Metodo di allenamento della forza statica per topi diabetici di tipo 2

Questo protocollo fornisce un metodo semplice per realizzare attrezzature per l'allenamento statico per topi. Il dispositivo mantiene la contrazione isometrica muscolare degli arti dei topi in modo da verificare l'effetto dell'intervento dell'esercizio tradizionale sul diabete di tipo 2 (T2DM) e fornisce una nuova terapia fisica per il trattamento clinico del T2DM.

Il trattamento del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una delle principali difficoltà per migliorare la salute del paziente. L'esercizio fisico è uno dei principali interventi per il diabete di tipo 2. L'allenamento della forza statica è una delle forme chiave di sport tradizionali in Cina. La ricerca mostra che l'allenamento della forza statica è un metodo clinico efficace per l'intervento sul diabete di tipo 2, ma non esiste un dispositivo sperimentale adatto per l'allenamento statico nei topi. Una delle difficoltà nel passaggio dalla ricerca clinica a quella di base è quella di progettare dispositivi sperimentali adeguati. Al fine di studiare ulteriormente il meccanismo dell'intervento di allenamento statico nel T2DM, in questo articolo viene introdotto un metodo semplice per realizzare un dispositivo di allenamento statico per topi. Questo dispositivo presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, materiale economico e alta fattibilità. Precedenti studi condotti nell'ambito di questo protocollo hanno dimostrato che l'allenamento statico può ridurre efficacemente i livelli di glucosio nel sangue e migliorare la funzione mitocondriale delle cellule muscolari scheletriche nei topi T2DM. Lo scopo dell'introduzione di questo dispositivo è quello di promuovere la ricerca sul meccanismo dell'esercizio tradizionale nell'intervento del T2DM e di gettare le basi per l'intervento quantitativo dell'esercizio.

Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una malattia cronica caratterizzata da insulino-resistenza e disfunzione delle cellule β che rappresenta una minaccia significativa per la salute globale¹. L'esercizio fisico è un intervento cruciale nella gestione del diabete di tipo 2. Numerosi studi hanno dimostrato che i metodi di esercizio tradizionali cinesi, come il Tai Chi e il Ba Duan Jin, migliorano significativamente i livelli di glucosio nel sangue e la qualità della vita per gli individui con T2DM 2,3,4,5. Per eseguire questi movimenti, l'allenatore deve mantenere una posizione stabile del corpo e dell'articolazione per un periodo di tempo. La posizione statica è sostenuta dall'esecuzione di contrazioni muscolari statiche, che viene comunemente indicata come forza statica⁶.

Tuttavia, il meccanismo dell'intervento di allenamento della forza statica nel T2DM non è stato chiarito. Per rispondere a questa domanda, gli esperimenti sugli animali sono essenziali. Durante gli esercizi isometrici, i muscoli vengono attivati, mantengono una lunghezza costante e raggiungono in sicurezza la massima tensione⁷. Negli esperimenti con l'allenamento della forza statica, l'animale di prova deve eseguire contrazioni muscolari isometriche e mantenere questo stato di contrazione muscolare. Come implementare l'allenamento della forza statica su topi, ratti e altri animali da laboratorio è diventato un grosso problema nella ricerca. In primo luogo, gli animali faticano a obbedire ai comandi e a contrarre i muscoli come richiesto. In secondo luogo, è difficile per l'animale mantenere una posizione stabile sotto resistenza e lo scopo della contrazione muscolare isometrica non può essere raggiunto. Mentre si lasciano addestrare gli animali secondo necessità, è importante affrontare le preoccupazioni relative al benessere degli animali, come alleviare lo stress e l'ansia, ridurre al minimo il dolore e migliorare le condizioni generali. Questo protocollo riguarda un modello di addestramento statico per ratti ^8,9, e qui introduciamo un semplice dispositivo per l'addestramento statico dei topi. Quando le zampe posteriori dei topi vengono sollevate, i loro muscoli addominali si contraggono a causa del riflesso di raddrizzamento, le zampe anteriori afferrano la barra trasversale davanti e poi gli arti anteriori e posteriori si contraggono contro la gravità. I topi non possono muoversi dopo aver afferrato la barra corta, con il risultato che i loro muscoli sono in uno stato di contrazione isometrica.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (autorizzazione n. 202209A033). Sono stati selezionati topi maschi sani C57BL/6J con grado SPF, 8 settimane di età e peso corporeo compreso tra 20 ± 4 g. I topi sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 ore a una temperatura di 20-22 °C ed è stata mantenuta un'umidità relativa del 45%-50%. Gli animali mangiano e bevono liberamente.

1. Istituzione di un modello murino di T2DM

1. Dai da mangiare ai topi per 1 settimana con una dieta regolare e lascia che i topi si adattino al nuovo ambiente del centro animale. Dopo 1 settimana, fornire una dieta ricca di grassi (composizione della dieta: 20,0% strutto, 10,0% saccarosio, 2,5% colesterolo, 1,0% colato, 66,5% dieta convenzionale) per un periodo di 4 settimane.
2. Dal 1^° giorno della 5^° settimana, iniettare intraperitonealmente nei topi una soluzione di streptozotocina alla dose di 35 mg/kg ogni giorno per 3 giorni consecutivi. Preparare 1 mL di soluzione di streptozotocina con 10 mg di polvere di streptozotocina, con 0,1 M/L di tampone citrato di sodio come solvente.
   NOTA: L'iniezione deve essere completata entro 30 minuti dalla preparazione della soluzione e la soluzione deve essere tenuta lontana dalla luce durante l'uso.
3. Testare in modo casuale la glicemia il giorno 5 e il giorno 7 dopo la somministrazione della prima iniezione di soluzione di streptozotocina. Gli animali con due livelli casuali di zucchero nel sangue superiori a 16,7 mM/L sono considerati modelli di T2DM di successo.
4. Iniziare l'intervento di formazione il giorno 8 dopo la prima iniezione di soluzione di streptozotocina.

2. Raggruppamento e trattamento nei topi

1. Dividi i topi T2DM in un gruppo modello, un gruppo di allenamento e un gruppo di metformina utilizzando il metodo della tabella dei numeri casuali, con 6 topi in ciascun gruppo.
2. Non eseguire alcun intervento per il gruppo di modelli.
3. Macinare le compresse di metformina in polvere e scioglierle in acqua pura. Somministrare metformina al gruppo metformina mediante sonda gastrica alla dose di 200 mg/kg, una volta al giorno, per 3 settimane.
4. Lascia che il gruppo di allenamento faccia 30 minuti di allenamento della forza statica, una volta al giorno, 5 giorni alla settimana, per 3 settimane. La formazione si tiene dal lunedì al venerdì pomeriggio.
5. Assegna in modo casuale 6 topi non T2DM come gruppo di controllo. Questi topi non vengono sottoposti a modellazione e intervento.

3. Produzione del dispositivo per l'allenamento della forza statica

1. Preparare una tavola acrilica trasparente di 5 mm di spessore con dimensioni di 20 cm x 20 cm. Utilizzare una lavagna trasparente per osservare l'addestramento dei topi.
2. Procurati bastoncini di legno con un diametro di 3 mm e un rotolo di nastro adesivo con una larghezza di 1 cm. Usa un tagliacarte per tagliare due bastoncini lunghi 4 cm e quattro bastoncini lunghi 1 cm.
3. Attacca due bastoncini, ciascuno con una lunghezza di 1 cm, alle estremità di un bastoncino con una lunghezza di 4 cm usando del nastro adesivo (Figura 1A). I bastoncini corti devono essere fissati sullo stesso lato del bastoncino lungo.
4. Posiziona la tavola trasparente su una superficie piana e attacca due serie di bastoncini corti da 1 cm alla piastra usando una pistola per colla a caldo. Assicurarsi che i bastoncini di legno da 4 cm non entrino in contatto con la tavola. Lasciare uno spazio di 2 cm tra il bastoncino lungo e la tavola per tenere i mouse in posizione (Figura 1B). Lasciare che i due bastoncini lunghi siano allineati e paralleli, con una distanza di 6 cm tra loro (Figura 1C).

Figura 1: Assemblare e fissare i bastoncini alla tavola trasparente. (A) Fissare con nastro adesivo il bastoncino da 1 cm a entrambe le estremità del bastoncino da 4 cm. (B) Utilizzare l'adesivo hot melt per collegare il bastoncino lungo 1 cm e il pannello trasparente e la lunghezza dello spazio è di 2 cm. (C) Due bastoncini da 4 cm distanziati di 6 cm l'uno dall'altro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Allenamento della forza statica nei topi

1. Tagliate due pezzi di filo di lana lunghi 15 cm. Usa un nodo scorsoio per legare un pezzo di filo di lana su ciascuna delle caviglie superiori del topo (Figura 2A).
   NOTA: La corda elastica non può fissare la postura dei topi e la corda di canapa indosserà le caviglie dei topi, quindi qui viene scelto un filato di lana anelastico ma morbido.
2. Posiziona la tavola orizzontalmente sul tavolo con i bastoncini verso l'alto. Premi con attenzione il mouse tra due lunghi bastoncini, posizionando la testa e la coda in modo che si allineino con gli spazi sotto i bastoncini.
3. Passare il filo attraverso la fessura alla fine della coda. Quindi, regola il filo fino a quando le caviglie del mouse non aderiscono perfettamente al bordo del bastoncino.
4. Fissare il filo di lana con del nastro adesivo (Figura 2B). L'estremità del filo di lana deve essere fissata, altrimenti il topo si arrampicherà sulla lana caduta. Tira la lana il più forte possibile o il mouse si libererà facilmente.
5. Capovolgere la scheda trasparente. Prendi 2 scatole della stessa altezza (15-20 cm di altezza) su entrambe le estremità della lavagna trasparente. Posiziona la tavola orizzontalmente a una certa altezza. La scatola si trova alle due estremità della testa e della coda del topo. Se è troppo alto, lo sperimentatore non sarà in grado di gestirlo facilmente; Se è troppo basso, il mouse potrebbe toccare il piano del tavolo.
6. Una volta che il tabellone viene capovolto, il mouse si blocca a testa in giù. A causa del riflesso di raddrizzamento, i topi arricciano l'addome ed estendono gli arti anteriori per afferrare gli arti posteriori o i bastoncini. A questo punto, posiziona un bastoncino di 20 cm davanti al mouse e guidalo con attenzione per afferrare il bastone con gli arti anteriori. Ripeti il processo finché il mouse non diventa abile nell'afferrare la levetta mobile.
7. Usa la levetta per spostare l'arto anteriore del mouse su un altro bastoncino di 4 cm sulla lavagna trasparente. Regolare costantemente l'angolazione del bastoncino per consentire ai topi di afferrare attivamente il bastoncino fermo da 4 cm sulla tavola (Figura 2C).
8. Ripeti il passaggio precedente mentre il mouse rilascia la zampa anteriore fino a quando il mouse non è esaurito. Dopo 30 minuti, la maggior parte dei ratti non era in grado di sollevare la parte superiore del corpo e afferrare il bastone con gli arti anteriori.
   NOTA: Prima di attuare l'intervento, è necessaria una settimana di allenamento sull'assuefazione sui topi. La durata iniziale dell'allenamento è di 10 minuti al giorno, che vanno poi aumentati di 5 minuti ogni giorno fino a raggiungere un totale di 30 minuti al giorno.
9. Dopo 30 minuti di allenamento, rilasciare immediatamente il mouse e districare la lana per evitare che i piedi si arrossassero e si gonfiassero causati da una legatura prolungata.
   1. Se compaiono lesioni cutanee sulla caviglia dei topi dopo l'allenamento, interrompi l'addestramento dei topi e cerca cure veterinarie professionali fino a quando la caviglia non è sana.
   2. Alcuni topi possono occasionalmente riuscire a liberarsi attraverso un'intensa lotta durante l'allenamento. I topi lottano quando le loro zampe posteriori non sono fissate saldamente. Per evitare lesioni dovute alla lotta, osservare i topi durante l'allenamento. Quando si scopre che gli arti posteriori non sono fissati saldamente o che i topi iniziano a lottare, allentare i topi e rifissarli.
      NOTA: Esperimenti precedenti hanno dimostrato che appendere i topi a testa in giù per 30 minuti al giorno, 5 giorni alla settimana, non provoca l'usura della caviglia, a condizione che vengano liberati a tempo debito¹⁰. I topi possono imparare e abituarsi all'allenamento in 1-3 sessioni.

Figura 2: Metodo di fissazione nel mouse. (A) Legare la parte superiore della caviglia con un nodo scorsoio. (B) L'estremità della fune viene fatta passare attraverso la fessura e tirata stretta, quindi fissata con del nastro adesivo. (C) Allenamento della forza statica nei topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Seguendo il protocollo di cui sopra, gli arti posteriori del topo sono fissi e gli arti anteriori afferrano autonomamente la barra anteriore. L'intervallo di movimento ristretto mantiene il mouse in una posizione relativamente fissa. Si può confermare che i muscoli dei topi si contraggono toccando i muscoli dell'addome e delle gambe. Ciò è coerente con la necessità dello stato di contrazione muscolare isometrica nell'allenamento della forza statica. Addestrare i topi secondo il protocollo, con l'aumento dei tempi di allenamento, aiuterà i topi ad adattarsi all'allenamento riducendo il loro desiderio di lottare. La lotta per la fuga può essere evitata.

Effetti sulla glicemia e sul livello di insulina nei topi con diabete di tipo 2
Un totale di 24 topi C57BL/6J sono stati divisi casualmente nel gruppo di controllo (n=6) e nel gruppo modello T2DM (n=18). I topi T2DM sono stati quindi divisi in modo casuale nel gruppo modello, nel gruppo di allenamento e nel gruppo metformina. Nessun modello o intervento è stato somministrato al gruppo di controllo e nessun intervento è stato somministrato ai topi nel gruppo modello. I topi del gruppo di allenamento hanno ricevuto 30 minuti di allenamento della forza statica una volta al giorno, 5 giorni alla settimana per 3 settimane. Ai topi del gruppo metformina è stata somministrata metformina 200 mg/kg una volta al giorno per 3 settimane. I risultati della glicemia a digiuno (FBG) dopo 3 settimane di intervento sono mostrati nella Figura 3A. Come si può vedere dalla figura, i livelli di FBG dei topi modello T2DM erano significativamente più alti di quelli dei topi di controllo. I topi addestrati all'allenamento statico hanno mostrato livelli di FBG significativamente più bassi rispetto al gruppo modello, suggerendo che l'allenamento statico è efficace nel ridurre l'FBG nei topi con diabete di tipo 2. I livelli sierici di insulina a digiuno (FINS) nel gruppo modello erano significativamente più bassi rispetto al gruppo di controllo, come mostrato nella Figura 3B. Nei gruppi di allenamento e metformina, i livelli di FINS sono aumentati rispetto al gruppo modello. Nella Figura 3C, i topi del gruppo modello avevano un indice di insulino-resistenza (HOMA-IR) significativamente più alto rispetto a quelli del gruppo di controllo, mentre l'HOMA-IR dei gruppi di allenamento statico e metformina era significativamente inferiore a quello del gruppo modello, dimostrando la loro efficacia nell'alleviare lo stato di insulino-resistenza dei topi T2DM. Questi risultati mostrano che la strategia di allenamento della forza statica fornita da questo regime ha effetti simili alla metformina nella regolazione del livello di glucosio nel sangue dei topi T2DM.

Figura 3: Livelli di zucchero nel sangue e di insulina. (A) Confronto dei livelli di glucosio nel sangue a digiuno in topi con diabete di tipo 2 dopo 3 settimane di intervento. * p <0,05 rispetto al gruppo di controllo, # p <0,05 rispetto al gruppo modello. (B) Confronto dei livelli sierici di insulina a digiuno nei topi T2DM dopo 3 settimane di intervento. * p <0,05 rispetto al gruppo di controllo, # p <0,05 rispetto al gruppo modello. (C) Confronto dell'indice di resistenza all'insulina nei topi T2DM dopo 3 settimane di intervento. * p <0,05 rispetto al gruppo di controllo, # p <0,05 rispetto al gruppo modello. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata eseguita per l'analisi statistica. I dati quantitativi sono espressi come media ± SEM (n=6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Effetti sul muscolo scheletrico nei topi T2DM
Il gastrocnemio dei topi è stato osservato mediante microscopia elettronica a trasmissione. Rispetto ai topi di controllo, i miociti del muscolo scheletrico dei topi con diabete di tipo 2 erano degenerati, la struttura delle miofibrille era allentata e la disposizione dei sarcomeri era irregolare (Figura 4A, B). Dopo l'allenamento statico descritto nel protocollo, la Figura 4C mostra la struttura stretta delle fibre miogeniche nella struttura muscolare e la disposizione simmetrica dei segmenti muscolari locali. Ciò suggerisce che l'allenamento della forza statica può regolare la morfologia del muscolo scheletrico nei topi T2DM. D'altra parte, nel gastrocnemio dei topi di controllo, i mitocondri erano distribuiti localmente, con membrane intatte, e i mitocondri erano localmente divisi o fusi (indicati da frecce rosse). Allo stesso modo, nel muscolo scheletrico dei topi dopo l'allenamento statico della forza, il numero di mitocondri è normale; Alcuni di essi sono ovviamente fusi o divisi (freccia rossa). Nel modello di diabete di tipo 2 nei topi, al contrario, il numero di mitocondri è inferiore e c'è una bassa attività. (Vedi Figura 4) Ciò suggerisce che l'allenamento della forza statica può influenzare la funzione e l'attività mitocondriale nelle cellule muscolari scheletriche.

Figura 4: Effetto dell'allenamento statico sul muscolo scheletrico di topi T2DM. (A) Gruppo di controllo; (B) gruppo modello T2DM; (C) Gruppo di allenamento statico. La M rappresenta i mitocondri. Le barre della scala bianca rappresentano 50 μm e le barre della scala rossa rappresentano 10 μm. L'immagine in basso è un ingrandimento parziale dell'immagine in alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'allenamento statico della forza può ridurre l'accumulo di grasso, favorire la perdita di peso e aumentare il metabolismo⁸. Inoltre, migliora l'espressione di PGC-1α e la biogenesi mitocondriale nelle cellule muscolari scheletriche, portando a un miglioramento del metabolismo del glucosio nei topi con diabete mellito di tipo 2 e una conseguente riduzione dei livelli di glucosio nel sangue¹¹. Per confermare l'impatto e il meccanismo dell'allenamento statico sul diabete di tipo 2, è necessario sviluppare dispositivi appropriati per eseguire l'addestramento statico su animali da esperimento.

Questo protocollo introduce un dispositivo per l'allenamento statico nei topi. L'attrezzatura necessaria, come lastre acriliche, bastoncini, filato di lana e pistole per colla a caldo, è prontamente disponibile e il metodo di produzione è semplice e facile. Ciò può ridurre efficacemente il costo dell'esperimento e aumentarne la fattibilità e la ripetibilità. Mantenere una posizione fissa per i topi durante l'allenamento può essere difficile quando si progetta un dispositivo di allenamento statico. In questo protocollo, i piedi del mouse possono essere fissati alla parte anteriore del bastoncino stringendo la morbida lana. Il riflesso di raddrizzamento fa sì che il topo pieghi la parte superiore del corpo verso l'alto, consentendogli così di afferrare la barra davanti con le zampe anteriori. La barra è corta, limitando il raggio di movimento per le zampe anteriori. Dopo due o tre sessioni di allenamento adattivo, i topi sono stati in grado di mantenere una postura stabile. A causa della forza limitata delle zampe anteriori, i topi perdono spesso la presa sulla traversa. È necessario che gli sperimentatori monitorino i topi per tutto il tempo al fine di aiutarli ad afferrare la traversa con gli arti anteriori e prevenire lesioni accidentali ai topi. Attraverso l'allenamento, i topi possono mantenere una posizione fissa per 1-2 minuti alla volta, ripetuta più volte, per circa 30 minuti dopo l'esaurimento. Quando erano esausti, i topi non arrotolavano più l'addome o sollevavano le zampe anteriori. Quando il topo veniva guidato dal bastone ad afferrare con le zampe anteriori, il topo poteva afferrare, ma la parte superiore del suo corpo non era in grado di girare verso l'alto. Sciogliere il nodo il prima possibile dopo aver posato i topi, il che può evitare efficacemente l'edema e l'usura della caviglia.

Esperimenti preliminari indicano che, dopo un periodo di allenamento statico, il livello di glucosio nel sangue dei topi T2DM è diminuito significativamente rispetto al gruppo di controllo dei topi modello. Il muscolo scheletrico è un componente fondamentale nel metabolismo periferico del glucosio ed è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi della glicemia¹². Le analisi al microscopio elettronico hanno indicato che si è verificata una grave degenerazione nelle cellule gastrocnemio di topi T2DM, mentre l'allenamento statico è stato trovato per mitigare la degenerazione del tessuto muscolare. Questi risultati suggeriscono che l'allenamento statico può essere implicato nella regolazione della funzione del muscolo scheletrico. La ricerca ha dimostrato che il mantenimento della funzione del muscolo scheletrico è significativamente influenzato dalla dinamica mitocondriale¹³. Abbiamo osservato una marcata riduzione del numero di mitocondri e una mancanza di attività mitocondriale nelle cellule muscolari del gastrocnemio del gruppo modello di topo T2DM rispetto ai topi selvatici e ai topi con esercizio statico. Questi risultati suggeriscono che l'allenamento statico può promuovere la funzione del muscolo scheletrico migliorando la funzione mitocondriale nelle cellule muscolari scheletriche. Sulla base dei risultati sperimentali precedenti, si può determinare che l'allenamento statico può migliorare considerevolmente il metabolismo della glicemia e dell'insulina nei topi con diabete di tipo 2. Il meccanismo di intervento può essere collegato alla regolazione della funzione mitocondriale del muscolo scheletrico mediante allenamento statico.

Questo protocollo presenta alcune limitazioni. Inizialmente, c'era difficoltà a legare individualmente gli arti posteriori dei topi da parte di una persona, poiché richiedeva che un individuo afferrasse le zampe posteriori mentre un altro eseguiva la legatura. Con alcuni aggiustamenti e una crescente abilità da parte dello sperimentatore, i topi sono diventati più disponibili. Ciò ha permesso il legame indipendente delle zampe posteriori. Inoltre, la lana morbida può ridurre i lividi alle caviglie dei topi.

In conclusione, questo protocollo fornisce un metodo semplice per realizzare attrezzature per l'allenamento statico per topi. Allo stesso modo, è possibile realizzare semplici attrezzature per l'allenamento statico per i ratti aumentando le dimensioni di tavole e bastoncini. Il dispositivo è in grado di mantenere la contrazione isometrica muscolare degli arti dei topi in modo da verificare l'effetto dell'intervento dell'esercizio tradizionale cinese sul diabete di tipo 2 e fornire una nuova prospettiva per il trattamento clinico del diabete di tipo 2.

Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato supportato dal secondo lotto di progetti di ricerca scientifica speciali della Base Nazionale di Ricerca Clinica di Medicina Tradizionale Cinese (JDZX2015127, basata sull'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese di Anhui).