HMECs primários foram cultivados em meio inicial sem Y-27632. Após um período de cultivo de 48 h, o meio de cultura de queratinócitos sem soro foi substituído em ambos os grupos. Fotos foram tiradas para registrar o status de crescimento das células em dias alternados. Ambas as séries de imagens representativas foram obtidas em microscópio invertido (100x) nos dias 3, 5 e 9 após a inoculação. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: HMECs = células epiteliais mamárias humanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Crescimento aprimorado de HMECs da Passagem 1 (P1) com Y-27632. As células P0 congeladas foram descongeladas e cultivadas com ou sem Y-27632. As células (P1) foram coletadas em 1, 3, 5, 7 e 9 dias e a absorbância analisada a 450 nm usando o kit CCK-8. No dia 1, o número de células viáveis aderentes no meio inicial contendo Y-27632 foi significativamente maior do que sem Y-27632. Além disso, a curva de crescimento das células tratadas com Y-27632 apresentou um aumento mais acentuado. **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviatura: HMECs = células epiteliais mamárias humanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Expressão dos marcadores HMEC (P0). A expressão de CK7 e GATA3 em HMECs foi analisada por coloração por imunofluorescência. Os HMECs foram corados para (A) CK7 (vermelho) e (B) GATA3 (vermelho); DAPI (azul) foi usado para corar os núcleos. As imagens foram obtidas em microscópio confocal de varredura a laser (400x). Barras de escala = 20 μm. (C) A porcentagem de células positivas na coloração; (D) a imagem representativa dos HMECs (P3). Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A expressão de CK7 e GATA3 de HMECs em P0 e P3. Usando qRT-PCR para detectar a expressão de (A) CK7 em HMECs de P0 e P3 no dia 7, (B) GATA3 em HMECs de P0 e P3, (C) CK7 em HMECs P1 cultivados com ou sem Y27632 no dia 7, (D) GATA3 em HMECs P1 cultivados com ou sem Y-27632 no dia 7. ^nsp > 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os HMECs são vitais na preservação da integridade anatômica e funcional do tecido mamário e são úteis em investigações científicas, implementações clínicas e domínios associados¹⁵. As células epiteliais primárias são um tipo de células especializadas que têm passagens limitadas e vida útil mais curta. No entanto, o crescimento dos HMECs tem sido dificultado por restrições técnicas, que consequentemente dificultam os avanços da pesquisa em câncer de mama e outras doenças inflamatórias relacionadas à mama¹⁶.

Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um método estável, viável e eficiente para obter HMECs de tecidos mamários frescos. Hammond et ^al.8 e Band e^Sager17 extraíram e cultivaram com sucesso células epiteliais da mama. No entanto, a composição do meio de cultura necessário era excessivamente complexa. Estudos anteriores de Taylor-Papidamitriou et al. demonstraram que as células da cavidade do leite materno poderiam ser cultivadas usando um meio suplementado com fatores de crescimento e soro¹⁸. Embora seu método permita a extração direta de HMECs do leite materno, a presença de células não epiteliais pode afetar o crescimento de HMECs, tornando difícil determinar com precisão a contagem de células. Jin et al. desenvolveram um método de reprogramação condicional que permitiu que os HMECs primários tivessem um ciclo de vida mais longo e mantivessem a heterogeneidade celular em comparação com os métodos tradicionais de cultura, mas era altamente dependente de condições específicas de cultura e restringia o uso desse método em outros laboratórios e aplicações¹².

Um estudo do grupo de Zubeldia-Plazaola estabeleceu um método de isolamento otimizado que envolvia a digestão lenta (durante a noite) de fragmentos de tecido picados por uma mistura de colagenase e hialuronidase, seguida por três centrifugações diferenciais no segundo dia para separar frações estromal/epitélio. Esse método de isolamento mais a adição de Y-27632 na cultura produziu um grande número de células epiteliais viáveis. No entanto, a quantidade de tecido mamário utilizada em seu estudo foi de 40-75 g e o procedimento de isolamento durou quase 2 dias⁹. Aqui, relatamos o uso de apenas 1 g de tecido neste protocolo, e testamos e descobrimos que este método também funcionou para apenas 0,25 g de tecido. A mistura enzimática de colagenase, dispase e tripsina digeriu eficientemente 1 g de tecido em 1,5 h, e todo o procedimento levou ~ 3 h. A adição de Y-27632 ao meio de cultura inicial pode promover a fixação e proliferação de células epiteliais, mas também inibir o crescimento de células estromais¹⁹. É importante ressaltar que, neste estudo, testamos os componentes do meio inicial e descobrimos que 5% de FBS no DMEM para substituir o meio G usado na publicação anterior foi suficiente para promover a fixação e o crescimento das células epidérmicas¹⁰.

Após 2 dias de cultivo no meio inicial, as células foram cultivadas em meio queratinócito livre de soro. O padrão de crescimento celular para cultura inicial (P0) após a inoculação é mostrado na Figura 2, que mostra um padrão de crescimento de colônias. Este método de isolamento provavelmente produz todos os tipos de células epiteliais, incluindo células mioepiteliais de tecidos mamários, que precisam ser mais caracterizadas no futuro. No entanto, comparando o crescimento de células na presença de Y-27632 com o grupo controle sem adicionar Y-27632 ao meio de cultura inicial, pudemos ver que o método com Y-27632 aumentou significativamente a produção de células e melhorou a eficiência da cultura de células (Figura 2A). Geralmente ~ 9-10 dias de cultura após a inoculação, as células epidérmicas podem atingir uma densidade adequada para a passagem. Além disso, também mostramos que a presença de Y-27632 poderia aumentar o crescimento de P1 HMEC após a recuperação de células P0 congeladas no final da cultura inicial (Figura 3). Em nossas mãos, descobrimos que mais de 90% das células foram capazes de sobreviver após serem descongeladas do armazenamento congelado. As células tiveram um tempo de duplicação de aproximadamente 72 h, e os HMECs foram capazes de manter o crescimento normal até a 7ª passagem.

Neste estudo, as células expressaram altos níveis de marcadores de células epiteliais mamárias CK7 e GATA3 e, mais importante, quase 100% das células no estágio final da cultura inicial foram positivas para CK7 e GATA3 (Figura 4), indicando alta pureza das células epiteliais obtidas por este método. Por fim, este estudo comparou os níveis de expressão de CK7 e GATA3 em células P0 e P3, revelando altos níveis de expressão em ambas, sugerindo que a passagem não alterou o fenótipo das células (Figura 5A,B). Além disso, independentemente da presença de Y-27632, CK7 e GATA3 foram consistentemente altamente expressos, o que implica que a adição de Y-27632 não impactou o fenótipo celular ( Figura 5C , D ).

A principal causa para o aumento da proliferação celular por meio de nossa abordagem é a inclusão de Y-27632, que demonstrou ter impactos vantajosos na multiplicação e especialização de células epiteliais humanas^19,20. Chapman et al. descobriram que o uso de Y-27632 aumentou significativamente a capacidade das células epiteliais de se multiplicarem e levou à imortalização bem-sucedida das células sem nenhum sinal de crise celular²¹. Em nosso estudo, o Y-27632 aumentou significativamente o rendimento dessas células epiteliais, aumentando sua fixação e proliferação¹⁹.

Uma característica fundamental desse método é combinar dispase e colagenase para separar o tecido epitelial do tecido conjuntivo, ao mesmo tempo em que emprega tripsina para dissociar as células epiteliais do tecido epitelial²². Dispase provou ser uma enzima rápida e eficiente, mas suave, para separar a epiderme não danificada da derme, bem como as camadas não danificadas de células epiteliais em cultura da superfície subjacente, mantendo a viabilidade das células epiteliais²³. A colagenase tipo I facilita o isolamento das células epiteliais e garante a vitalidade e integridade das células²⁴. Outra característica importante deste método é usar o meio inicial com Y-27632 para cultivar os HMECs recém-isolados. Depois que as células aderiram ao prato no terceiro dia, o meio de cultura é alterado para meio livre de soro de queratinócitos. Essa abordagem simplifica visivelmente as etapas experimentais e reduz o custo do experimento. Como resultado, obtivemos números de células muito satisfatórios usando apenas um pequeno volume de tecido mamário com este método, o que indica que uma grande quantidade de tecido inicial não é necessária. No entanto, uma desvantagem dessa abordagem é que a presença de tripsina não protege adequadamente a integridade das células epiteliais. Outro aspecto potencialmente limitante do método é a possibilidade de uma pequena (<1%) contaminação das células mioepiteliais durante a cultura inicial⁹.

Nosso método oferece uma abordagem simplificada e eficiente para isolar e cultivar HMECs primários derivados de tecido mamário adulto. Essa técnica é caracterizada por sua simplicidade, sua natureza que economiza tempo e sua capacidade de manter as funções celulares fundamentais. Consequentemente, esta técnica tem vantagens claras e é altamente promissora para gerar uma quantidade substancial de células epiteliais. Além disso, o método permite o isolamento e a cultura de HMECs de uma ampla gama de doadores, adequados tanto para pesquisas laboratoriais quanto para aplicações clínicas, tornando-o altamente versátil e amplamente aplicável.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação à publicação deste artigo.

Este trabalho foi apoiado por doações do Programa de Ciência e Tecnologia TCM da Província de Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), e o Projeto de Ciência e Tecnologia de Zunyi, província de Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) para X. Xu. Os autores agradecem ao Laboratório de Biologia Molecular da Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company por fornecer treinamento em cultura de células.