Method Article
O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.
As plantas micoheterotróficas apresentam uma das formas mais extremas de dependência micorrízica, tendo perdido totalmente sua capacidade autotrófica. Tão essenciais quanto qualquer outro recurso vital, os fungos com os quais essas plantas se associam intimamente são essenciais para elas. Assim, algumas das técnicas mais relevantes no estudo de espécies micoheterotróficas são as que possibilitam a investigação de fungos associados, especialmente aqueles que habitam raízes e órgãos subterrâneos. Nesse contexto, técnicas de identificação de fungos endofíticos dependentes e independentes de cultura são comumente aplicadas. O isolamento de endófitos fúngicos fornece um meio para identificá-los morfologicamente, analisar sua diversidade e manter inóculos para aplicações na germinação simbiótica de sementes de orquídeas. No entanto, sabe-se que existe uma grande variedade de fungos não cultiváveis habitando tecidos vegetais. Assim, técnicas de identificação molecular independentes de cultura oferecem uma cobertura mais ampla da diversidade e abundância de espécies. Este artigo tem como objetivo fornecer o suporte metodológico necessário para o início de dois procedimentos de investigação: um dependente de cultura e outro independente. Em relação ao protocolo cultura-dependente, são detalhados os processos de coleta e manutenção de amostras de plantas desde os locais de coleta até as instalações laboratoriais, além do isolamento de fungos filamentosos de órgãos subterrâneos e aéreos de plantas micoheterotróficas, manutenção de uma coleção de isolados, caracterização morfológica de hifas pela metodologia de cultura em lâminas e identificação molecular de fungos por extração de DNA total. Englobando metodologias independentes de cultura, os procedimentos detalhados incluem a coleta de amostras de plantas para análises metagenômicas e extração de DNA total de órgãos de plantas aclorofilas usando um kit comercial. Finalmente, protocolos de continuidade (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR], sequenciamento) também são sugeridos para análises, e técnicas são apresentadas aqui.
Os fungos endofíticos são, por definição, aqueles que habitam o interior dos órgãos e tecidos vegetais em infecções imperceptíveis (isto é, sem causar danos ao seu hospedeiro)1,2. Esses fungos podem interagir de forma neutra ou benéfica com as plantas hospedeiras, podem conferir resistência a patógenos e condições ambientais desfavoráveis e podem contribuir para a síntese de compostos benéficos para a planta (por exemplo, fatores de crescimento e outros fitohormônios)1,3. Os endofíticos micorrízicos são fungos que estabelecem associações micorrízicas com a planta, participando da transferência denutrientes4. Em Orchidaceae, a interação com endófitos micorrízicos é fundamental para a germinação de sementes na grande maioria das espécies e estabelecimento de plântulas em todas as plantas da família5. Nesses contextos, as orquídeas micoheterotróficas representam um caso de total dependência em relação aos seus parceiros micorrízicos, uma vez que dependem da transferência de nutrientes minerais e compostos de carbono por esses fungos durante todo o seu ciclo devida6. Portanto, o isolamento e a identificação de fungos associados são uma base fundamental na investigação de estratégias de vida micoheterotrófica. Além disso, pouco se sabe sobre o papel dos fungos endófitos em plantas micoheterotróficas ou mesmo sobre a real diversidade desses fungos 7,8.
A investigação de fungos endofíticos pode ser realizada por meio de diferentes técnicas, tradicionalmente descritas como independentes ou dependentes de cultura, como, por exemplo: (a) observação direta, (b) isolamento fúngico e identificação morfológica e/ou molecular, e (c) extração total de DNA de tecidos vegetais e identificaçãomolecular9. Na observação direta (a), fungos endofíticos podem ser investigados ainda no interior de células e tecidos vegetais por microscopia de luz oueletrônica9, uma vez que diferentes protocolos de microscopia são detalhados por Pena-Passos et al.10. Pelos métodos de isolamento (b), os endófitos fúngicos podem ser caracterizados de acordo com suas colônias, hifas e morfologia da estrutura reprodutiva ou de resistência. Além disso, por meio de técnicas de isolamento, é possível realizar a identificação molecular de isolados por meio de extração de DNA, amplificação de sequências de identificação molecular (códigos de barras ou impressões digitais) e sequenciamento11. Esta última técnica (c) permite a identificação molecular de fungos endofíticos por extração de DNA no interior dos tecidos vegetais (metacódigo de barras), seguida de preparo e sequenciamento de bibliotecas12.
Além disso, isolados fúngicos podem ser aplicados em ensaios de germinação simbiótica, utilizando sementes de orquídeas autotróficas ou micoheterotróficas. Um exemplo dessa aplicação é a investigação conduzida por Sisti et al.13, descrevendo a germinação e os estágios iniciais de desenvolvimento do protocormo em Pogoniopsis schenckii, uma orquídea micoheterotrófica, em associação com alguns de seus isolados, compostos por fungos endofíticos não micorrízicos. O protocolo de germinação simbiótico aplicado é detalhado e apresentado em vídeo por Pena-Passos et al.10. O isolamento de fungos em associação com diferentes órgãos vegetais permite diversos enfoques de investigação sobre a natureza das interações planta-fungos (por exemplo, compreender aspectos ecológicos ou fisiológicos da associação, bem como investigações sobre a transferência de nutrientes dos fungos para a planta)9.
As metodologias apresentadas na seção 1 baseiam-se em uma coleção de amostras de órgãos subterrâneos, uma vez que esses órgãos apresentam maiores dificuldades de coleta, e são de grande interesse, uma vez que os endófitos micorrízicos os colonizam. No entanto, ambos os protocolos incluídos (etapas 1.1 e 1.2) podem ser aplicados a outros órgãos de plantas micoheterotróficas (por exemplo, rizomas, caules florais e frutos). A metodologia de coleta descrita na etapa 1.1 é designada para o isolamento de fungos endofíticos (seção 2) para caracterização morfológica (seções 4 e 5) e/ou extração total de DNA para identificação de isolados (seção 6). Por outro lado, a metodologia de coleta descrita na etapa 1.2 é atribuída exclusivamente à extração total de DNA de tecidos vegetais para técnicas de metabarcoding (seção 7). Na seção 3, são apresentados quatro métodos para armazenamento e preservação de fungos filamentosos, dois para armazenamento de curta duração (3-6 meses) e os outros dois adequados para armazenamento de longo prazo (>1 ano). A caracterização morfológica (seções 4 e 5) pode ser associada à identificação molecular para reforçá-la e fornecer informações importantes sobre macro e micromorfologia fúngica. A Figura 1 resume as metodologias coletivas descritas a seguir.
Figura 1: Sumarização esquemática dos métodos apresentados. Coleta de plantas e isolamento, preservação e identificação molecular de fungos por metodologias dependentes e independentes de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Coleta de amostras de plantas
2. Isolamento de fungos endofíticos associados a órgãos vegetais14
NOTA: Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min.
3. Preservação de isolados fúngicos purificados
NOTA: Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min.
4. Caracterização macromorfológica de fungos filamentosos (morfologia de colônias)
5. Caracterização micromorfológica de fungos filamentosos (morfologia das hifas)
NOTA: As técnicas micromorfológicas são comparadas na seção de discussão, considerando seus possíveis usos e desvantagens.
Figura 2: Procedimentos para cultivo em lâminas de fungos filamentosos . (A) Configuração esquemática de um kit de cultura de lâminas, onde os números indicam a ordem de disposição dos elementos. (B) Descolamento do quadrado do meio de cultura após o crescimento das hifas é observado na lâmina de vidro e na lamínula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Extração total de DNA de isolados fúngicos (protocolo caseiro26 com modificações 27)
NOTA: Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min. Use luvas durante todo o protocolo e realize algumas etapas dentro de uma coifa.
7. Extração total de DNA de órgãos vegetais para metodologia de metabarcoding (kit comercial)
OBS: Para a metodologia a seguir, é necessário adquirir o kit comercial indicado na Tabela de Materiais como kit de extração de DNA do solo. Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min. É altamente recomendável o uso de luvas durante todo o protocolo, e as etapas podem ser conduzidas dentro de uma capela de fluxo laminar. O protocolo descrito é modificado de De Souza et al.12, a partir do protocolo detalhado pelo fabricante.
8. Quantificação de DNA em espectrofotômetro (consulte a Tabela de Materiais)
No protocolo de isolamento, considerando que há contaminação da água utilizada na última lavagem e a contaminação também é detectada nas placas de Petri com fragmentos inoculados, diferentes ações podem ser tomadas, dependendo do tipo de contaminante (Tabela 1). Esse procedimento deve ser repetido desde o início no caso de contaminantes fúngicos altamente esporulantes, que também apresentam crescimento acelerado, e bactérias multiplicadoras intensas, resistentes aos antibióticos escolhidos. Em vez disso, se o contaminante fúngico apresentar crescimento lento ou não esporular, é possível simplesmente evitar isolá-lo nas etapas subsequentes do protocolo. Finalmente, contaminações com cepas bacterianas que se multiplicam lentamente também podem ser facilmente evitadas nas etapas posteriores, especialmente na purificação, ao recuperar hifas.
Em todos os casos apresentados anteriormente, o cenário ideal é refazer o procedimento de desinfestação utilizando outras amostras e instalar os fragmentos da planta em meio de cultura que combine outros antibióticos, com um espectro de ação mais amplo, nos casos de bactérias resistentes contaminando as primeiras placas. Entretanto, considerando as dificuldades envolvidas na coleta de novas amostras e obtenção de órgãos de plantas micoheterotróficas, alguns casos podem ser resolvidos com sucesso nas etapas posteriores do protocolo, como apresentado na Tabela 1.
Contaminante | Característica do contaminante | Possível consequência da contaminação | Ação necessária | |||
Bactéria | Multiplicação intensa | Inibição total ou parcial do crescimento dos endófitos de interesse | Reiniciar o isolamento desde o início | |||
Multiplicação lenta | Isolamento da bactéria junto com o endófito de interesse | Evitar colônias de bactérias durante a purificação | ||||
Parede celular | Crescimento vigoroso e/ou altamente esporulante | Impossibilita isolar e/ou purificar os endófitos de interesse | Reiniciar o isolamento desde o início | |||
Crescimento lento e/ou não esporulante | Isolamento do contaminante por engano | Evitar o isolamento do contaminante |
Tabela 1: Descrição dos possíveis contaminantes no processo de isolamento de fungos endofíticos, consequências da contaminação e procedimentos de mitigação.
Após 5 dias da instalação dos fragmentos de órgãos no meio BDA, é possível visualizar o crescimento de pequenos grupos de micélios de fungos filamentosos, emergindo do interior dos fragmentos (Figura 3). Cada morfotipo micelial deve resultar em um isolado fúngico ao final do protocolo de isolamento, considerando que cada um deles deve ser estriado em uma nova placa de Petri com meio AA para purificação. Recomenda-se que as placas originais da instalação do fragmento não sejam descartadas antes de completar todo o protocolo de isolamento. Podem ser mantidos refrigerados a 4 °C até à obtenção das colónias purificadas. Além disso, em relação a essa parte do protocolo, a análise de FI pode ser muito útil na avaliação da porcentagem de amostras de tecido que resultam em fungos isolados entre o total de amostras instaladas.
Figura 3: Fragmentos radiculares para isolamento fúngico em ágar batata-dextrose. Fungos endofíticos cultiváveis crescendo a partir de fragmentos radiculares de uma orquídea micoheterotrófica após cerca de 5 dias de incubação. Cada placa de Petri (A, B e C) contém cinco fragmentos de raízes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Após 3 dias após a incubação das placas de AA para purificação do isolado, minúsculas colônias hifais, quase imperceptíveis, deveriam ter crescido a partir das estrias no meio AA. Nesta fase, caso houvesse contaminação por bactérias de crescimento lento nas placas de isolamento, é possível que essas bactérias também tenham sido transferidas para as placas AA com as hifas endofíticas fúngicas selecionadas. Se assim for, as bactérias ficarão restritas às regiões da estria, com pouco crescimento quando comparadas ao fungo, permitindo a recuperação apenas do fungo de interesse para novas placas de PDA.
Durante 7-14 dias da inoculação dos isolados fúngicos purificados em placas de PDA, a colônia pura deve crescer centrifugamente (do centro da placa até sua periferia), formando um único micélio circular (Figura 4). Possíveis contaminações são facilmente identificadas nessa etapa, pois comprometem consideravelmente a homogeneidade da colônia quanto ao seu crescimento, forma, aspecto, cor, produção de pigmentos no meio, etc. (Figura 5). Supondo que as colônias finais obtidas não sejam puras, os fungos inicialmente cultivados a partir dos fragmentos de órgãos devem ser submetidos novamente aos procedimentos de purificação, por estriação e subcultura (etapa 2.4). É possível recuperar os isolados dos órgãos inicialmente instalados ou das placas de isolamento finais contendo culturas heterogêneas.
Figura 4: Representação de isolados fúngicos purificados, cultivados por 7-14 dias em meio de cultura BDA. Na primeira e terceira colunas (A, C, E, G, I e K), as colônias registradas são vistas do lado superior; a segunda e a quarta colunas (B, D, F, H, J e L) apresentam as mesmas colônias, respectivamente vistas de baixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Representação de isolados fúngicos impuros, cultivados por 7-14 dias em meio de cultura BDA. Na primeira coluna (A, D e G), uma visão geral das colônias do lado superior é vista; a segunda coluna (B, E e F) mostra as colônias em detalhes; a terceira coluna (C, F e I) mostra as colônias da parte inferior. Os números representam diferentes morfotipos fúngicos presentes em cada prato, e as linhas representam uma delimitação sutil entre os diferentes isolados fúngicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A preservação dos isolados não deve ser feita com um único método de armazenamento, pois cada fungo pode apresentar maior ou menor sensibilidade a cada método descrito. É altamente aconselhável escolher pelo menos dois tipos de armazenamento para cada isolado fúngico, garantindo mais chances de sucesso em preservá-lo. Ressaltamos que a inviabilidade de fungos preservados em Castellani ou óleo mineral é esperada após 6 meses ou menos. Os pesquisadores devem considerar se esses são os únicos métodos de preservação escolhidos, para evitar possíveis perdas inesperadas de isolados. Para estender esse período limitado, é possível reativar os isolados fúngicos cultivando-os no meio BDA (39 g/L) por 2-3 semanas e, em seguida, armazenando-os novamente. Após um período de armazenamento, espera-se que os isolados apresentem um crescimento mais lento, comparado à taxa de crescimento observada antes de sua preservação, e colônias com aspectos menos vigorosos (isto é, menos densas, de coloração diferente). Subcultivar algumas vezes em meio de cultura rico em nutrientes é suficiente para restabelecer tais características.
Ao avaliar a macromorfologia das colônias obtidas no procedimento de isolamento, dados qualitativos devem ser coletados, considerando o maior número possível de características: (a) cor da colônia (parte superior e inferior), que podem ser analisadas por meio de guias de cores impressos (por exemplo, Rayner28, Kornerup & Wanscher29, Ridgway30); (b) opacidade das colônias: transparente, opaca, translúcida; (c) pigmentos difusíveis no meio31 (presença/ausência e cor); (d)exsudato 31 (presença/ausência, cor, aspecto geral); (e) estruturas macroscópicas31 (presença/ausência, tipo e aparência; por exemplo, escleródios, picnidia); (f) micélio aéreo e submerso 19,32,21 (presença/ausência, aparência escassa ou abundante); (g) aparência da margem19 (cor, forma, uniformidade - submersa ou aérea); e (h) topografia da colônia (amontoada, enrugada, crateriforme, plana, etc.), a aparência geral e textura - cotonosa, aveludada, pulverulenta, lanosa, sebácea (cerosa), glabra, calcária, esbelta, coriácea, espinhosa, etc.19,21.
Figura 6: Macro e micromorfologia de um fungo não identificado isolado da orquídea micoheterotrófica Wullschlaegelia aphylla. (A) Aspectos superiores e (B) inferiores da colônia, (C) visão amplificada das hifas aéreas (como visto em um estereomicroscópio). Micromorfologia das hifas (D) sem coloração e coradas com (E) LPCB e (F) TBO. Abreviações: c = conidióforo, p = fialide, s = septo. Barras de escala: A,B = 2 cm; C = 2 mm; D-F = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Na Figura 6, é mostrada uma colônia isolada das raízes fusiformes da orquídea micoheterotrófica Wullschlaegelia aphylla, aplicando-se a metodologia descrita. A colônia é esbranquiçada a cinzenta na face superior (Figura 6A) e acastanhada na face inferior (Figura 6B). É opaco, sem pigmentos difusíveis no meio nem exsudatos. Os micélios são aéreos e abundantes, as margens são irregulares e aéreas, e a colônia tem textura aveludada e topografia enrugada (Figura 6A). Estruturas macroscópicas estão ausentes.
O método de cultura de lâminas é tradicional e vantajoso e, embora demorado, pode ser aplicado para produzir lâminas permanentes que podem ser examinadas posteriormente. Os diferentes corantes aqui apresentados podem ser utilizados para evidenciar estruturas importantes, e requerem testes nas amostras, para determinar o tempo de incubação mais adequado. Vermelho Congo e TBO são manchas de uso geral. O vermelho Congo é adequado para demonstrar algumas estruturas delicadas (leitura adicional: Malloch22). A TBO cora o conteúdo celular mais intensamente do que a parede celular do fungo (Figura 6F). Apesar de ser um corante usual para estruturas vegetais e não tão comum em microscopia fúngica, a TBO tem uma importante propriedade metacromática33, o que favorece outras aplicações, como a análise de fungos em tecidosvegetais10. LPCB é um corante amplamente aplicado na análise fúngica, embora exija cautela por causa do fenol. O azul de algodão (sinônimo: azul de metila) é a mancha, o ácido lático é um agente de limpeza e o fenol é um agente de morte21. O LPCB tem afinidade por quitina e evidencia paredes de esporos e ornamentações23,24. Os septos fúngicos não são corados por LPCB (Figura 6E) nem TBO (Figura 6F), facilitando a identificação destas estruturas. A aplicação de colorações é vantajosa para evidenciar estruturas que não são facilmente visualizadas quando as hifas não são coradas (Figura 6D).
Para a extracção de ADN de fungos e amostras de raízes, deve ser respeitada a quantidade de amostra triturada em azoto líquido a adicionar ao tampão de extracção, não excedendo a quantidade indicada no protocolo. Devemos ressaltar que uma grande quantidade de amostra processada não representa simplesmente a obtenção de uma alta concentração de DNA sem grandes inconvenientes, pois pode comprometer consideravelmente a qualidade final do DNA. Isso ocorre ao saturar os seguintes estágios de purificação do DNA. Além disso, a concentração de compostos putativos produzidos por plantas ou fungos (por exemplo, pigmentos, metabólitos secundários), presentes na solução final com DNA, pode atuar na redução da qualidade do DNA e/ou inibir a reação em cadeia da polimerase (PCR). Outra questão que pode reduzir significativamente a qualidade do DNA é sucatear completamente o meio de cultura com micélio fúngico e moê-lo, o que deve ser fortemente evitado. Alguns reagentes do procedimento de extração (por exemplo, fenol, álcool etílico, SDS) e outras substâncias (por exemplo, pigmentos fúngicos) podem ser inibidores interferindo na PCR.
Nas etapas de limpeza do DNA, ao utilizar fenol e clorofórmio, o sobrenadante deve sempre representar a fase com menos impurezas, compreendendo normalmente a fase mais clara. Durante tal estágio, a fase inferior não deve ser recuperada quando aspirar o sobrenadante que será transferido para novos tubos. Ao final do protocolo, o pellet (constituído por DNA) deve apresentar uma coloração translúcida (altamente desejável) a esbranquiçada. Na etapa de secagem, proceder à secagem do DNA em termobloco é fundamental para evaporar completamente o etanol. Após 12 h a 4 °C, o pellet deve ter eluído completamente na solução aquosa adicionada aos tubos, não sendo visível depois disso. Caso a eluição não esteja completa e a concentração de DNA esteja muito abaixo da concentração ideal, é possível manter a solução refrigerada por mais 12 h, sem perdas significativas em sua qualidade.
As análises de DNA no software geram uma tabela, representada na Tabela 2, onde são indicados os dados referentes à quantidade e qualidade do DNA. A quantificação do DNA é dada pela concentração de ácidos nucléicos em nanogramas por microlitro de uma amostra. Considerando a identificação molecular dos fungos isolados, as amostras de DNA devem ter concentração de aproximadamente 200 ng/μL, ideal para as etapas de PCR. Nos casos de amostras com concentrações mais elevadas de ácidos nucleicos, deve ser diluída uma alíquota da amostra, aproximando a concentração do valor anteriormente mencionado. Amostras com concentrações excessivamente altas, como as amostras 1 e 2 da Tabela 2, podem sugerir uma falsa detecção devido a contaminantes na solução. Enquanto isso, amostras com menores concentrações de ácidos nucleicos, como a de número 7 (Tabela 2), ainda podem ser utilizadas para PCR, sendo importante aplicar um volume maior de amostra nas reações. Em relação aos parâmetros de qualidade, é satisfatório que os quocientes 260/280 e 260/230 estejam entre 1,8 e 2,2, conforme indicado nas amostras 3, 5 e 8 (Tabela 2). As amostras que apresentarem tais valores (estando muito abaixo ou acima) devem ser submetidas a novas extrações de DNA, conforme indicado nas amostras 9 e 10 da Tabela 2. Nos casos de amostras com quantidade adequada de DNA e minimamente superior à faixa ideal de qualidade, como sugerem os valores 260/280 e 260/230 dos números 4 e 6 (Tabela 2), a diluição é o procedimento mais benéfico para tornar a concentração de ácido nucleico adequada para a PCR e diluir possíveis inibidores, como reagentes vestigiais do procedimento de extração, nas amostras.
Amostra | Ácido Nucleico Conc. | Unidade | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | Tipo de amostra |
1 | 14491.7 | ng/μL | 289.833 | 141.175 | 2.05 | 1.8 | ADN |
2 | 13359.3 | ng/μL | 267.187 | 124.607 | 2.14 | 2.15 | ADN |
3 | 1137.6 | ng/μL | 22.751 | 10.574 | 2.15 | 2.13 | ADN |
4 | 1472.6 | ng/μL | 29.452 | 13.287 | 2.22 | 2.16 | ADN |
5 | 3464.8 | ng/μL | 69.295 | 33.329 | 2.08 | 1.88 | ADN |
6 | 1884.2 | ng/μL | 37.684 | 17.912 | 2.1 | 1.78 | ADN |
7 | 187.6 | ng/μL | 3.751 | 1.834 | 2.05 | 2.06 | ADN |
8 | 1580.3 | ng/μL | 31.607 | 15.281 | 2.07 | 1.98 | ADN |
9 | 923.3 | ng/μL | 18.466 | 9.196 | 2.01 | 1.37 | ADN |
10 | 2414.4 | ng/μL | 48.287 | 21.008 | 2.3 | 3.45 | ADN |
Tabela 2: Resultados gerados no software a partir de amostras de DNA fúngico analisadas em espectrofotômetro.
Diferente das amostras de DNA de fungos endofíticos isolados, a concentração de DNA nas amostras para análise de metabarcoding deve apresentar grandes quantidades de moléculas de DNA extraídas, com alta qualidade e peso molecular. As amostras devem ser avaliadas por eletroforese em gel de agarose, obtendo-se a máxima integridade possível, com pouca ou nenhuma mancha no gel.
A desinfestação superficial de amostras de plantas é uma das etapas mais críticas do protocolo apresentado. Nenhuma contaminação nas placas de PDA com gotas da última lavagem são altamente desejáveis. Bactérias são frequentemente observadas como contaminantes nas placas de isolamento, geralmente mais do que fungos esporulantes transportados pelo ar, considerando que bactérias endofíticas também são comuns nos tecidos vegetais 3,11. Assim, a adição de antibióticos no meio de cultura na instalação dos fragmentos de órgãos é essencial. Melhores resultados são obtidos quando se combinam diferentes tipos de antibióticos, resultando em um espectro de ação mais amplo. Outra consideração importante é o viés intrínseco no isolamento dos fungos, pois o uso de PDA e AA inevitavelmente selecionará certas espécies e desfavorecerá outras. A combinação de outros meios de cultura pode minimizar o viés, mas não eliminar tais limitações9.
Geralmente, fungos que produzem esporos durante o crescimento em placas de Petri apresentam maiores taxas de sobrevivência em protocolos de preservação, em temperaturas mais baixas ou não, e isolados não esporulantes podem não tolerar a preservação de Castellani ou óleo mineral34,35,36, de modo que um método de criopreservação pode ser crucial nesses casos. Além disso, alguns isolados podem ser sensíveis ao congelamento, e a adição de crioprotetores auxilia na preservação, como no método apresentado comvermiculita18. As características da colônia e das hifas podem ser úteis para agrupar os isolados com características semelhantes, facilitando a seleção para uso em tratamentos simbióticos de germinação (conforme detalhado por Pena-Passos et al.10). Essas características também contribuem para a escolha dos métodos de preservação a serem aplicados, principalmente considerando a esporulação ou sua ausência.
A caracterização morfológica dos isolados também melhora e complementa as descrições morfológicas disponíveis na literatura especializada, especialmente quando associada à caracterização molecular. Apesar de ser um desafio com numerosos isolados, a caracterização morfológica dos fungos é demorada e depende de dados publicados. Mesmo que apenas a caracterização molecular esteja planejada para ser realizada, é aconselhável manter um registro fotográfico da aparência da colônia (macromorfologia) e publicá-lo sempre que possível, para contribuir com futuros procedimentos de identificação. A manutenção de fotos das placas onde os fragmentos estão instalados também é importante, para permitir a comparação entre os isolados finais obtidos e os morfotipos observados crescendo nas placas de instalação. Nesse caso, os fungos comparados devem ser cultivados no mesmo tipo de meio. Metodologias adicionais são encontradas em Currah et al.16 para avaliar fungos micorrízicos comuns de orquídeas, como cultivo em meio de ácido tânico (MAT) para diferenciar os gêneros Epulorhiza (teleomorfo: Tulasnella) e Ceratorhiza (teleomorfo: Ceratobasidium), e cultivo em CMA para estimular células monilioides para a caracterização de fungos do complexo Rhizoctonia .
Considerando os métodos detalhados para observar hifas fúngicas sob microscópio de luz, a montagem em tease e a fita adesiva são mais rápidas do que a cultura em lâminas, embora o método de tease mount não seja adequado para analisar esporos e medir ângulos de ramos. A montagem com fita adesiva preserva melhor a organização micelial do que a técnica de tease mount, embora o uso de fita adesiva não seja tão confiável quanto a cultura de lâminas para medir ângulos de ramos (observação dos autores). A cultura de lâminas, apesar de demorada, é a técnica mais adequada para a produção de lâminas semipermanentes e permanentes. A macro e a micromorfologia são analisadas considerando a literatura. Webster e Weber32 é uma extensa fonte geral de informações e referências adicionais. Currah et al.16 e Zettler eCorey37 fornecem informações úteis sobre fungos micorrízicos de orquídeas. Apesar de descreverem fungos de importância médica, Walsh et al.21 e McGinnis31 também são úteis sobre características gerais de colônias de fungos filamentosos, informações visuais/descritivas e referências adicionais para micromorfologia fúngica.
Segundo Yu et al.38, as análises de quantificação de DNA em espectrofotômetro apresentam grande precisão e acurácia, sendo consistentes com análises quantitativas de PCR em tempo real. Uma observação importante é que alguns isolados podem não fornecer amostras de DNA adequadamente puras para as etapas subsequentes de identificação molecular, uma vez que os endófitos fúngicos dos micoheterotróficos são extremamente diversos, especialmente aqueles associados a plantas tropicais39, assim como os metabólitos produzidos. Análises em espectrofotômetros podem ser usadas para avaliar esses casos e diferentes protocolos, ou kits comerciais aplicados para purificação do DNA das amostras. As etapas subsequentes sugeridas na identificação molecular dos isolados são a amplificação da região do espaçador interno transcrito (ITS) e o sequenciamento. A região ITS é um DNA expansor de RNA ribossomal extensivamente empregado na literatura especializada e formalmente aceito como o principal código de barras para identificação defungos9,40. Pode ser amplificada por PCR com os primers ITS1 e ITS441, depois sequenciada na plataforma de Sanger42.
Análises de metabarcode, além de permitirem investigar a riqueza, abundância e composição taxonômica de microrganismos em amostras ambientais e vegetais, podem fornecer resultados de interações positivas ou negativas entre esses microrganismos12. A etapa de maceração com nitrogênio líquido adicionado ao protocolo padrão DNeasy PowerSoil visa quebrar o maior número possível de células fúngicas em relação aos tecidos vegetais, possibilitando melhor amostragem da comunidade fúngica no tecido macerado11. A escolha de primers para sequências fúngicas (códigos de barras) na identificação molecular deve considerar a interferência com o DNA vegetal. Aconselhamos o uso de primers que amplificam regiões variáveis do gene 18S do fungo, por exemplo, ITS1-5,8S-ITS243. Após a obtenção das amostras de DNA, as etapas subsequentes são a preparação das bibliotecas metagenômicas, que dependem da plataforma de sequenciamento escolhida, o sequenciamento posterior das bibliotecas e a análise dos dados obtidos por meio de ferramentas de bioinformática. Recomendamos o uso da plataforma Illumina MiSeq, que representa uma opção mais barata e de alta saída, gerando sequências de 250 pb em curtos períodos de tempo11,44.
Os autores não têm nada a revelar e nenhum conflito de interesses.
Agradecemos o financiamento da FAPESP (2015/26479-6) e do CNPq (447453/2014-9). JLSM agradece ao CNPq pelas bolsas de produtividade (303664/2020-7). O MPP agradece à Capes (bolsa de mestrado, processo 88887.600591/2021-00) e ao CNPq.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesive tape | (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses) | ||
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A5354 | (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1) |
Autoclave | (from any company, for materials sterilization in many steps) | ||
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A1296 | (for many steps) |
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
Centrifuge | Merck/Eppendorf | 5810 G | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Centrifuge tubes | Merck | CLS430828 | (for samples collection) |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Congo red | Supelco | 75768 | (for hyphae staining) |
Cryotubes | Merck | BR114831 | (for many steps) |
Ethanol | Supelco | 100983 | It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Filter paper | Merck | WHA10010155 | (for many steps) |
Glass test tubes | Merck | CLS7082516 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
Glass wool | Supelco | 20411 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite) |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB) |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 252476 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
Lactophenol blue solution (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (for hyphae staining) |
Laminar flow hood | (class I, from any company, for many steps) | ||
Light microscope | (from any company, for hyphae observation) | ||
MB Spin Columns | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
Methyl blue (cotton blue) | Sigma-Aldrich | M5528 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Merck | HS4323 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Microcentrifuge tube (2 mL) | Merck | BR780546 | (for many steps) |
Mineral oil | (for preservation of fungal isolates) | ||
Paper bags | Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection) | ||
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones) |
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB) |
Porcelain mortar | Sigma-Aldrich | Z247464 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Porcelain pestle | Sigma-Aldrich | Z247502 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Potato dextrose agar (PDA) | Millipore | P2182 | (for many steps) |
PowerBead tubes | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
Rapid mounting medium (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (for fungi slide culture) |
Silica gel | Supelco | 717185 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) | (commercial product, for superficial desinfestation) | ||
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (for total DNA extraction from plant organs) |
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (for total DNA extraction from plant organs) |
Stereomicroscope | (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses) | ||
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (for installation of plant fragments) |
Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (or from other companies) |
Tissue homogenizer and cell lyzer | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs) | |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (for hyphae staining) |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (for cryopreservation in vermiculite) |
Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Unhulled rice grains | (for cryopreservation) | ||
U-shaped glass rod | (or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture) | ||
Vermiculite | Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite) | ||
Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | (for cryopreservation in vermiculite) |
An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
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Juliana Lischka Sampaio Mayer
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