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As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.
Nos últimos anos, tornou-se evidente que ribossomos não só decodificam nosso mRNA, mas também guiam o surgimento da cadeia de polipeptídeos no ambiente celular lotado. Os ribossomos fornecem a plataforma para a ligação espacial e cineticamente controlada de fatores de segmentação de membrana, modificando enzimas e acompanhantes dobráveis. Até mesmo a montagem em complexos oligomericos de alta ordem, bem como etapas de formação de rede proteína-proteína, foram recentemente descobertas como coordenadas com síntese.
Aqui, descrevemos o Selective Ribosome Profiling, um método desenvolvido para capturar interações co-translacionais in vivo. Detalharemos as várias etapas de purificação de afinidade necessárias para capturar complexos ribossomo-nascentes, juntamente com os interlaciadores co-translacionais, bem como a extração de mRNA, exclusão de tamanho, transcrição reversa, sequenciamento profundo e etapas de análise de big data, necessárias para decifrar interações co-translacionais em resolução de quase codon.
Selective Ribosome Profiling (SeRP) é o único método, até o momento, que captura e caracteriza interações co-translacionais, in vivo, de forma direta 1,2,3,4,5,6. O SeRP permite o perfil global de interações de qualquer fator com a tradução de ribossomos na resolução 2,7 de códon próximo.
O método se baseia no congelamento flash de células em crescimento e na preservação da tradução ativa. Os lises celulares são então tratados com RNase I para digerir todo o mRNA na célula, exceto fragmentos de mRNA protegidos por ribossomos denominados "pegadas ribossósas". A amostra é então dividida em duas partes; uma parte é diretamente usada para o isolamento de todas as pegadas ribossômicas celulares, representando toda a tradução contínua na célula. A segunda parte é utilizada para a afinidade-purificação do subconjunto específico de ribossomos associados a um fator de interesse, por exemplo: modificação de enzimas, fatores de translocação, acompanhantes dobráveis e interações de montagem complexa. As pegadas ribossômicas purificadas por afinidade são coletivamente chamadas de interactome. Em seguida, os mRNAs protegidos por ribossomo são extraídos e usados para a geração de biblioteca cDNA, seguido de sequenciamento profundo.
A análise comparativa das amostras totais de translatome e interactome permite a identificação de todos os orfs que associam ao fator de interesse, bem como a caracterização de cada perfil de interação orf. Este perfil relata as sequências precisas de início e término de engajamento a partir das quais se pode inferir os códons decodificados e os respectivos resíduos da cadeia emergente de polipeptídeos, bem como sobre as variações de velocidade ribossosome durante a interação 7,8. A Figura 1 retrata o protocolo como um esquema.
Figura 1: Uma visão geral do protocolo SeRP. Este protocolo pode ser realizado em sua totalidade dentro de 7-10 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Gerando cepas para o perfil seletivo ribossomo
NOTA: Selective Ribosome Profiling (SeRP) é um método que se baseia na purificação de afinidade de fatores de interesse, para avaliar seu modo de interação com complexos de cadeia ribossomos-nascentes. A recombinação homologiosa9, bem como métodos baseados em CRISPR/Cas910 são utilizados para fundir vários fatores de interesse com etiquetas para purificações de afinidade. Tais tags são GFP, para purificações de afinidade GFP-trap, tap-tag para purificações de contas IgG-Sepharose, bem como AVI-Tag purificado por avidin ou streptavidin, para listar alguns exemplos bem-sucedidos dos últimos anos.
2. Crescimento da cultura
3. Coleta celular e lise
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
10 mg/mL CHX (cicloheximida) | 220 | 0,5 mg/mL |
1M Tris-HCl pH 8.0 | 88 | 20 mM |
3M KCl | 205.7 | 140 mM |
1M MgCl2 | 26.4 | 6 mM |
1M PMSF | 4.4 | 1 mM |
NP-40 | 4.4 | 0.10% |
Inibidor de protease | 2 comprimidos | |
DNase I | 8.8 | 0.02 U/mL |
Volume final | 4,400 |
Tabela 1: Receita para a mistura mestre tampão de lise.
NOTA: O tampão de lise pode ser alterado para conter mais inibidores de protease (como bestatina, leupeptina, aprotinina, etc.) caso a proteína de interesse seja muito instável, mas é importante evitar o EDTA para manter as subunidades pequenas e grandes do ribossomo montadas durante as etapas seguintes. Por razões semelhantes, mantenha sempre pelo menos 6 mM MgCl2 na solução tampão.
ATENÇÃO: O HCL é altamente corrosivo e o PMSF é tóxico. Use luvas e manuseie com cuidado.
4. Purificação de complexos de cadeias ribossóficas para SeRP
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
50% de sacarose | 200 | 25% |
1M Tris-HCl pH 8.0 | 8 | 20 mM |
3M KCl | 18.7 | 140 mM |
1M MgCl2 | 4 | 10 mM |
CHX de 100 mg/mL | 0.4 | 0,1 mg/mL |
Inibidor de protease | 1 comprimido | |
Volume final | 400 |
Tabela 2: Receita para mistura master de almofada de sacarose.
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
CHX de 10 mg/mL | 50 | 0,1 mg/mL |
1M Tris-HCl pH 8.0 | 100 | 20 mM |
3M KCl | 233 | 140 mM |
1M MgCl2 | 50 | 10 mM |
1M PMSF | 5 | 1 mM |
NP-40 | 0.5 | 0.01% |
Inibidor de protease | 2 comprimidos | |
50% de Glicerol | 1,000 | 10% |
Volume final | 5,000 |
Tabela 3: Receita para a mistura mestre do tampão de lavagem.
5. preparação da biblioteca cDNA para sequenciamento profundo
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
PEG 8000 filtrado 50% | 16 | 20% |
DMSO | 4 | 10% |
Tampão de ligase T4 2 de 10× | 4 | 1x |
Inibidor de RNase SUPERase-In | 2 | 2 U |
Linker 3-L1 adenylated de 10 mM | 0.1 | 25 μM |
Água tratada com DEPC | 2.9 | |
Volume final | 29 |
Tabela 4: Receita para 3' end ligation master mix.
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
DNTPs de 10 mM | 1 | 0,5 mM |
25 μM Linker L(rt) | 0.5 | 625 nM |
Água tratada com DEPC | 1.5 | |
Volume final | 3 |
Tabela 5: Receita para a mistura mestre do buffer de transcrição reversa antes da desnaturação dos ácidos nucleicos.
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
Tampão FS × 5 | 4 | 1x |
Inibidor de RNase SUPERase-In | 1 | 2 U |
DTT 0.1 M | 1 | 5 mM |
Volume final | 6 |
Tabela 6: Receita para a mistura mestre do buffer de transcrição reversa após a desnaturação dos ácidos nucleicos.
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
Tampão CircLigase II de 10× | 2 | 1x |
5 M betaine (opcional) | 1 | 0,25 M |
50 mM MnCl2 | 1 | 2,5 mM |
Volume final | 4 |
Tabela 7: Receita para o mix mestre de circularização ssDNA.
Reagente | Quantidade por amostra (μL) | Concentração final |
Água tratada com DEPC | 61.6 | |
Tampão de reação Phusion HF de 5× | 17.6 | 1x |
DNTPs de 10 mM | 1.8 | 200 μM |
Primer para frente pcr de 100 μM | 0.2 | 225 nM |
HF Phusion polimerase | 0.8 | 1.6 U |
Volume final | 82 |
Tabela 8: Receita para mistura mestre de amplificação PCR.
Ciclo | Denaturação (98 °C) | Anneal (60 °C) | Estender (72 °C) |
1 | 30 s | ||
2-16 | 10 s | 10 s | 5 s |
Tabela 10: Programa PCR para reação pcr.
6. Análise de dados
Conforme ilustrado no fluxograma deste protocolo (Figura 1), as células foram cultivadas para a fase de registro, e depois coletadas rapidamente pela filtragem e líricas pela moagem criogênica. O lysate foi então dividido em dois: um para pegadas totais de mRNA protegidos por ribossomo e outro para pegadas de mRNA protegidas por ribossomo selecionados, nas quais realizamos purificação de afinidade para puxar para baixo os complexos de cadeias de proteína-ribossomo-nascentes marcadas. Garantimos a expressão proteica marcada e o sucesso da retração pela análise da mancha ocidental, como pode ser visto na Figura 2. Validamos o isolamento de pegadas protegidas por ribossomo, que são tipicamente de 20-45 nt de comprimento por pequena eletroforese de RNA (sistema 2100 BioAnalyzer), permitindo uma mudança de 5-10 nt na detecção de tamanho, de acordo com o manual do sistema (Figura 3). Então, geramos uma biblioteca cDNA para sequenciamento profundo e análise de big data. Ao gerar a biblioteca cDNA, observe que o ciclismo abaixo pode levar a baixo rendimento (como pode ser visto na faixa 2 na Figura 3), mas a ream amplificação é possível para recuperar a biblioteca gerada. O excesso de ciclismo pode ocorrer quando os primers pcr estão esgotados, mas a reação continua. Quando os dNTPs ainda estão presentes, a reação prossegue, gerando artefatos PCR mais longos com sequências quimricas devido aos produtos PCR que se escorram13 (como pode ser visto nas faixas 3-4 na Figura 3, indicadas pela mancha visível). Se a concentração dos dNTPs também se tornar limitante, podem aparecer produtos que indiquem a presença de heterodúplexos compostos apenas de fragmentos de biblioteca parcialmente homólogos. A Figura 4 atua como referência, com a faixa 2 representando a amplificação ideal, e a pista 3 uma amplificação aceitável. As amostras das faixas 4 e 5 (ciclos 10 e 11) não devem ser utilizadas devido à possibilidade de introdução de duplicatas e artefatos pcr. A biblioteca gerada foi ainda validada por eletroforese de DNA de alta sensibilidade (o mesmo sistema BioAnalyzer foi utilizado) para distribuição e quantificação de tamanho exato (Figura 5). Após a ligação de linker final de 3', transcrição reversa e amplificação pcr, uma distribuição de comprimento cDNA como tal é esperado, com um pico acentuado em torno de 175 nt.
Aparamos e removemos adaptadores e códigos de barras da biblioteca sequenciada, e apenas as leituras entre 20 e 45 nt foram selecionadas para análise posterior. A Figura 6 mostra a distribuição de comprimento resultante. As leituras foram divididas em diferentes grupos de: sequências de codificação, introns e sequências intergênicas (Figura 7), e ainda classificadas como mostradas na Figura 8.
A análise final para detecção e caracterização das interações co-translacionais foi realizada com base no enriquecimento de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomo, produzindo os gráficos na Figura 9. Comparamos a ocupação ribossoma normalizada (em cada nucleotídeo ao longo de cada orf) do translatome total ao seu translatome selecionado correspondente (nascente-interactome). Por comparação nucleotídea elimina as taxas de tradução artefatos. A reprodutibilidade entre as réplicas biológicas foi avaliada pela correlação de Pearson (limiar > 0,6). Apresentamos Perfis Ribossomos Seletivos, analisando interações co-translacionais do Vma2p com três proteínas: a acompanhante associada ao ribossomo Ssb1p, Pfk2p (Phosphofructokinase) e Fas1p (Sinthase de ácido graxo), com cada proteína C' terminantemente marcada pelo GFP. Executamos o protocolo em réplicas biológicas. Figura 9 A, D e G mostra o esquema experimental de cada purificação de afinidade. Em seguida, mostramos a ocupação ribossa de translatórios totais em comparação com os interactomes Ssb1 ao longo do Vma2p orf, codificando para uma subunidade do vacuolar H+-ATPase (Figura 9 B, E e H). Finalmente, realizamos o perfil de enriquecimento ribossomo baseado em proporção (IP/Total) em cada posição ribossosome em [codon/aa] ao longo do orf (Figura 9 C, F e I). Comparando as interações co-translacionais dessas três proteínas com o Vma2p, que está sendo sintetizado pelo ribossomo, revelou que a acompanhante do Ssb1 envolve o Vma2p nascente em quatro regiões diferentes ao longo do orf, pois identificamos quatro picos significativos de enriquecimento pelo SeRP. Diferentemente, Pfk2p mostra apenas um pico significativo de enriquecimento, conforme identificado pelo SeRP, em uma posição diferente em relação à acompanhante co-translacional Ssb1. A análise das interações co-translacionais de Fas1 com o nascente Vma2p não detectou nenhum enriquecimento significativo. Assim, a comparação desses perfis ribossomos de enriquecimento baseado em proporção demonstra o poder deste protocolo na detecção e caracterização de várias interações co-translacionais em resolução de códons próximos.
Figura 2: Resultado representativo da mancha ocidental após purificação de afinidade da cepa BY4741 com Naa10 com marca HA. Resultado representativo da mancha ocidental após a purificação de afinidade da cepa BY4741 com Naa10 com marca HA mostrando uma banda em torno de 27,8 kDa, enquanto o tipo selvagem, como um controle negativo, não mostra nenhuma banda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultado bioanalyzer representativo após isolamento da pegada e extração de RNA com ácido-fenol:clorofórmio, e um tamanho médio de 25 nt. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Eletroforese gel representativa da amplificação pcr. Representante gel-eletroforese de amplificação PCR com faixas 2-5 carregadas com produtos PCR dos ciclos 8-11, e escadas em ambos os lados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultado bioanalyzer representativo obtido após a criação de uma biblioteca cDNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Distribuição de comprimento esperado de leituras após a remoção dos adaptadores com Cutadapt (removendo leituras menores que 20 ou mais de 45). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Porcentagem de sucesso de alinhamento esperado depois de remover leituras de RNA não codificadoras com Bowtie2 e usar TopHat para alinhar as leituras restantes a diferentes organismos. A amostra foi colhida de S. cerevisiae (uma variante mutante de BY4741). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Um gráfico gerado com o RiboToolkit representando a codificação esperada versus a razão não codificação das leituras alinhadas depois de usar o Bowtie2 para remover elementos de rRNA nas leituras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Interações co-translacionais de três proteínas diferentes: Ssb1p, Pfk2p e Fas1p com Vma2p, que está sendo sintetizada pelo ribossomo, analisado pelo SeRP. Todos os eixos y são mostrados em leituras por milhão (RPM) lê.. (A, D, G) Esquema experimental de SeRP de Ssb1p, Pfk2p e Fas1p C' marcados terminantemente pela GFP, respectivamente. (B, E, H) Ocupação ribossa ao longo da orf de translatomes totais em comparação com os interactomes Ssb1, Pfk2p e Fas1p, respectivamente (em réplicas biológicas). (C, F, I) Enriquecimento médio de Ssb1p, Pfk2p e Fas1p (razão IP/Total) em cada posição ribossa em [codon/aa] ao longo do orf, respectivamente. A variação entre as réplicas biológicas é indicada pela área sombreada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 9: 3' Linker e sequências de primer. 3' Linker L1: Linker 3-L1 com 50 adenylation e 30 identificadores moleculares únicos dideoxy-cytidine ('NN...') (Purificação HPLC livre de RNase; Linker de transcrição reversa: transcrição reversa (L(rt)) com identificadores moleculares únicos e fosforilados (purificação HPLC sem rnase); Primer para frente pcr: PCRf; HPLC purificado. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Arquivo Suplementar. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Aqui, o protocolo detalha a abordagem de Perfil Ribossomo Seletivo para capturar interações co-translacionais em resolução de códon próximo. À medida que o ribossomo surge como um centro para coordenar o surgimento da cadeia nascente no citoplasma lotado, este é um método crucial para identificar e caracterizar as diversas interações co-translacionais necessárias para garantir um proteome funcional, bem como para o estudo de várias doenças. Até o momento, o SeRP é o único método que pode capturar e caracterizar essas interações, de forma direta, in vivo 14,15,16.
O primeiro e mais crítico passo é a coleta de células e a lise celular. É imperativo capturar, em segundos, a tradução contínua, por congelamento de flash seguido de lise em um estado congelado. A coleta de células deve ser feita com pressa para evitar o escoamento ribossômico, bem como induzir respostas translacionais de estresse, que podem ocorrer rapidamente. O segundo passo crítico é o passo de purificação da afinidade. É imprescindível reduzir a vinculação de fundo por meio de uma lavagem rigorosa, garantindo que as interações co-translacionais sejam mantidas, o que pode ser facilitado pelo cruzamento in vivo . Como este protocolo é baseado no fundo alto NGS (Next Generation Sequencing) altamente sensível nos primeiros passos pode ser amplificado nas seguintes etapas de preparação da biblioteca cDNA, levando a baixas relações sinal-ruído.
O tratamento nuclease, para digerir todos os mRNAs não protegidos deve ser avaliado por perfil polisso17 , juntamente com uma avaliação cuidadosa da distribuição isolada de tamanho das pegadas ribossômicas (conforme detalhado acima) para evitar mais ou sob digestão de RNA. A calibração dos tempos de concentração e digestão da Nuclease pode facilitar a recuperação precisa da pegada, pois a digestão excessiva pode levar à digestão de rRNA ribossômico, levando à perda de pegadas protegidas por ribossomos. É importante notar que a sub digestão também pode levar a taxas mais baixas de descoberta de pegadas protegidas por ribossomo, como as etapas de preparação da biblioteca cDNA, bem como as etapas de análise de dados descritas aqui descartam leituras longas e não características.
Embora o esgotamento do RRNA nem sempre constitua um passo crítico e não seja obrigatório, ele tem algumas vantagens, como amostras mais limpas e, portanto, uma taxa maior de leituras mapeadas pelo genoma. Por outro lado, há a possibilidade de vieses, já que muitos protocolos de esgotamento do rRNA também podem causar esgotamento dos fragmentos protegidos por ribossomos desejados. Deve-se também levar em consideração os custos dos kits de esgotamento do rRNA. o esgotamento do rRNA pode ser realizado após a etapa de isolamento da impressão de pé ribossomo ou após a etapa de circularização cDNA.
as etapas de preparação da biblioteca cDNA, conforme descrito aqui, foram otimizadas para entrada de mRNA baixa, pois as etapas de afinidade e purificação ribossomamo reduzem muito a quantidade de entrada de mRNA, em comparação com estudos de expressão RNA-seq. O upscaling da quantidade inicial de culturas celulares pode facilitar muito a geração de bibliotecas cDNA. Alternativamente, qualquer protocolo de biblioteca cDNA de escolha pode se encaixar com os passos de purificação de afinidade e isolamento de pegada descritos aqui. É importante notar que o tratamento Nuclease que gera as pegadas ribossômicas requer o reparo resultante de extremidades mRNA (preparação da biblioteca cDNA, etapa de desfosforilação) para permitir seguir as etapas de ligadura de linker no protocolo cDNA descrito aqui em seu protocolo de escolha.
Durante o sequenciamento, é importante diferenciar o SeRP do RNA-Seq, pois a heterogeneidade das bibliotecas geradas varia muito, dependendo dos fatores marcados pela afinidade. Acompanhantes moleculares e fatores de segmentação são muitas vezes mais promíscuos na vinculação, interagindo com centenas ou milhares de substratos durante a tradução, levando a bibliotecas cDNA altamente diversas. No entanto, interagidores altamente específicos, como os interativos de montagem de complexos co-translacionais, muitas vezes podem levar à geração de bibliotecas cDNA muito menos diversas. O aumento de bibliotecas diversas e não diversas na mesma pista pode melhorar muito o sequenciamento e seguir os resultados da análise de dados.
Outra característica única do SeRP é sua capacidade de capturar variações locais em ocupações ribossósmos ao longo do orf permitindo a descoberta de mudanças ribossômicas na taxa de tradução associadas a cada conjunto de interações. Por isso, é imprescindível comparar ocupações ribossósmos em cada códon ao longo do orf para identificar corretamente o enriquecimento. Utilizar as médias dos orfs pode levar à perda de interações transitórias ou falsa descoberta.
O uso correto do método SeRP abre muitos caminhos co-translacionais para a análise direta, descobrindo novas características mecanicistas, bem como novos fatores associados ao ribossomo, revolucionando o campo proteína-biosíntese.
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório por discussões frutíferas e Muhammad Makhzumy pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela isf (Israel Science Foundation) grant 2106/20.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide | IDT | custom order | RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3' |
Absolute ethanol | VWR | 20821 | |
Acid phenol–chloroform | Ambion | AM9722 | |
Antibody: mouse monclonal anti-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
Aprotinin | Roth | A162.3 | |
ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
Bacto agar | BD | 214030 | |
Bacto peptone | BD | 211820 | |
Bacto tryptone | BD | 211699 | |
Bacto yeast extract | BD | 212720 | |
Bestatin hydrochloride | Roth | 2937.2 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
CircLigase II ssDNA Ligase* | Epicentre | CL9025K | 100 U/μL |
Colloidal Coomassie staining solution | Roth | 4829 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 29384100 | |
Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
DEPC treated and sterile filtered water* | Sigma | 95284 | |
D-Glucose anhydrous | Merck | G5767-500G | |
Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
Dimethylsulfoxide* | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
DNA loading dye* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6× |
DNase I, recombinant | Roche | 4716728001 | RNAse free |
dNTP solution set* | NEB | N0446S | |
EDTA* | Roth | 8043 | |
Glycerol | VWR | 24388.260. | |
Glycine solution | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/mL |
HEPES | Roth | HN78.3 | |
HF Phusion polymerase* | NEB | M0530L | |
HK from S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
Hydrochloric acid | AppliChem | A1305 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Roth | CN08 | |
Kanamycin | Roth | T832.4 | |
KCl | Roth | 6781.1 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
Linker L(rt) | IDT | custom order | |
Liquid nitrogen | |||
MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
Na2HPO4·2H2O | Roth | T879.3 | |
NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
NaH2PO4·H2O | Roth | K300.2 | |
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads | GE Life Sciences | 17090601 | |
Nonidet P 40 substitute | Sigma | 74385 | |
Pepstatin A | Roth | 2936.2 | |
Phenylmethyl sulfonyl fluoride | Roth | 6367 | |
Precast gels | Bio-Rad | 5671034 | 10% and 12% |
RNase I | Ambion | AM2294 | |
SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNase free |
Sodium acetate* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5.5 |
Sodium azide | Merck | S8032-100G | |
Sodium chloride | Roth | 9265 | |
Sodium hydroxide* | Sigma | S2770 | 1 N |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Superscript III Reverse Transciptase* | Invitrogen | 18080-044 | |
SYBR Gold* | Invitrogen | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase* | NEB | M0201L | |
T4 RNA ligase 2* | NEB | M0242L | |
TBE polyacrylamide gel* | Novex | EC6215BOX | 8% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC68752BOX | 10% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC6885BOX | 15% |
TBE–urea sample buffer* | Novex | LC6876 | 2× |
Tris | Roth | 4855 | |
Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7.0 |
Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8.0 |
UltraPure 10× TBE buffer* | Invitrogen | 15581-044 | |
* - for library preparation | |||
gasket and spring clamp , 90 mm, | Millipore | XX1009020 | |
ground joint flask 1 L , | Millipore | XX1504705 |
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