Método de treinamento de força estática para camundongos diabéticos tipo 2

Este protocolo fornece um método simples de fazer equipamentos de treinamento estático para camundongos. O dispositivo mantém a contração isométrica muscular dos membros de camundongos para verificar o efeito da intervenção do exercício tradicional no diabetes tipo 2 (DM2) e fornece nova terapia de exercícios para o tratamento clínico do DM2.

O tratamento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma grande dificuldade na melhoria da saúde do paciente. O exercício é uma das principais intervenções para o DM2. O treinamento de força estática é uma das principais formas de esportes tradicionais na China. A pesquisa mostra que o treinamento de força estática é um método clínico eficaz para a intervenção do DM2, mas não existe um dispositivo experimental adequado para treinamento estático em camundongos. Uma das dificuldades em passar da pesquisa clínica para a pesquisa básica é projetar dispositivos experimentais apropriados. A fim de estudar mais a fundo o mecanismo de intervenção de treinamento estático no DM2, um método simples para fazer um dispositivo de treinamento estático para camundongos é introduzido neste artigo. Este dispositivo tem as vantagens de operação simples, material barato e alta viabilidade. Estudos anteriores conduzidos sob este protocolo mostraram que o treinamento estático pode efetivamente reduzir os níveis de glicose no sangue e melhorar a função mitocondrial das células musculares esqueléticas em camundongos DM2. O objetivo da introdução deste dispositivo é promover pesquisas sobre o mecanismo do exercício tradicional na intervenção do DM2 e estabelecer uma base para a intervenção quantitativa do exercício.

O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma doença crônica caracterizada por resistência à insulina e disfunção de células β que é uma ameaça significativa à saúde global¹. O exercício é uma intervenção crucial no tratamento do diabetes tipo 2. Numerosos estudos mostraram que os métodos tradicionais de exercícios chineses, como Tai Chi e Ba Duan Jin, melhoram significativamente os níveis de glicose no sangue e a qualidade de vida de indivíduos com DM2,3,4,5. Para executar esses movimentos, o treinador deve manter um corpo estável e uma posição articular por um período de tempo. A posição estática é sustentada pela realização de contrações musculares estáticas, o que é comumente referido como força estática⁶.

No entanto, o mecanismo de intervenção do treinamento de força estática no DM2 não foi esclarecido. Para responder a essa pergunta, experimentos com animais são essenciais. Durante os exercícios isométricos, os músculos são ativados, mantêm um comprimento constante e atingem a tensão máxima com segurança⁷. Em experimentos com treinamento de força estática, o animal de teste é obrigado a realizar contrações musculares isométricas e manter esse estado de contração muscular. Como implementar o treinamento de força estática em camundongos, ratos e outros animais de laboratório tornou-se um grande problema na pesquisa. Primeiro, os animais lutam para obedecer aos comandos e contrair seus músculos conforme necessário. Em segundo lugar, é difícil para o animal manter uma posição estável sob resistência, e o objetivo da contração muscular isométrica não pode ser alcançado. Ao permitir que os animais treinem conforme necessário, é importante abordar as preocupações relacionadas ao bem-estar animal, como aliviar o estresse e a ansiedade, minimizar a dor e melhorar as condições gerais. Este protocolo pertence a um modelo de treinamento estático para ratos ^8,9, e aqui apresentamos um dispositivo simples para treinamento estático de camundongos. Quando as patas traseiras dos camundongos são levantadas, seus músculos abdominais se contraem devido ao reflexo de endireitamento, as patas dianteiras agarram a barra transversal na frente e, em seguida, os membros dianteiros e traseiros se contraem contra a gravidade. Os ratos não podem se mover depois de agarrar a barra curta, resultando em seus músculos em um estado de contração isométrica.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (permissão nº 202209A033). Foram selecionados camundongos C57BL/6J machos saudáveis com grau de FPS, 8 semanas de idade e peso corporal de 20 ± 4 g. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h a uma temperatura de 20-22 °C, e uma umidade relativa de 45%-50% foi mantida. Os animais comem e bebem livremente.

1. Estabelecimento de um modelo de camundongo de DM2

1. Alimente os ratos por 1 semana com uma dieta regular primeiro e deixe os ratos se adaptarem ao novo ambiente do centro animal. Após 1 semana, forneça uma dieta rica em gordura (composição da dieta: 20,0% banha, 10,0% sacarose, 2,5% colesterol, 1,0% colato, 66,5% dieta convencional) por um período de 4 semanas.
2. A partir do^1º dia da^5ª semana, injete intraperitonealmente camundongos com solução de estreptozotocina na dose de 35 mg/kg por dia durante 3 dias consecutivos. Prepare 1 mL da solução de estreptozotocina com 10 mg de estreptozotocina em pó, com 0,1 M / L de tampão citrato de sódio como solvente.
   NOTA: A injeção deve ser concluída dentro de 30 minutos após a preparação da solução e a solução deve ser mantida longe da luz durante o uso.
3. Teste aleatoriamente a glicose no sangue no dia 5 e no dia 7 após a administração da primeira injeção de solução de estreptozotocina. Animais com dois níveis aleatórios de açúcar no sangue superiores a 16,7 mM/L são considerados modelos de DM2 bem-sucedidos.
4. Comece a intervenção de treinamento no dia 8 após a primeira injeção de solução de estreptozotocina.

2. Agrupamento e tratamento em camundongos

1. Divida os camundongos DM2 em um grupo modelo, grupo de treinamento e grupo de metformina usando o método da tabela de números aleatórios, com 6 camundongos em cada grupo.
2. Não execute nenhuma intervenção para o grupo de modelos.
3. Triture os comprimidos de metformina em pó e dissolva em água pura. Administre metformina ao grupo metformina por gavagem na dose de 200 mg / kg, uma vez por dia, durante 3 semanas.
4. Deixe o grupo de treinamento fazer 30 minutos de treinamento de força estática, uma vez por dia, 5 dias por semana, durante 3 semanas. O treinamento é realizado de segunda a sexta-feira à tarde.
5. Atribua aleatoriamente 6 camundongos não DM2 como grupo de controle. Esses camundongos não passam por modelagem e intervenção.

3. Fabricação do dispositivo de treinamento de força estática

1. Prepare uma placa de acrílico transparente de 5 mm de espessura com dimensões de 20 cm x 20 cm. Use uma placa transparente para observar o treinamento dos ratos.
2. Obtenha palitos de madeira com um diâmetro de 3 mm e um rolo de fita adesiva com uma largura de 1 cm. Use um cortador de papel para cortar dois palitos de 4 cm de comprimento e quatro palitos de 1 cm de comprimento.
3. Prenda dois palitos, cada um com 1 cm de comprimento, nas extremidades de um palito de 4 cm de comprimento com fita adesiva (Figura 1A). As varas curtas devem ser fixadas no mesmo lado que a vara longa.
4. Coloque a placa transparente em uma superfície plana e prenda dois conjuntos de palitos curtos de 1 cm na placa usando uma pistola de cola quente. Certifique-se de que os palitos de madeira de 4 cm não entrem em contato com a placa. Deixe um espaço de 2 cm entre a vara longa e a prancha para manter os mouses no lugar (Figura 1B). Deixe as duas varas longas alinhadas e paralelas, com uma distância de 6 cm entre elas (Figura 1C).

Figura 1: Monte e prenda os palitos na placa transparente. (A) Cole o palito de 1 cm em ambas as extremidades do bastão de 4 cm. (B) Use adesivo hot melt para conectar o bastão de 1 cm de comprimento e a placa transparente, e o comprimento da folga é de 2 cm. (C) Dois bastões de 4 cm espaçados de 6 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Treinamento de força estática em camundongos

1. Corte dois pedaços de fio de lã com 15 cm de comprimento. Use um nó corrediço para amarrar um pedaço de lã
   NOTA: A corda elástica não pode fixar a postura dos ratos, e a corda de cânhamo desgasta os tornozelos dos ratos, então fios de lã inelásticos, mas macios, são escolhidos aqui.
2. Coloque o tabuleiro horizontalmente sobre a mesa com os gravetos para cima. Pressione o mouse cuidadosamente entre duas varas longas, posicionando sua cabeça e cauda para alinhar com as lacunas abaixo das varas.
3. Passe o fio pela abertura no final da cauda. Em seguida, ajuste o fio até que os tornozelos do mouse se encaixem perfeitamente na borda do bastão.
4. Prenda o fio de lã com fita adesiva (Figura 2B). A ponta do fio de lã deve ser presa, caso contrário, o rato escalará a lã caída. Puxe a lã o mais apertado possível ou o mouse se libertará facilmente.
5. Inverta a placa transparente. Obtenha 2 caixas da mesma altura (15-20 cm de altura) em cada extremidade da placa transparente. Coloque a prancha horizontalmente a uma certa altura. A caixa está localizada em cada extremidade da cabeça e cauda do mouse. Se for muito alto, o experimentador não será capaz de lidar com isso facilmente; Se estiver muito baixo, o mouse pode tocar no tampo da mesa.
6. Uma vez que a placa é virada, o mouse fica pendurado de cabeça para baixo. Devido ao reflexo de endireitamento, os camundongos enrolam o abdômen e estendem os membros anteriores para agarrar os membros posteriores ou bastões. Nesta fase, posicione um bastão de 20 cm na frente do mouse e guie-o cuidadosamente para segurar o bastão com os membros anteriores. Repita o processo até que o mouse se torne proficiente em segurar o stick móvel.
7. Use o bastão para mover o membro anterior do mouse para outro bastão de 4 cm no quadro transparente. Ajuste constantemente o ângulo do bastão para permitir que os ratos agarrem ativamente o bastão estacionário de 4 cm na placa (Figura 2C).
8. Repita a etapa anterior enquanto o mouse solta a pata dianteira até que o mouse esteja exausto. Após 30 minutos, a maioria dos ratos não conseguiu levantar a parte superior do corpo e segurar o bastão com os membros anteriores.
   NOTA: Antes de implementar a intervenção, é necessária uma semana de treinamento de habituação em camundongos. A duração inicial do treinamento é de 10 minutos por dia, que deve ser aumentada em 5 minutos por dia até atingir um total de 30 minutos por dia.
9. Após 30 min de treinamento, solte imediatamente o mouse e desembarace a lã para evitar pés vermelhos e inchados causados pela amarração prolongada.
   1. Se aparecerem lesões cutâneas no tornozelo dos camundongos após o treinamento, pare de treinar os camundongos e procure atendimento veterinário até que o tornozelo esteja saudável.
   2. Alguns camundongos podem ocasionalmente conseguir se libertar por meio de uma luta intensa durante o treinamento. Os ratos lutam quando suas patas traseiras não estavam firmemente fixadas. Para evitar lesões devido à luta, observe os ratos durante todo o treinamento. Quando for descoberto que os membros posteriores não estão firmemente fixados ou os ratos começam a lutar, afrouxe os ratos e fixe novamente.
      NOTA: Experimentos anteriores mostraram que pendurar ratos de cabeça para baixo por 30 minutos por dia, 5 dias por semana, não causa desgaste no tornozelo, desde que sejam libertados no devido tempo¹⁰. Os ratos podem aprender e se acostumar com o treinamento em 1-3 sessões.

Figura 2: Método de fixação em camundongo. (A) Amarre a parte superior do tornozelo com um nó corrediço. (B) A ponta da corda é passada pela abertura e puxada com força, depois presa com fita adesiva. (C) Treinamento de força estática em camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Seguindo o protocolo acima, os membros posteriores do mouse são fixados e os membros anteriores agarram autonomamente a barra frontal. A estreita amplitude de movimento mantém o mouse em uma posição relativamente fixa. Os músculos dos camundongos podem ser confirmados para se contrair tocando os músculos do abdômen e das pernas. Isso é consistente com a necessidade do estado de contração muscular isométrica no treinamento de força estática. Treinar ratos de acordo com o protocolo, com o aumento dos tempos de treinamento, ajudará os ratos a se adaptarem ao treinamento, reduzindo seu desejo de lutar. Uma luta para escapar pode ser evitada.

Efeitos sobre a glicemia e o nível de insulina em camundongos com DM2
Um total de 24 camundongos C57BL/6J foram divididos aleatoriamente no grupo controle (n=6) e no grupo modelo DM2 (n=18). Os camundongos DM2 foram então divididos aleatoriamente no grupo modelo, no grupo de treinamento e no grupo metformina. Nenhuma modelagem ou intervenção foi dada ao grupo de controle, e nenhuma intervenção foi dada aos camundongos do grupo modelo. Os ratos do grupo de treinamento receberam 30 minutos de treinamento de força estática uma vez ao dia, 5 dias por semana durante 3 semanas. Os camundongos do grupo metformina receberam metformina 200 mg / kg uma vez ao dia durante 3 semanas. Os resultados da glicemia de jejum (FBG) após 3 semanas de intervenção são mostrados na Figura 3A. Como pode ser visto na figura, os níveis de FBG dos camundongos modelo DM2 foram significativamente mais altos do que os dos camundongos controle. Camundongos treinados em treinamento estático mostraram níveis significativamente mais baixos de FBG em comparação com o grupo modelo, sugerindo que o treinamento estático é eficaz na redução de FBG em camundongos DM2. Os níveis séricos de insulina em jejum (FINS) no grupo modelo foram significativamente menores do que no grupo controle, conforme mostrado na Figura 3B. Nos grupos treinamento e metformina, os níveis de FINS aumentaram em comparação com o grupo modelo. Na Figura 3C, os camundongos do grupo modelo apresentaram um índice de resistência à insulina significativamente maior (HOMA-IR) do que os do grupo controle, enquanto o HOMA-IR dos grupos de treinamento estático e metformina foi significativamente menor do que o do grupo modelo, demonstrando sua eficácia no alívio do estado de resistência à insulina de camundongos DM2. Esses resultados mostram que a estratégia de treinamento de força estática fornecida por esse regime tem efeitos semelhantes à metformina na regulação do nível de glicose no sangue de camundongos com DM2.

Figura 3: Níveis de açúcar no sangue e insulina. (A) Comparação dos níveis de glicose no sangue em jejum em camundongos DM2 após 3 semanas de intervenção. * p <0,05 vs. grupo controle, # p <0,05 vs. grupo modelo. (B) Comparação dos níveis séricos de insulina em jejum em camundongos DM2 após 3 semanas de intervenção. * p <0,05 vs. grupo controle, # p <0,05 vs. grupo modelo. (C) Comparação do índice de resistência à insulina em camundongos DM2 após 3 semanas de intervenção. * p <0,05 vs. grupo controle, # p <0,05 vs. grupo modelo. A análise de variância (ANOVA) de uma via foi realizada para análise estatística. Os dados quantitativos são expressos como média ± EPM (n=6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Efeitos no músculo esquelético em camundongos DM2
O gastrocnêmio de camundongos foi observado por microscopia eletrônica de transmissão. Em comparação com os camundongos controle, os miócitos do músculo esquelético dos camundongos DM2 estavam degenerados, a estrutura das miofibrilas era frouxa e o arranjo do sarcômero era irregular (Figura 4A, B). Após o treinamento estático descrito no protocolo, a Figura 4C mostra a estrutura apertada das fibras miogênicas na estrutura muscular e o arranjo simétrico dos segmentos musculares locais. Isso sugere que o treinamento de força estática pode regular a morfologia do músculo esquelético em camundongos DM2. Por outro lado, no gastrocnêmio de camundongos controle, as mitocôndrias foram distribuídas localmente, com membranas intactas e mitocôndrias divididas ou fundidas localmente (indicadas por setas vermelhas). Da mesma forma, no músculo esquelético de camundongos após treinamento de força estática, o número de mitocôndrias é normal; alguns deles são obviamente fundidos ou divididos (seta vermelha). No modelo DM2 em camundongos, por outro lado, o número de mitocôndrias é menor e há baixa atividade. (Veja a Figura 4) Isso sugere que o treinamento de força estática pode afetar a função mitocondrial e a atividade nas células musculares esqueléticas.

Figura 4: Efeito do treinamento estático no músculo esquelético de camundongos DM2. (A) Grupo controle; (B) Grupo de modelos DM2; (C) Grupo de treinamento estático. O M representa as mitocôndrias. As barras de escala branca representam 50μm e as barras de escala vermelha representam 10μm. A imagem inferior é uma ampliação parcial da imagem superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O treinamento de força estática pode reduzir o acúmulo de gordura, ajudar na perda de peso e aumentar o metabolismo⁸. Além disso, aumenta a expressão de PGC-1α e a biogênese mitocondrial em células musculares esqueléticas, levando a uma melhora do metabolismo da glicose em camundongos com diabetes mellitus tipo 2 e consequente redução nos níveis de glicose no sangue¹¹. Para confirmar o impacto e o mecanismo do treinamento estático no DM2, dispositivos apropriados precisam ser desenvolvidos para realizar o treinamento estático em animais experimentais.

Este protocolo introduz um dispositivo para treinamento estático em camundongos. O equipamento necessário, como placas de acrílico, bastões, fios de lã e pistolas de cola quente, está prontamente disponível, e o método de produção é simples e fácil. Isso pode efetivamente reduzir o custo do experimento e aumentar sua viabilidade e repetibilidade. Manter uma posição fixa para os ratos durante o treinamento pode ser um desafio ao projetar um dispositivo de treinamento estático. Neste protocolo, os pés do mouse podem ser presos à frente do pequeno bastão apertando a lã macia. O reflexo de endireitamento faz com que o mouse dobre a parte superior do corpo para cima, permitindo que ele segure a barra da frente com as patas dianteiras. A barra é curta, limitando a amplitude de movimento das patas dianteiras. Após duas ou três sessões de treinamento adaptativo, os camundongos conseguiram manter uma postura estável. Devido à força limitada das patas dianteiras, os ratos freqüentemente perdem o controle da barra transversal. É necessário que os experimentadores monitorem os ratos o tempo todo, a fim de ajudá-los a agarrar a barra transversal com os membros anteriores e evitar que os ratos se machuquem acidentalmente. Por meio do treinamento, os camundongos podem manter uma posição fixa por 1-2 minutos de cada vez, repetidos várias vezes, por cerca de 30 minutos após a exaustão. Quando exaustos, os ratos não rolavam mais o abdômen ou levantavam as patas dianteiras. Quando o rato foi guiado pelo bastão para agarrar com as patas dianteiras, o rato conseguiu agarrar, mas a parte superior do corpo não conseguiu virar para cima. Desamarre o nó o mais rápido possível após colocar os ratos, o que pode efetivamente evitar edema e desgaste do tornozelo.

Experimentos preliminares indicam que, após um período de treinamento estático, o nível de glicose no sangue de camundongos DM2 diminuiu significativamente quando comparado com o grupo controle de camundongos modelo. O músculo esquelético é um componente crítico no metabolismo periférico da glicose e é essencial para manter a homeostase da glicose no sangue¹². As análises de microscopia eletrônica indicaram que a degeneração severa ocorreu nas células gastrocnêmias de camundongos DM2, enquanto o treinamento estático foi encontrado para mitigar a degeneração do tecido muscular. Esses achados sugerem que o treinamento estático pode estar implicado na regulação da função muscular esquelética. A pesquisa mostrou que a manutenção da função do músculo esquelético é significativamente afetada pela dinâmica mitocondrial¹³. Observamos uma redução acentuada no número de mitocôndrias e uma falta de atividade mitocondrial nas células musculares gastrocnêmias do grupo de camundongos com DM2 em comparação com camundongos selvagens e camundongos com exercícios estáticos. Esses achados sugerem que o treinamento estático pode promover a função do músculo esquelético, melhorando a função mitocondrial nas células do músculo esquelético. Com base nos resultados experimentais anteriores, pode-se determinar que o treinamento estático pode aumentar consideravelmente o metabolismo da glicose no sangue e da insulina em camundongos com DM2. O mecanismo de intervenção pode estar ligado à regulação da função mitocondrial do músculo esquelético por treinamento estático.

Este protocolo tem algumas limitações. Inicialmente, havia dificuldade em amarrar individualmente os membros posteriores dos camundongos por uma pessoa, pois exigia que um indivíduo segurasse as patas traseiras enquanto outro realizava a amarração. Com alguns ajustes e habilidade crescente por parte do experimentador, os ratos tornaram-se mais receptivos. Isso permitiu a ligação independente das patas traseiras. Além disso, a lã macia pode diminuir os hematomas nos tornozelos dos ratos.

Em conclusão, este protocolo fornece um método simples de fabricação de equipamentos de treinamento estático para camundongos. Da mesma forma, equipamentos simples de treinamento estático para ratos podem ser feitos aumentando o tamanho das tábuas e bastões. O dispositivo pode manter a contração isométrica muscular dos membros de camundongos, de modo a verificar o efeito da intervenção do exercício tradicional chinês no DM2 e fornecer uma nova perspectiva para o tratamento clínico do DM2.

Os autores declaram que não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo segundo lote de projetos especiais de pesquisa científica da Base Nacional de Pesquisa Clínica de Medicina Tradicional Chinesa (JDZX2015127, com sede no Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Anhui).