בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

צמחים Mycoheterotrophic להציג את אחת הצורות הקיצוניות ביותר של תלות mycorrhizal, לאחר שאיבדו לחלוטין את היכולת האוטוטרופית שלהם. חיוני כמו כל משאב חיוני אחר, הפטריות שצמחים אלה מתקשרים איתן באופן אינטימי חיוניות עבורם. לפיכך, כמה מהטכניקות הרלוונטיות ביותר בחקר מינים מיקוהטרוטרופיים הן אלה המאפשרות חקירה של פטריות הקשורות, במיוחד אלה המאכלסות שורשים ואיברים תת קרקעיים. בהקשר זה, טכניקות לזיהוי פטריות אנדופיטיות תלויות תרבית ובלתי תלויות תרבית מיושמות בדרך כלל. בידוד אנדופיטים פטרייתיים מספק אמצעי לזיהוי מורפולוגי שלהם, ניתוח המגוון שלהם ושמירה על החיסון ליישומים בנביטה סימביוטית של זרעי סחלבים. עם זאת, ידוע כי יש מגוון גדול של פטריות שאינן ניתנות לגידול המאכלסות רקמות צמחים. לפיכך, טכניקות זיהוי מולקולרי תלויות תרבות מציעות כיסוי רחב יותר של מגוון המינים ושפע. מאמר זה נועד לספק את התמיכה המתודולוגית הדרושה להתחלת שני הליכי חקירה: תלוי תרבות והליך עצמאי. באשר לפרוטוקול תלוי התרבית, מפורטים תהליכי איסוף ושמירה של דגימות צמחים מאתרי איסוף למתקני מעבדה, לצד בידוד פטריות נימה מאיברים תת-קרקעיים ואוויריים של צמחים מיקוהטרוטרופיים, שמירה על אוסף של מבודדים, אפיון מורפולוגי של קורים על ידי מתודולוגיית תרבית שקופיות, וזיהוי מולקולרי של פטריות על ידי מיצוי DNA כולל. הנהלים המפורטים, הכוללים מתודולוגיות שאינן תלויות בתרבות, כוללים איסוף דגימות צמחים לצורך ניתוח מטאגנומי ומיצוי DNA כולל מאיברי צמח אכלורופילוסים באמצעות ערכה מסחרית. לבסוף, פרוטוקולי המשכיות (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR], ריצוף) מוצעים גם הם לניתוחים, וטכניקות מוצגות כאן.

פטריות אנדופיטיות הן, מעצם הגדרתן, אלה המאכלסות את פנים איברי הצמח ורקמותיהן בזיהומים לא בולטים (כלומר, מבלי לגרום נזק לפונדקאי שלהן)^1,2. פטריות אלה יכולות לקיים אינטראקציה ניטרלית או מועילה עם צמחים מארחים, עשויות להעניק עמידות לפתוגנים ולתנאי סביבה שליליים, ועשויות לתרום לסינתזה של תרכובות מועילות לצמח (למשל, גורמי גדילה ופיטוהורמונים אחרים)^1,3. אנדופיטים מיקוריזים הם פטריות המקימות קשרים מיקוריזליים עם הצמח, ולוקחות חלק בהעברת חומרים מזינים⁴. ב Orchidaceae, האינטראקציה עם אנדופיטים mycorrhizal היא בסיסית נביטת זרעים ברוב המכריע של המינים, והתבססות שתילים בכל הצמחים במשפחה⁵. בהקשרים כאלה, סחלבים מיקוהטרוטרופיים מייצגים מקרה של תלות מוחלטת בבני זוגם המיקוריזליים, שכן הם תלויים בחומרים מזינים מינרליים ובהעברת תרכובות פחמן על ידי פטריות אלה במהלך כל מחזור החיים שלהם⁶. לכן, בידוד וזיהוי של שיוך פטריות הוא בסיס בסיסי בעת חקירת אסטרטגיות חיים mycoheterotrophic. יתר על כן, מעט ידוע על תפקידם של אנדופיטים פטרייתיים בצמחים מיקוהטרוטרופיים או אפילו על המגוון האמיתי של פטריות אלה ^7,8.

חקירת פטריות אנדופיטיות יכולה להתבצע באמצעות טכניקות שונות, המתוארות באופן מסורתי כבלתי תלויות תרבית או תלויות תרבית, למשל: (א) תצפית ישירה, (ב) בידוד פטרייתי וזיהוי מורפולוגי ו/או מולקולרי, ו-(ג) מיצוי דנ"א כולל של רקמות צמחים וזיהוי מולקולרי⁹. בתצפית ישירה (a), פטריות אנדופיטיות עשויות להיחקר בעודן בפנים תאי צמחים ורקמות על ידי מיקרוסקופ אור או אלקטרונים⁹, כפי שפרוטוקולי מיקרוסקופיה שונים מפורטים על ידי Pena-Passos et ^al.10. בשיטות בידוד (b), אנדופיטים פטרייתיים יכולים להיות מאופיינים על פי מושבותיהם, קוריהם ומורפולוגיה של מבנה הרבייה או ההתנגדות שלהם. כמו כן, באמצעות טכניקות בידוד, ניתן לבצע זיהוי מולקולרי של מבודדים באמצעות מיצוי DNA, הגברה של רצפי זיהוי מולקולריים (ברקודים או טביעות אצבע), וריצוף¹¹. הטכניקה האחרונה (c) מאפשרת זיהוי מולקולרי של פטריות אנדופיטיות לכל מיצוי DNA בפנים רקמות הצמח (metabarcoding), ולאחר מכן הכנת ספרייה וריצוף¹².

יתר על כן, מבודדים פטרייתיים עשויים להיות מיושמים בניסויי נביטה סימביוטיים, באמצעות זרעים מסחלבים אוטוטרופיים או מיקוהטרוטרופיים. דוגמה ליישום כזה היא החקירה שנערכה על ידי Sisti et ^al.13, המתארת את הנביטה ואת השלבים הראשונים של התפתחות פרוטוקורם ב- Pogoniopsis schenckii, סחלב מיקוהטרוטרופי, בשיתוף עם חלק מהמבודדים שלו, הכוללים פטריות אנדופיטיות שאינן מיקוריזליות. פרוטוקול הנביטה הסימביוטי היישומי מפורט ומוצג בסרטון של Pena-Passos et ^al.10. בידוד פטריות בשיתוף עם איברי צמח שונים מאפשר חקירה מגוונת המתמקדת באופי יחסי הגומלין בין צמח לפטריות (למשל, להבין היבטים אקולוגיים או פיזיולוגיים של הקשר, כמו גם חקירת העברת חומרי מזון מפטריות לצמח)⁹.

המתודולוגיות המוצגות בסעיף 1 מבוססות על אוסף של דגימות איברים תת-קרקעיים, שכן איברים אלה מציגים את הקשיים הרבים ביותר באיסוף, והם בעלי עניין רב מכיוון שהאנדופיטים מיקוריזים מאכלסים אותם. עם זאת, שני הפרוטוקולים הכלולים (שלבים 1.1 ו-1.2) עשויים להיות מיושמים על איברי צמח מיקוהטרוטרופיים אחרים (למשל, קני שורש, גבעולי פרחים ופירות). מתודולוגיית האיסוף המתוארת בשלב 1.1 מיועדת לבידוד פטריות אנדופיטיות (סעיף 2) לאפיון מורפולוגי (סעיפים 4 ו-5) ו/או מיצוי DNA כולל לזיהוי מבודד (סעיף 6). מצד שני, מתודולוגיית האיסוף המתוארת בשלב 1.2 מוקצית באופן בלעדי למיצוי DNA כולל של רקמות צמחים עבור טכניקות metabarcoding (סעיף 7). בסעיף 3 מוצגות ארבע שיטות לאחסון ושימור פטריות נימה, שתיים לאחסון לטווח קצר (3-6 חודשים) והשתיים האחרות מתאימות לאחסון לטווח ארוך (> שנה). האפיון המורפולוגי (סעיפים 4 ו-5) עשוי להיות קשור לזיהוי מולקולרי כדי לחזק אותו ולספק מידע חשוב על מאקרו פטרייתי ומיקרומורפולוגיה. איור 1 מסכם את המתודולוגיות הקולקטיביות שתוארו להלן.

איור 1: סיכום סכמטי של השיטות המוצגות. איסוף צמחים ובידוד פטריות, שימור וזיהוי מולקולרי על ידי מתודולוגיות תלויות תרבות ובלתי תלויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. איסוף דגימות צמחים

1. איסוף דוגמאות לשיטות תלויות תרבות
   1. בזהירות לחפור את האיברים התת-קרקעיים; אלה יכולים להיות שורשים, גבעולים, קני שורש, או איברי אחסון של הצמח שיש לאסוף. מלבד קרקעות קומפקטיות מאוד, לאסוף דגימות אלה ביד.
      הערה: השימוש בכלים כגון מגבונים או כפות מדידה בשלב זה אינו מומלץ, מכיוון שהוא עלול לפגוע במבנים השבירים של צמחים מיקוהטרוטרופיים ועלול לגרום לזיהום רקמות על ידי פטריות שאינן אנדופיטיות.
   2. לאסוף כמה שיותר איברים תת קרקעיים. שמרו את הדגימות בשקיות נייר בתוך מיכל מקורר (למשל, קופסת קצף פוליסטירן או שקית תרמית עם קרח). אם נאספים גם איברים אוויריים, להעביר אותם בנפרד מן אלה subterrane.
2. איסוף דוגמאות לשיטות תלויות תרבות
   1. חפרו בזהירות את שורשי הצמח שייאספו תחת אותן המלצות שצוינו בהערה משלב 1.1.1.
   2. לאסוף כמה שיותר איברים תת קרקעיים. שמור את הדגימות שנאספו בצינורות קריו-צינור בתוך חנקן נוזלי (אפשרות רצויה) או השתמש בצינורות צנטריפוגות מוקפים בקרח יבש (אפשרות חלופית). יש לשמור על איברים אוויריים בנפרד, אם נאספים.

2. בידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לאיברי צמחים¹⁴

הערה: כל חומר, תמיסה וריאגנט המשמשים בסעיף זה חייבים להיות סטריליים. אלה שלא ניתן לרכוש כבר מעוקר צריך להיות autoclaved ב 121 ° C במשך 20 דקות.

1. התפשטות שטחית של איברי צמח
   1. שטפו את הדגימות שנאספו (שלב 1.1.2) במים זורמים והוציאו כמה שיותר מצע ופסולת אחרת שהדגימות יכולות להכיל.
   2. בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, שמרו את הדגימות השטופות טבולות באתנול 70% למשך דקה אחת (ניתן להשתמש בכוס או בצנצנת זכוכית).
   3. מעבירים את הדגימות למיכל אחר עם נתרן היפוכלוריט עם 2% כלור פעיל למשך 3 דקות.
   4. החליפו את הדגימות למיכל עם 70% אתנול ושמרו טבולות למשך דקה. לאחר מכן, שטפו את הדגימות ברצף בשני מיכלים עם מים מזוקקים.
2. התקנת שברי צמחים במדיום תרבית
   הערה: כל שלב המפורט בשלב 2.2 חייב להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית.
   1. לפני ההתקנה, להכין צלחות פטרי (8-10 ס"מ קוטר) עם 19.5 גרם / ליטר תפוח אדמה דקסטרוז אגר תרבית בינונית (PDA) + 7 גרם / ליטר אגר בקטריולוגי + 3 מ"ל / ליטר אנטיביוטיקה (למשל, סטרפטומיצין, פניצילין, טטרציקלין, אמפיצילין).
   2. שמור על צלחות פטרי עם מדיום התרבית ב 36 ° C במשך 24 שעות לפני השימוש בהם כדי להבטיח שאין זיהום. השליכו כלים מזוהמים במושבות חיידקים או פטריות.
      הערה: תוספת אנטיביוטיקה בתווך חיונית בשלב זה, מכיוון שהאיברים נגועים מאוד בחיידקים שעלולים לעכב צמיחה פטרייתית. ודא אם אנטיביוטיקה עשויה להיות מחוממת במהלך autoclaving; יש להוסיף אנטיביוטיקה מסוימת לאחר קירור המדיום לסביבות 36 מעלות צלזיוס (לפני הכנסתו לכלים).
   3. מיד לאחר פירוק שטחי של הדגימות ועדיין בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, במחשבי כף יד, יש לחסן כמה טיפות של המים המזוקקים מהמיכל האחרון ששימש לשטיפת הדגימות. שלב זה חשוב כדי להעריך את היעילות של disinfestation שטחי של דגימות.
   4. בצלחת אוטוקלאבית ריקה, מניחים את הדגימות ומשתמשים באזמל להבה ומלקחיים כדי לחלק את הדגימות לעובי של כ-0.2 ס"מ.
   5. דגימות גליליות חתוכות לאורכן בשני חצאים אם רוצים להגביר את המשטח במגע עם המדיום. כדי לחשוף טוב יותר פירות ואיברים כדוריים אחרים, קוצצים או פורסים את המבנים ביסודיות. הזרעים יכולים להיות גם מקורות פטרייתיים חשובים, לכן יש לוודא שהפרי המקוטע חושף אותם למדיום.
      הערה: רק איברים בריאים, ללא נזק לרקמות או אותות של מחלות אפשריות או זיהומים פתוגניים, צריכים לשמש לבידוד אנדופיטים פטרייתיים.
   6. לפזר חמישה שברים של איברים תת קרקעיים בצלחות פטרי עם PDA + אנטיביוטיקה. ודאו שהשברים רחוקים זה מזה ככל האפשר, וגם אינם נוגעים בשולי המנה. אין לסדר שברים כלשהם בתווך. הכינו עותקים משוכפלים של כל איבר מותקן, כאמצעי זהירות במקרה של זיהום.
   7. אוטמים את צלחות הפטרי בסרט נצמד ומאחסנים אותם בחושך ב 25-27 מעלות צלזיוס (רצוי באינקובטור) למשך 5 ימים.
3. חשבון תדירות בידוד (IF)¹¹
   1. לאחר 5 ימים של דגירה של שברי איברים, חשב את IF, על פי מספר השברים המודגרים המציגים מושבות פטרייתיות הגדלות חלקי סך כל השברים המודגרים, כפי שמיוצג במשוואה הבאה:
      
4. טיהור של מבודדים פטרייתיים על ידי striating ו subculturing
   הערה: כל שלב המפורט בשלב 2.4 חייב להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית.
   1. הכינו צלחות פטרי (בקוטר 5 ס"מ) עם אגר-אגר 5-7 גרם לליטר (AA; אגר בקטריולוגי בלבד). שמור את הכלים במשך 24 שעות ב 36 ° C כדי לחסל אלה מזוהמים.
   2. זהה כל מושבה פטרייתית גדלה עם קוד ותחם את שוליה בצד התחתון של המנה (ניתן לעשות זאת עם סמן קבוע). הבדיל בין המושבות לפי צבע, תבנית צמיחה, מרקם ותבנית שוליים.
   3. בעזרת קיסם עץ אוטוקלאבי, בעזרת הקצה הדק, מחזירים כמות זעירה של תפטיר ממושבת פטריות. יש להתרכז בשולי המושבה ולבחור אזור רחוק ככל האפשר ממושבה אחרת, תוך הימנעות מהתאוששות של יותר מסוג מושבה אחד בבת אחת.
   4. באמצעות אותו קיסם עם תפטיר בקצה, למתוח את AA לייצר שלושה striae (חריצים). מוודאים שכל סטריה נמצאת במרחק של 1 ס"מ מהשנייה ומקצוות המנה. כתוב את הקוד המתאים (באמצעות נייר מדבקה ועיפרון), אטם את הכלים ושמור אותם מודגרים בחושך ב 25-27 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.
   5. הכינו צלחות פטרי (בקוטר 8 ס"מ) עם מחשב כף יד 39 גרם/ליטר. אין צורך להוסיף אנטיביוטיקה בשלב זה.
   6. לאחר הדגירה על צלחות ה-AA, התבוננו בהן בקפדנות כנגד האור (מנורה או חלון), במטרה לזהות קורים עדינים היוצרים מושבות בודדות. תחמו את שטחה של מושבה בודדת בכל מנה, באמצעות סמן קבוע בצד התחתון של צלחת הפטרי.
   7. במכסה מנוע זרימה למינרית, השתמשו בקיסם אוטוקלאבי כדי לחתוך חלק מהתווך המכיל את המושבה והעבירו את נפח החיתוך למרכז צלחת מחשב כף יד חדשה.
   8. זהה את צלחות פטרי עם הקודים של המבודדים, אטם את הכלים עם סרט נצמד, ולשמור אותם בחושך ב 25-27 מעלות צלזיוס במשך 7-14 ימים.

3. שימור של מבודדי פטריות מטוהרים

הערה: כל חומר, תמיסה וריאגנט המשמשים בסעיף זה חייבים להיות סטריליים. אלה שלא ניתן לרכוש כבר מעוקר צריך להיות autoclaved ב 121 ° C במשך 20 דקות.

1. שימור בשיטת קסטלני או בשמן מינרלי (3-6 חודשים)^11,15
   1. הכינו 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה עם 0.5 מ"ל מים מזוקקים או המכילים 0.5 מ"ל שמן מינרלי (בהתאם לשיטה שנבחרה). ודא שהצינורות ריקים אוטומטית, והמים והשמן האוטוקלאביים מתווספים לצינורות בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית.
   2. במכסה מנוע זרימה למינרית, הניחו את צלחות הפטרי עם מבודדים מטוהרים שכבר גדלו במחשבי כף יד (39 גרם לליטר) למשך 7-14 ימים. בעזרת קיסם אוטוקלאבי, חותכים קוביות קטנות (0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ באזור העליון) של תווך המכיל את שולי התפטיר.
   3. מניחים ארבע עד שש קוביות בצינורות מיקרוצנטריפוגות עם מים מזוקקים (השיטה של קסטלני) או שמן מינרלי. אחסנו את הצינורות בחושך, בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך זמן רב ככל שיידרש, תוך התבוננות במגבלות הזמן של השיטה.
      הערה: הימנע מהוספת יותר מדי קוביות לצינורות והפיכתן למלאות, מה שעלול להגדיל את סיכויי הזיהום. ניתן לשמור על צינורות בקירור, אשר עשוי להעדיף שימור של כמה מבודדים במשך זמן רב יותר. Currah et ^al.16 ממליצים לאחסן שכפולים של פטריות מיקוריזה מבודדות מסחלבים טרופיים הן בקירור והן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, מכיוון שהן עלולות ללכת לאיבוד כאשר הן נמצאות באחסון קר.
   4. החזירו קובואיד והניחו אותו במרכז צלחת מחשב כף יד חדשה כדי לגדל מבודד מאוחסן.
2. שימור בהקפאה בגרגרי אורז ללא קליפה (>שנה אחת)¹⁷
   1. שוטפים גרגרי אורז לא קלופים במים זורמים ומבשלים אותם עד שקליפת האורז מתחילה להיפתח. מפזרים את הגרגרים המבושלים במבחנות זכוכית עם מכסה בורג ו autoclave פעמיים עם מרווח של 24 שעות ביניהם.
   2. במכסה מנוע זרימה למינרית, הניחו את צלחות הפטרי עם מבודדים מטוהרים שכבר גדלו במחשבי כף יד (39 גרם לליטר) למשך 7-14 ימים. בעזרת קיסם אוטוקלאבי, מחזירים חמישה שברי קורים קטנים משולי התפטיר ומחסנים אותם בצינור המכיל גרגרי אורז אוטוקלאביים.
      הערה: חיסון קורים בנקודות ובעומקים שונים של הצינור מבטיח שהמבודד יישב את גרגרי האורז הלא קלופים בפחות זמן.
   3. לדגור את הצינורות בחושך ב 25-27 מעלות צלזיוס במשך 14 ימים. להסעיר את הצינורות על ידי מערבול אותם כל 3 ימים כדי לשמור על גרגרים בודדים.
   4. לאחר התבוננות בגידול פטרייתי בגרגרי האורז, פזרו את הגרגרים בצלחת פטרי אוטוקלאבית מרופדת בנייר פילטר כדי לספוג לחות, על הנייר כדי שהגרגרים יוכלו להתייבש. יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 25-27 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
   5. הכינו צינוריות קריו-צינור עם 1/3 ג'ל סיליקה בתחתית ו-1/3 צמר זכוכית מעל הסיליקה. לבסוף, להפיץ 1/3 של גרגרי אורז עם תפטיר פטרייתי גדל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך 24 שעות.
   6. לאחר 24 שעות, לאחסן את cryotubes ב -80 °C כל עוד יש צורך, התבוננות במגבלות הזמן של השיטה.
3. שימור בהקפאה בוורמיקוליט באמצעות cryoprotectant (>1 שנה)¹⁸
   1. הכינו תרבית נוזלית המורכבת מ-0.2% תמצית שמרים ו-2% גלוקוז במים מזוקקים. התאם את ה- pH ל -5 ובצע autoclave אותו.
   2. להפיץ 0.2 גרם של ורמיקוליט (להשתמש גרנולומטריה עדינה) cryotubes עם מכסה בורג autoclave אותם. הוסף 0.8 מ"ל של מדיום נוזלי autoclaved cryotubes המכילים vermiculite.
   3. במכסה מנוע זרימה למינרית, הניחו את צלחות הפטרי עם מבודדים מטוהרים שכבר גדלו במחשבי כף יד (39 גרם לליטר) למשך 7-14 ימים. בעזרת קיסם אוטוקלאבי מחזירים שלושה עד חמישה שברי קורים משולי התפטיר ומחסנים לאורך הצינור המכיל ורמיקוליט + מדיום תרבית נוזלית. זכור לזהות את ה- cryotubes עם קוד הבידוד המתאים.
      הערה: חיסון קורים בנקודות ובעומקים שונים של צינור ההקפאה מבטיח שהמבודד יישב את הוורמיקוליט בפחות זמן.
   4. לאחסן את cryotubes בחושך ב 25-27 ° C עד קולוניזציה של רוב גרגרי vermiculite ניתן לצפות, אשר בדרך כלל לוקח בערך 14 ימים.
   5. הכינו תמיסה קריופרוטקטורית המורכבת מ-5% גליצרול ו-5% טרהלוז במים מזוקקים ובצעו אוטוקלאב. תנו לתמיסה להתקרר לפני השימוש בה.
   6. לאחר vermiculite ב cryotubes הוא מושבת על ידי מבודד פטרייתי בהתאמה, להפיץ 0.4 מ"ל של cryoprotectant בכל צינור ולשמור את cryotubes בקירור ב 4 ° C במשך 48 שעות. לאחר מכן, שמור על ה- cryotubes ב -80 °C כל עוד יש צורך, תוך התבוננות במגבלות הזמן של השיטה.

4. אפיון מקרומורפולוגי של פטריות נימה (מורפולוגיה של מושבה)

1. שמור רישום צילום של התפטיר גדל בכל צלחת פטרי עם 39 גרם / ליטר מחשב כף יד במשך 7-14 ימים. זכור לרשום את שני צידי המושבה, העליון והתחתון (הפוך). אם הכלים הולכים לשמש בקלות בסעיף 6 או לא מתוחזקים, לפתוח את הכלים בעת צילום אותם כדי לקבל תמונות טובות יותר.
2. אם מעוניינים בנתונים כמותיים על מורפולוגיה של מושבות, תת-תרבות משכפלת את המבודדים ומתחזקת אותם באותם תנאי גידול ולתקופה קבועה כדי לרשום את קוטר המושבה ולחשב את קצב הגידול (בדרך כלל במ"מ/שעה).
   הערה: ניתן להשיג תוצאות כמותיות מתוחכמות יותר על ידי שימוש בסוגים שונים של אמצעי תרבות להשוואה¹⁹ ועל ידי התחשבות בכלי הסטטיסטיקה לטיפול בנתונים.
3. התבוננו במושבות גם תחת סטריאומיקרוסקופ כדי לזהות מאפיינים מורפולוגיים ולצלם בהגדלה. להעריך את המושבות על פי המאפיינים המקרומורפולוגיים שלהן, כמפורט בסעיף התוצאות. עיין במקורות ביבליוגרפיים מגוונים כדי לעזור לסווג ולקשר את המקרומורפולוגיה לזיהוי מולקולרי ו / או מורפולוגי.

5. אפיון מיקרומורפולוגי של פטריות נימה (מורפולוגיה היפאלית)

הערה: הטכניקות המיקרומורפולוגיות מושוות בחלק הדיון, בהתחשב בשימושים ובחסרונות האפשריים שלהן.

1. גדלו את המבודדים על צלחות פטרי עם מחשב כף יד של 39 גרם לליטר למשך 7-14 ימים. להערכת פטריות מיקוריזה משוערות של סחלבים, גדלו את המבודדים על אגר קמח תירס 17 גרם / ליטר (CMA; או מדיום מגביל תזונתי אחר) במשך 3-7 ימים¹⁹.
2. להקניט הר
   1. עבודה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. הניחו טיפה של כתם שנבחר (שלב 5.5) על מגלשת זכוכית נקייה.
   2. בעזרת קיסם אוטוקלאבי או חומר סטרילי אחר, הסירו בזהירות מעט קורים מהמבודד הגדל והניחו אותם בטיפת הכתם. הניחו מכסה (רצוי בזווית התחלתית של 45° כדי למנוע בועות אוויר) ונתחו תחת מיקרוסקופ אור.
3. תושבת סרט הדבקה
   הערה: טכניקה זו מיושמת בדרך כלל בתרביות פטרייתיות לשימוש קל בסעיף 6 או לא מתוחזק, שכן סרט הדבקה לא יכול להיות autoclaved, זיהומים עלולים להתרחש לאחר ביצוע השיטה.
   1. הניחו טיפה של כתם שנבחר (שלב 5.5) על מגלשת זכוכית נקייה. חותכים רצועה של סרט הדבקה שקוף בגודל שמתאים למגלשת הזכוכית והכתם המרכזי נופל היטב.
   2. כוונו את המשטח הדביק של הרצועה למשטח התפטיר. אל תלחץ, ונסה לאסוף כמה hyphae מבלי להדביק יותר מדי מהם.
   3. הדביקו את הסרט למגלשת הזכוכית, וודאו שהכתם בא במגע עם הקורים שנאספו. מניחים טיפת מים מעל הסרט ומניחים כיסוי. נתח את השקף תחת מיקרוסקופ אור.
4. תרבית שקופיות של פטריות נימה²⁰
   1. בתוך צלחת פטרי גדולה (בקוטר >9 ס"מ, רצוי), מקמים: נייר סינון בחלקו התחתון, מוט זכוכית בצורת U או אדפטציה (המטרה היא לספק הגבהה למגלשת הזכוכית), מגלשת זכוכית אחת ושתי כיסויים. מנות פטרי גבוהות יותר מקלות על המניפולציה. רכבו את הערכות האלה של צלחות פטרי, אחת לכל מבודד.
   2. הכינו נפח קטן של 39 גרם / ליטר PDA או 17 גרם / ליטר CMA, להוסיף 10 גרם / ליטר אגר בקטריולוגי, ו autoclave (נפח צלחת פטרי אחת מספיק עבור יותר מ 30 מבודדים). אמצעי התרבות המשמשים בתרבות השקופיות חייבים להיות קשים יותר מהמדיה הרגילה. Autoclave 100 מ"ל של מים מזוקקים.
   3. עבודה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. מניחים את המדיום הנוזלי בצלחת פטרי, ויוצרים שכבה בגובה של כ-0.5 ס"מ. תנו למדיום להתמצק. לאחר מוצק, להשתמש אזמל סטרילי לחתוך ריבועים של המדיום כי הם 1 ס"מ x 1 ס"מ בגודל.
   4. פתחו את ערכת צלחת הפטרי בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית והשתמשו במלקחיים בוערים כדי לארגן את החומר האוטומטי בתוך המנה. סדרו את החומר בסדר ממוספר, כפי שניתן לראות באיור 2A, והניחו ריבוע של מדיום תרבות על שקופית הזכוכית. לפני הנחת הכיסוי מעל המדיום, המשך לשלב 5.4.5.
   5. השתמש קיסם autoclaved כדי לשחזר קצת hyphae מבודד בזהירות לשפשף את ארבעת הפנים הצדיים של המדיום מונח על מגלשת זכוכית. הניחו כיסוי אוטומטי על הריבוע הבינוני באמצעות מלקחיים בוערים.
   6. השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי להניח מים autoclaved בנייר סינון, כדי ליצור תא לח. השתמש בנפח כדי להרוות את הנייר מבלי להניח מים עודפים. אטמו את צלחת הפטרי בסרט נצמד וזהו אותה עם קוד הבידוד המתאים. שמור על הכלים בחושך ב 25-27 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים.
   7. העריכו את צמיחת הקורים במגלשת הזכוכית ובכיסוי. מכל ערכת תרבות שקופיות מופקות שתי שקופיות, האחת באמצעות מגלשת הזכוכית עם hyphae ו-autoclaved coverslip, השנייה באמצעות ה-coverslip עם hyphae ושקופית זכוכית נוספת.
   8. לאחר שנצפתה גדילה של היפה, נתקו בזהירות את ריבוע התווך משקופית הזכוכית (איור 2B), הרכיבו את שתי השקופיות באמצעות כתם שנבחר (שלב 5.5), ונתחו תחת מיקרוסקופ אור. זכור לזהות את קוד הבידוד בשקופית. כדי לייצר שקופיות חצי קבועות, אטמו את הכיסוי בלק שקוף.
   9. כדי לייצר שקופיות קבועות, שטפו בזהירות את הצבע מקורים שהודבקו לאחר הצביעה ותנו למגלשה להתייבש. הר עם אמצעי הרכבה מהיר (לפרטים, קרא את Pena-Passos et ^al.10).
      הערה: החיסרון של ייצור שקופית קבועה בטכניקה זו הוא שניתן לשטוף נבגים ומבנים שאינם דבוקים לזכוכית.
5. שיטות צביעה ותצפית קורים
   1. לקטופנול כותנה כחולה (LPCB)21: הוסף 20 מ"ל חומצה לקטית, 40 מ"ל גליצרול ^ו-20 מ"ל מים מזוקקים. יש להמיס 20 גרם גבישי פנול בתמיסה זו על ידי חימום עדין. להמיס 0.05 גרם של כחול מתיל (כותנה כחולה, או 2 מ"ל של תמיסה מימית 1%). LPCB ניתן גם לרכוש בקלות כבר מוכן.
      זהירות: פנול רעיל מאוד ונדיף; לתפעל אותו אך ורק בתוך מכסה מנוע מנדף וללבוש כפפות.
   2. Toluidine כחול O¹⁰(TBO): להכין 0.05% TBO ב 0.1 M פוספט חיץ (pH 6.8).
   3. קונגו אדום^22,23,24: הכינו תמיסה של 1% קונגו אדום במים מזוקקים וסננו אותה. דוגרים במשך 5-10 דקות. צבע זה יכול להיות מיושם גם עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי²⁵.
   4. בעת התבוננות וצילום קורים פטרייתיים תחת מיקרוסקופ אור, יש להיוועץ במקורות ביבליוגרפיים מגוונים כדי לסייע בזיהוי מבנים (בדוק את הדיון).

איור 2: נהלים לתרבית שקופיות של פטריות נימה . (A) תצורה סכמטית של ערכת תרבית שקופיות, כאשר המספרים מציינים את סדר סידור האלמנטים. (B) ניתוק הריבוע של מדיום התרבית לאחר שנצפתה צמיחה היפלית במגלשת הזכוכית ובכיסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. מיצוי DNA כולל מבודדי פטריות (פרוטוקול תוצרת בית²⁶ עם שינויים ²⁷)

הערה: כל חומר, תמיסה וריאגנט המשמשים בסעיף זה חייבים להיות סטריליים. אלה שלא ניתן לרכוש כבר מעוקר צריך להיות autoclaved ב 121 ° C במשך 20 דקות. יש ללבוש כפפות במהלך כל הפרוטוקול ולבצע כמה שלבים בתוך מכסה מנוע.

1. הכינו את מאגר המיצוי: 1% נתרן דודציל סולפט (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8.0) ו-25 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA). גדל את המבודדים המטוהרים במחשבי כף יד של 39 גרם/ליטר למשך 7-14 ימים.
2. בזהירות לגרד את התפטיר מבודד באמצעות מרית או כף ולהעביר את השברים לטיט autoclaved, הימנעות העברת המדיום תרבית עם אגרגטים hyphae. בעזרת חרסינה טוחנים את התפטיר בחנקן נוזלי לאבקה דקה. אל תתנו לתפטיר הטחון להמיס, והוסיפו חנקן כדי להימנע מכך.
3. הוסף 1 מ"ל של חיץ מיצוי בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ומקם את דגימת הקרקע עד לסימן 1.5 מ"ל. בעדינות להתסיס את התוכן של צינורות הומוגניזציה.
4. עצבו את הצינורות במערבולת במשך 5 שניות והניחו אותם בתרמובלוק בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בזהירות הומוגני התוכן על ידי היפוך כל 7-10 דקות.
5. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים 800 μL מהשלב העליון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מ"ל, מוסיפים 800 μL פנול לצינורות, ומערבבים את התוכן בהיפוך.
   זהירות: פנול הוא מגיב רעיל ונדיף ביותר; זה יכול לגרום אריתמה, נמק, נמק רקמות. כאשר נשאף, זה יכול לגרום קוצר נשימה ושיעול. הספיגה המערכתית עלולה לפגוע בכבד, בכליות ובמערכת העצבים המרכזית. יש לתפעל פנול אך ורק בתוך מכסה מנוע מנדף וללבוש כפפות.
   הערה: מהשלב הבא ואילך, השתמש בכפפות ונהל את הפרוטוקול בתוך מכסה אדים.
6. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר 800 μL מהשלב העליון לצינור חדש 2 מ"ל, בזהירות למנוע העברה של תוכן השלב הנחות.
7. הוסף 400 μL של פנול ו 400 μL של כלורופורם לצינורות ולערבב את התוכן על ידי היפוך. צנטריפוגר אותם ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   זהירות: כלורופורם הוא מגיב רעיל ונדיף ביותר; זה יכול לגרום לגירוי ופציעות כאשר באים במגע עם העור, ואם נשאף, משפיע על מערכת העצבים המרכזית ומערכת הלב וכלי הדם, הכבד והכליות. יש לתפעל כלורופורם אך ורק בתוך מכסה מנוע מנדף וללבוש כפפות.
8. יש להחזיר 800 μL או פחות מהשלב העליון לצינור חדש של 2 מ"ל. מוסיפים 800 מיקרוליטר כלורופורם, מערבבים את התוכן בהיפוך וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
   הערה: בשלב זה, אין להעביר שאריות מהשלב התחתון לצינורות חדשים. לכן, היזהר במיוחד בעת התאוששות השלב העליון.
9. העבר 600-800 μL מהשלב העליון לצינור חדש של 1.5 מ"ל והוסף 450 μL של איזופרופנול. מערבבים את התוכן בהיפוך ודגרים ב-25°C למשך 5 דקות.
10. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant באמצעות micropipette. היזהר לא להשליך את הגלולה שהונחה בתחתית הצינור.
11. הוסף 500 μL של 80% אתנול וצנטריפוגה למשך 5 דקות. יש לחזור על הפעולה פעמיים במקרה שהגלולה אינה מובהרת.
12. מוציאים את האתנול באמצעות מיקרופיפטה ומייבשים את הגלולה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות. מוסיפים 30-50 μL של מים deionized, פולט את הגלולה באמצעות micropipette.
13. שמור על הצינורות ב -4 ° C במשך הלילה עבור eution DNA מלא ולהקפיא את התוכן ב -20 ° C.

7. מיצוי DNA כולל מאיברי צמחים למתודולוגיית metabarcoding (ערכה מסחרית)

הערה: לצורך המתודולוגיה הבאה, יש לרכוש את הערכה המסחרית המצוינת בטבלת החומרים כערכת מיצוי DNA של הקרקע. כל חומר, תמיסה וריאגנט המשמשים בסעיף זה חייבים להיות סטריליים. אלה שלא ניתן לרכוש כבר מעוקר צריך להיות autoclaved ב 121 ° C במשך 20 דקות. מומלץ מאוד ללבוש כפפות במהלך כל הפרוטוקול, ואת השלבים ניתן לבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. הפרוטוקול המתואר שונה מ- De Souza et ^al.12, מהפרוטוקול המפורט על ידי היצרן.

1. בעזרת חומרי חרסינה וטיט, טוחנים את השורשים שנאספו לאחר שלב 1.2 בחנקן נוזלי, ומפחיתים את הדגימות לאבקה דקה. הוסף 0.3 גרם מדגימות הקרקע לצינורות PowerBead והתסיס בעדינות להומוגניזציה.
2. הוסף 60 μL של תמיסה C1 (כלולה בערכה) לצינורות PowerBead וערבב את התוכן בהיפוך. באמצעות הומוגנייזר רקמות וליזר תאים (טבלה של חומרים), לקשור את הצינורות בחוזקה לתמיכה נאותה, להתאים את התמיכה למערבולת, ולהפעיל את הציוד במהירות מקסימלית במשך 10-20 דקות.
   הערה: במקרה שתמיסת C1 מואצת, חממו אותה ב-60°C עד להמסה מלאה.
3. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 25 ° C. העברת 500 μL של supernatant ל 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. התוכן המועבר עשוי להיות חלקיקי.
4. הוסף 250 μL של תמיסה C2 לצינורות ולהתסיס במערבולת במשך 5 שניות. יש לדגור ב-4°C למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 1-2 דקות ב-25°C.
5. להעביר יותר מ 600 μL של supernatant צינורות חדשים 2 מ"ל, הימנעות גלולה. הוסף 200 μL של תמיסה C3 ולהתסיס על מערבולת במשך 5 שניות.
6. יש לדגור ב-4°C למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך דקה אחת ב-25°C. בשלב זה, ודא שהסופרנאטנט אינו חלקיקי.
7. מעבירים יותר מ-750 מיקרוליטר של הסופרנאטנט לצינורות חדשים של 2 מ"ל, תוך הימנעות מהכדור. הומוגניזציה של התמיסה C4 היטב, להוסיף 1,100 μL של תמיסה C4 לסופרנטנט, ולהתסיס במערבולת במשך 5 שניות.
8. טען 675 μL מתכולת הצינורות בעמודות הספין של MB, מעל המסנן, וצנטריפוגה ב- 10,000 x גרם למשך דקה אחת ב- 25 ° C. יש להשליך את תכולת הנוזלים.
9. חזור על השלב הקודם פעמיים עד שכל התוכן של כל צינור מעובד. לאחר מכן, הוסף 500 μL של תמיסה C5 במרכז המסנן הנוכחי בעמוד העליון של הצינור וצנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 25 ° C.
10. יש להשליך שוב את תכולת הנוזלים והצנטריפוגה באותם תנאים כמו השלב הקודם. העבר בזהירות את העמודה העליונה של עמודת הספין MB לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים של 2 מ"ל, תוך הימנעות מטפטוף תוכן נוזלי כלשהו בעמודה.
11. הוסף 85-100 μL של תמיסה C6 למרכז המסנן והמתן 1 דקה. צנטריפוגה ב- 10,000 x גרם למשך 30 שניות ב- 25 ° C ומחק את עמודת הספין של MB. אחסנו את הצינורות בטמפרטורה של -80°C.

8. כימות DNA בספקטרופוטומטר (בדוק את טבלת החומרים)

1. באמצעות הספקטרופוטומטר שצוין, פתח את התוכנה. בחר באפשרות חומצת גרעין, בחר באפשרות DNA והגדר את הריכוז ל - ng/μL.
2. הוסף 1 μL של מים שעברו דה-יוניזציה לגלאי הספקטרופוטומטר וכייל על-ידי בחירה באפשרות ריק. לאחר הקריאה, נגב בעדינות את הגלאי בנייר טישו רך.
3. תן שם לדוגמת השדה עם קוד הבידוד של הדגימה שיש לקרוא ומקם 1 μL ממנה בגלאי הציוד. בחר באפשרות מדידה; נוצר גרף וטבלה עם התוצאות.
4. חזור על שלב 8.3 עד שכל הדגימות ייקראו. מומלץ לשמור את הטבלה עם התוצאות שנוצרו עבור רשומה וניתוח: בחר באפשרות דוחות ואת המיקום שבו הקובץ .xml יישמר.
5. הוסף 5 μL של מים deionized לגלאי, לחכות כמה דקות, לנגב אותו בעדינות עם נייר טישו רך.

בפרוטוקול הבידוד, בהתחשב בכך שיש זיהום מהמים ששימשו בשטיפה האחרונה והזיהום מזוהה גם בצלחות פטרי עם שברים מחוסנים, ניתן לנקוט פעולות שונות, בהתאם לסוג המזהם (טבלה 1). יש לחזור על הליך זה מההתחלה במקרה של מזהמים פטרייתיים נבגים מאוד, המציגים גם צמיחה מואצת, וחיידקים מתרבים אינטנסיביים, עמידים בפני האנטיביוטיקה שנבחרה. במקום זאת, אם המזהם הפטרייתי מציג צמיחה איטית או אינו נבג, ניתן פשוט להימנע מבידוד בשלבים הבאים של הפרוטוקול. לבסוף, זיהומים עם זנים חיידקיים המתרבים לאט ניתן גם להימנע בקלות בשלבים האחוריים, במיוחד בטיהור, בעת התאוששות hyphae.

בכל המקרים שהוצגו בעבר, התרחיש האידיאלי הוא ביצוע מחדש של הליך ההדחה באמצעות דגימות אחרות והתקנת שברי הצמח במדיום תרבית המשלב אנטיביוטיקה אחרת, עם קשת רחבה יותר של פעולות, במקרים של חיידקים עמידים המזהמים את הכלים הראשונים. עם זאת, בהתחשב בקשיים הכרוכים באיסוף דגימות חדשות ובהשגת איברים מצמחים מיקוהטרוטרופיים, מקרים מסוימים עשויים להיפתר בהצלחה בשלבים האחוריים של הפרוטוקול, כפי שמוצג בטבלה 1.

טבלה 1: תיאור המזהמים האפשריים בתהליך בידוד פטריות אנדופיטיות, השלכות זיהום והליכי מיתון.

לאחר 5 ימים מהתקנת שברי איברים בתווך מחשב כף היד, אפשר לדמיין צמיחה של קבוצות קטנות של תפטיר פטריות נימה, היוצאות מפנים השברים (איור 3). כל מורפוטיפ תפטיר אמור לגרום לבידוד פטרייתי עד סוף פרוטוקול הבידוד, בהתחשב בכך שכל אחד מהם חייב להיות מפוספס בצלחת פטרי חדשה עם מדיום AA לטיהור. מומלץ לא להשליך את הכלים המקוריים ממתקן השבר לפני השלמת פרוטוקול הבידוד כולו. ניתן לשמור אותם בקירור ב -4 מעלות צלזיוס עד לקבלת המושבות המטוהרות. כמו כן, לגבי חלק זה של הפרוטוקול, ניתוח IF יכול להיות מועיל מאוד בהערכת אחוז דגימות הרקמה הגורמות לפטריות מבודדות מסך הדגימות המותקנות.

איור 3: שברי שורשים לבידוד פטרייתי באגר דקסטרוז תפוחי אדמה. פטריות אנדופיטיות הגדלות משברי שורש של סחלב מיקוהטרוטרופי לאחר כ-5 ימי דגירה. כל צלחת פטרי (A, B ו-C) מכילה חמישה שברי שורשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר 3 ימים לאחר הדגירה של צלחות AA לטיהור מבודד, מושבות היפליות זעירות, כמעט בלתי מורגשות, היו אמורות לצמוח מהסטריה בתווך AA. בשלב זה, במקרה שהיה זיהום כלשהו מחיידקים הגדלים לאט בצלחות הבידוד, ייתכן כי חיידקים אלה הועברו גם לצלחות AA עם קורי האנדופיטים הפטרייתיים שנבחרו. אם כן, החיידקים יוגבלו לאזורי סטריה, עם צמיחה מועטה בהשוואה לפטרייה, מה שיאפשר התאוששות של הפטרייה המעניינת אך ורק את מנות מחשב כף היד החדשות.

במהלך 7-14 ימים של חיסון מבודד פטרייתי מטוהר בצלחות PDA, המושבה הטהורה חייבת לגדול באופן צנטריפוגלי (ממרכז התבשיל לשוליה), וליצור תפטיר עגול יחיד (איור 4). בשלב זה קל לזהות זיהומים אפשריים, שכן הם פוגעים במידה ניכרת בהומוגניות המושבה בכל הנוגע לגידולה, צורתה, היבטה, צבעה, ייצור הפיגמנטים בתווך וכו' (איור 5). בהנחה שהמושבות הסופיות המתקבלות אינן טהורות, יש להגיש שוב את הפטריות שגדלו בתחילה משברי האיברים להליכי טיהור, על ידי חתירה ותרבית משנה (שלב 2.4). ניתן לשחזר את המבודדים מהאיברים שהותקנו בתחילה או ממנות הבידוד הסופיות המכילות תרביות הטרוגניות.

איור 4: ייצוג של מבודדים פטרייתיים מטוהרים, שגודלו במשך 7-14 יום בתרבית מחשב כף יד. בטור הראשון והשלישי (A, C, E, G, I ו-K) נראות המושבות הרשומות מהצד העליון; הטור השני והרביעי (B, D, F, H, J ו-L) מציגים את אותן מושבות, בהתאמה הנראות מהצד התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ייצוג של מבודדים פטרייתיים לא טהורים, שגודלו במשך 7-14 ימים בתרבית מחשבי כף יד. בטור הראשון (A, D ו-G) ניתן לראות מבט כללי על המושבות מהצד העליון; העמודה השנייה (B, E ו-F) מציגה בפירוט את המושבות; הטור השלישי (C, F ו-I) מציג את המושבות מהצד התחתון. המספרים מייצגים מורפוטיפים פטרייתיים שונים הקיימים בכל מנה, והקווים מייצגים תיחום עדין בין המבודדים הפטרייתיים השונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שימור המבודדים לא צריך להיעשות בשיטת אחסון אחת ויחידה, שכן כל פטרייה עשויה להציג רגישות פחות או יותר לכל שיטה שתוארה. מומלץ מאוד לבחור לפחות שני סוגי אחסון לכל מבודד פטרייתי, מה שמבטיח סיכויי הצלחה רבים יותר בשימורו. אנו מדגישים כי חוסר הכדאיות של פטריות שנשמר קסטלני או שמן מינרלי צפוי לאחר 6 חודשים או פחות. חוקרים צריכים לשקול אם אלה הן שיטות השימור היחידות שנבחרו, כדי למנוע אובדן בלתי צפוי אפשרי של מבודדים. כדי להאריך תקופה מוגבלת זו, ניתן להפעיל מחדש את המבודדים הפטרייתיים על ידי גידולם בתווך PDA (39 גרם / ליטר) למשך 2-3 שבועות ולאחר מכן לאחסן אותם שוב. לאחר תקופת אחסון, צפוי שהמבודדים יציגו צמיחה איטית יותר, בהשוואה לקצב הגידול שנצפה לפני שימורו, ומושבות עם היבטים פחות נמרצים (כלומר, פחות צפופים, שונים בצבעם). די בגידול משנה כמה פעמים במדיום תרבותי עשיר בחומרים מזינים כדי לבסס מחדש מאפיינים כאלה.

בעת הערכת המקרומורפולוגיה של המושבות המתקבלות בהליך הבידוד, יש לאסוף נתונים איכותיים, בהתחשב במאפיינים רבים ככל האפשר: (א) צבע המושבה (למעלה ולמטה), אשר ניתן לנתח באמצעות מדריכי צבע מודפסים (למשל, ריינר²⁸, קורנרופ וונשר²⁹, רידג'וויי³⁰); (ב) אטימות המושבה: שקופה, אטומה, שקופה; (ג) פיגמנטים מפוזרים בתווך³¹ (נוכחות/היעדר וצבע); (ד) מפריש³¹ (נוכחות/היעדרות, צבע, מראה כללי); (ה) מבנים מקרוסקופיים³¹ (נוכחות/היעדר, סוג ומראה; למשל, סקלרוטיה, פיקנידיה); (ו) תפטיר אווירי ושקוע 19,32,21 (נוכחות/היעדרות^, מראה מועט או שופע); (ז) מראה שוליים¹⁹ (צבע, צורה, אחידות - שקוע או אווירי); ו-(ח) טופוגרפיית המושבה (גדושה, מקומטת, מכתש, שטוחה וכו'), המראה והמרקם הכללי - כותנה, קטיפתית, אבקתית, צמרירית, חלבית (שעווה), זוהרת, גירית, רזה, עורית, עוקצנית וכו'.^19,21.

איור 6: מאקרו ומיקרומורפולוגיה של פטרייה לא מזוהה שבודדה מהסחלב המיקוהטרוטרופי Wullschlaegelia aphylla. (A) היבטים עליונים ו-(B) תחתונים של המושבה, (C) מבט מוגבר על קורי האוויר (כפי שניתן לראות במיקרוסקופ). מיקרומורפולוגיה של ההיפי (D) ללא כתם ומוכתמת ב-(E) LPCB ו-(F) TBO. קיצורים: c = conidiophore, p = phialide, s = מחיצה. פסי קנה מידה: A,B = 2 ס"מ; C = 2 מ"מ; D-F = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

באיור 6 מוצגת מושבה שבודדה משורשי הפיוזיפורם של הסחלב המיקוהטרוטרופי Wullschlaegelia aphylla, תוך יישום המתודולוגיה המתוארת. צבעה של המושבה לבנבן עד אפור בצד העליון (איור 6A) וחום בצדה התחתון (איור 6B). הוא אטום, ללא פיגמנטים מפוזרים בתווך או הפרשה. התפטירים אוויריים ושופעים, השוליים אינם סדירים ואוויריים, ולמושבה מרקם קטיפתי וטופוגרפיה מקומטת (איור 6A). מבנים מקרוסקופיים נעדרים.

שיטת תרבית השקופיות היא מסורתית ובעלת יתרון, ולמרות שהיא גוזלת זמן, ניתן ליישם אותה כדי להפיק שקופיות קבועות שניתן לבחון לאחר מכן. הצבעים השונים המוצגים כאן עשויים לשמש להצגת מבנים חשובים, והם דורשים בדיקות בדגימות, כדי לקבוע את זמן הדגירה המתאים ביותר. קונגו אדום ו-TBO הם כתמים לשימוש כללי. אדום קונגו מספיק כדי להדגים כמה מבנים עדינים (קריאה נוספת: מלוך²²). TBO מכתים את תכולת התא בעוצמה רבה יותר מאשר את דופן התא הפטרייתי (איור 6F). למרות היותו צבע רגיל עבור מבנים צמחיים ולא כל כך נפוץ במיקרוסקופ פטרייתי, TBO יש תכונה מטכרומטית חשובה³³, אשר מעדיף יישומים אחרים, כגון ניתוח פטרייתי ברקמות הצמח¹⁰. LPCB הוא צבע מיושם מאוד באנליזה פטרייתית, אם כי דורש זהירות בגלל פנול. כחול כותנה (שם נרדף: מתיל כחול) הוא הכתם, חומצה לקטית היא חומר ניקוי, ופנול הוא חומר הרג²¹. LPCB יש זיקה chitin ו evinces נבג קירות וקישוטים^23,24. המחיצה הפטרייתית אינה מוכתמת על-ידי LPCB (איור 6E) או TBO (איור 6F), מה שמקל על זיהוי מבנים כאלה. למריחת כתמים יש יתרון כדי להפגין מבנים שלא ניתן לראות בקלות כשקורים אינם מוכתמים (איור 6D).

לצורך מיצוי DNA מפטריות ומדגימות שורש, יש לכבד את כמות דגימת הקרקע בחנקן נוזלי שיש להוסיף למאגר המיצוי, ולא תעלה על הכמות המצוינת בפרוטוקול. עלינו להדגיש כי כמות גדולה של דגימה מעובדת אינה מייצגת רק את השגת ריכוז גבוה של DNA ללא חסרונות גדולים, שכן היא יכולה לסכן במידה ניכרת את איכות ה- DNA הסופי. זה קורה כאשר רוויה את השלבים הבאים של טיהור DNA. חוץ מזה, ריכוז תרכובות פוטנציאליות המיוצרות על ידי צמחים או פטריות (למשל, פיגמנטים, מטבוליטים משניים), הנמצאים בתמיסה הסופית עם DNA, עשוי לפעול להפחתת איכות ה- DNA ו / או לעכב תגובת שרשרת פולימראז (PCR). בעיה נוספת שיכולה להפחית משמעותית את איכות הדנ"א היא גירוד מדיום התרבית לחלוטין עם תפטיר פטרייתי וטחינתו, שיש להימנע ממנה מאוד. ריאגנטים מסוימים מהליך המיצוי (למשל, פנול, אלכוהול אתילי, SDS) וחומרים אחרים (למשל, פיגמנטים פטרייתיים) עשויים להיות מעכבים המפריעים ל- PCR.

בשלבי טיהור הדנ"א, בעת שימוש בפנול ובכלורופורם, הסופרנאטנט חייב תמיד לייצג את הפאזה עם פחות זיהומים, בדרך כלל להבין את השלב הברור ביותר. בשלב כזה, אין להתאושש מהשלב הנחות כאשר שואפים לסופרנאטנט שיועבר לצינורות חדשים. בסוף הפרוטוקול, הגלולה (המורכבת על ידי DNA) צריכה להציג צבע שקוף (רצוי מאוד) עד לבנבן. בשלב הייבוש, המשך ייבוש הדנ"א בתרמובלוק הוא היסוד לאידוי מוחלט של אתנול. לאחר 12 שעות ב 4 ° C, הגלולה היה צריך להיות מדולל לחלוטין בתמיסה מימית הוסיף צינורות, לא להיות גלוי לאחר מכן. במקרה שהאלוציה אינה שלמה, וריכוז הדנ"א נמוך בהרבה מהריכוז האידיאלי, ניתן לשמור את התמיסה בקירור למשך 12 שעות נוספות, ללא הפסדים משמעותיים באיכותה.

ניתוחי הדנ"א בתוכנה יוצרים טבלה, כפי שהיא מיוצגת בטבלה 2, שבה מצוינים נתונים הקשורים לכמות ואיכות הדנ"א. כימות הדנ"א ניתן על ידי ריכוז חומצות הגרעין בננוגרם למיקרוליטר דגימה. בהתחשב בזיהוי המולקולרי של פטריות מבודדות, דגימות DNA צריכות להיות בריכוז של כ-200 ננוגרם/מיקרוליטר, אידיאלי לשלבי PCR. במקרים של דגימות עם ריכוזים גבוהים יותר של חומצות גרעין, יש לדלל aliquot מהדגימה, בקירוב הריכוז לערך שהוזכר קודם לכן. דגימות עם ריכוזים גבוהים מדי, כגון דגימות 1 ו-2 בטבלה 2, עשויות להצביע על גילוי שגוי עקב מזהמים בתמיסה. בינתיים, דגימות עם ריכוזים נמוכים יותר של חומצות גרעין, כגון מספר 7 (טבלה 2), עדיין עשויות לשמש עבור PCR, להיות חשוב ליישם נפח גדול יותר של דגימה בתגובות. באשר לפרמטרי האיכות, משביע רצון כי הציטוטים 260/280 ו-260/230 הם בין 1.8 ל-2.2, כפי שמצוין במדגמים 3, 5 ו-8 (טבלה 2). דגימות המציגות ערכים כאלה (הרבה מתחת או מעל) יש להגיש למיצוי DNA חדש, כפי שמצוין בדגימות 9 ו -10 מטבלה 2. במקרים של דגימות עם כמות מספקת של DNA וחריגה מינימלית מטווח האיכות האידיאלי, כפי שהוצע על ידי הערכים 260/280 ו- 260/230 במספרים 4 ו- 6 (טבלה 2), דילול הוא ההליך המועיל ביותר כדי להפוך את ריכוז חומצת הגרעין למתאים ל- PCR ולדלל מעכבים אפשריים, כגון ריאגנטים שרידי מהליך החילוץ, בדוגמאות.

טבלה 2: תוצאות שנוצרו בתוכנה מדגימות דנ"א פטרייתיות שנותחו בספקטרופוטומטר.

בשונה מדגימות דנ"א מפטריות אנדופיטיות מבודדות, ריכוז הדנ"א בדגימות לניתוח מטא-ברקוד אמור להציג כמויות עצומות של מולקולות דנ"א שחולצו, באיכות גבוהה ובמשקל מולקולרי. הדגימות צריכות להיות מוערכות על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז, השגת שלמות מקסימלית אפשרית, עם מעט או ללא מריחה בג'ל.

ההתפשטות השטחית של דגימות צמחים היא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול המוצג. רצוי מאוד שלא יהיה זיהום בכלי מחשב כף היד עם טיפות מהשטיפה האחרונה. חיידקים נצפים לעתים קרובות כמזהמים בצלחות הבידוד, בדרך כלל יותר מאשר פטריות נבגים הנישאות באוויר, בהתחשב בכך שחיידקים אנדופיטיים נפוצים גם ברקמות צמחים ^3,11. לכן, תוספת של אנטיביוטיקה במדיום התרבות בעת התקנת שברי איברים הוא חיוני. תוצאות טובות יותר מושגות כאשר משלבים סוגים שונים של אנטיביוטיקה, והתוצאה היא ספקטרום רחב יותר של פעולה. שיקול חשוב נוסף הוא ההטיה הפנימית בבידוד הפטריות, שכן שימוש במחשבי כף יד ו-AA בהכרח יבחר מינים מסוימים ויפגע במינים אחרים. השילוב של אמצעי תרבות אחרים עשוי למזער את ההטיה, אם כי לא לבטל מגבלות כאלה⁹.

באופן כללי, פטריות המייצרות נבגים בזמן שהן גדלות בצלחות פטרי מציגות שיעורי הישרדות גבוהים יותר בפרוטוקולי שימור, בין אם בטמפרטורות נמוכות יותר ובין אם לא, ומבודדים שאינם נבגים עשויים שלא לסבול שימור קסטלני או שמן מינרלי^34,35,36, כך ששיטת שימור בהקפאה עשויה להיות חיונית במקרים כאלה. בנוסף, חלק מהמבודדים עשויים להיות רגישים להקפאה, ותוספת של cryoprotectants מסייעת לשימור, כמו בשיטה המוצגת באמצעות vermiculite¹⁸. מאפייני המושבה וההיפאל עשויים להיות שימושיים כדי לקבץ את המבודדים בעלי תכונות דומות, ולהקל על הבחירה לשימושים בטיפולי נביטה סימביוטיים (כמפורט על ידי Pena-Passos et ^al.10). מאפיינים אלה תורמים גם לבחירת שיטות השימור שיש ליישם, במיוחד בהתחשב בנבג או בהיעדרו.

אפיון מורפולוגי של המבודדים גם משפר ומשלים את התיאורים המורפולוגיים הזמינים בספרות המקצועית, במיוחד כאשר הם קשורים לאפיון מולקולרי. למרות היותה אתגר עם מבודדים רבים, אפיון מורפולוגי של פטריות גוזל זמן רב ותלוי בנתונים שפורסמו. גם אם מתוכנן להתבצע רק האפיון המולקולרי, רצוי לנהל רישום צילומי של מראה המושבה (מקרומורפולוגיה) ולפרסמו במידת האפשר, כדי לתרום להליכי זיהוי עתידיים. חשוב גם לשמור על תמונות של הכלים שבהם מותקנים שברים, כדי לאפשר השוואה בין המבודדים הסופיים שהתקבלו לבין המורפוטיפים שנצפו גדלים בצלחות התקנה. במקרה כזה, יש לגדל את הפטריות המושווים באותו סוג של מדיום. מתודולוגיות נוספות נמצאות ב- Currah et ^al.16 להערכת פטריות מיקוריזה נפוצות של סחלבים, כגון תרבית על מדיום חומצה טאנית (TAM) כדי להבדיל בין הסוגים Epulorhiza (teleomorph: Tulasnella) ו - Ceratorhiza (teleomorph: Ceratobasidium), ותרבית על CMA כדי לעורר תאים מונילואידים לאפיון פטריות מקומפלקס Rhizoctonia .

בהתחשב בשיטות המפורטות לצפייה בקורים פטרייתיים תחת מיקרוסקופ אור, תושבת טינט ותושבת סרט הדבקה מהירים יותר מתרבית שקופיות, אם כי שיטת ההקנטות אינה מספקת לניתוח נבגים ומדידת זוויות ענפים. תושבת סרט הדבקה שומרת על ארגון התפטיר טוב יותר מאשר טכניקת הרכבה מקניטה, אם כי שימוש בסרט הדבקה אינו אמין כמו תרבית שקופיות למדידת זוויות הסתעפות (תצפית המחברים). תרבות שקופיות, למרות היותה גוזלת זמן, היא הטכניקה המתאימה ביותר לייצור שקופיות קבועות למחצה וקבועות. מאקרו ומיקרומורפולוגיה מנותחים בהתחשב בספרות. Webster and Weber³² הוא מקור מידע כללי נרחב והפניות נוספות. Currah et ^al.16 ו- Zettler and Corey³⁷ מספקים מידע מועיל על פטריות מיקוריזה של סחלבים. למרות שהם מתארים פטריות בעלות חשיבות רפואית, וולש ועמיתיו 21 ומקגיניס ³¹ עוזרים גם על מאפיינים כלליים של מושבות פטריות נימה, מידע חזותי/תיאורי והפניות נוספות למיקרומורפולוגיה פטרייתית.

על פי Yu et ^al.38, ניתוחי כימות ה- DNA בספקטרופוטומטר מציגים דיוק ודיוק רב, בהיותם עקביים עם ניתוחי PCR כמותיים בזמן אמת. תצפית חשובה היא שחלק מהמבודדים עשויים שלא לספק דגימות דנ"א טהורות מספיק לשלבי הזיהוי המולקולרי הבאים, שכן האנדופיטים הפטרייתיים של מיקוהטרוטרופים מגוונים ביותר, במיוחד אלה הקשורים לצמחים טרופיים³⁹, וכך גם המטבוליטים המיוצרים. ניתן להשתמש בניתוחי ספקטרופוטומטר כדי להעריך מקרים כאלה ופרוטוקולים שונים, או ערכות מסחריות המיושמות לטיהור DNA של הדגימות. השלבים הבאים המוצעים בזיהוי מולקולרי של מבודדים הם הגברה של אזור הספייסר המתעתק הפנימי (ITS) וריצוף. אזור ITS הוא DNA מרווח RNA ריבוזומלי שנעשה בו שימוש נרחב בספרות המקצועית והתקבל רשמית כברקוד הראשי לזיהוי פטרייתי ^9,40. זה יכול להיות מוגבר על ידי PCR עם פריימרים ITS1 ו ITS4⁴¹, ולאחר מכן רצף בפלטפורמת Sanger⁴².

ניתוחי מטא-ברקוד, מלבד התרת חקירת העושר, השפע וההרכב הטקסונומי של מיקרואורגניזמים בדגימות סביבתיות וצמחים, עשויים לספק תוצאות של אינטראקציות חיוביות או שליליות בין מיקרואורגניזמים אלה¹². שלב ההשרייה באמצעות חנקן נוזלי שנוסף לפרוטוקול הסטנדרטי DNeasy PowerSoil נועד לשבור כמה שיותר תאים פטרייתיים ביחס לרקמות הצמח, ולאפשר דגימה טובה יותר של אוכלוסיית הפטריות ברקמה המקרטעת¹¹. בחירות פריימר עבור רצפים פטרייתיים (ברקודים) בזיהוי מולקולרי חייבות לקחת בחשבון את ההפרעה לדנ"א של צמחים. אנו ממליצים להשתמש בפריימרים המגבירים אזורים משתנים של הגן 18S הפטרייתי, לדוגמה, ITS1-5,8S-ITS2⁴³. לאחר קבלת דגימות הדנ"א, השלבים הבאים הם הכנת הספריות המטאגנומיות, התלויות בפלטפורמת הריצוף שנבחרה, ריצוף אחורי של הספריות, וניתוח הנתונים המתקבלים באמצעות כלים ביואינפורמטריים. אנו ממליצים להשתמש בפלטפורמת Illumina MiSeq, המייצגת אפשרות זולה יותר עם תפוקה גבוהה, המייצרת רצפי 250 bp בפרקי זמן קצרים ^11,44.

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגוד עניינים.

אנו מודים למימון של FAPESP (2015/26479-6) ו- CNPq (447453/2014-9). JLSM מודה ל- CNPq על מענקי פרודוקטיביות (303664/2020-7). MPP מודה Capes (מלגת תואר שני, תהליך 88887.600591/2021-00) ו- CNPq.

An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:

Juliana Lishcka Sampaio Mayer

to:

Juliana Lischka Sampaio Mayer