Method Article
Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.
Ces dernières années, il est devenu évident que les ribosomes non seulement décodent notre ARNm, mais guident également l’émergence de la chaîne polypeptidique dans l’environnement cellulaire encombré. Les ribosomes fournissent la plate-forme pour la liaison contrôlée spatialement et cinétiquement des facteurs de ciblage membranaire, modifiant les enzymes et pliant les chaperons. Même l’assemblage en complexes oligomères d’ordre élevé, ainsi que les étapes de formation du réseau protéine-protéine, ont récemment été découverts pour être coordonnés avec la synthèse.
Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode développée pour capturer les interactions co-translationnelles in vivo. Nous détaillerons les différentes étapes de purification d’affinité requises pour capturer les complexes de chaîne naissante de ribosomes avec des interacteurs co-traductionnels, ainsi que les étapes d’extraction de l’ARNm, d’exclusion de taille, de transcription inverse, de séquençage en profondeur et d’analyse de données volumineuses, nécessaires pour déchiffrer les interactions co-traductionnelles en résolution proche du codon.
Lerofilage de l’ibosome RR (SeRP) est la seule méthode, à ce jour, qui capture et caractérise les interactions co-translationnelles, in vivo, de manière directe 1,2,3,4,5,6. SeRP permet un profilage global des interactions de n’importe quel facteur avec la traduction des ribosomes en résolution proche du codon 2,7.
La méthode repose sur la congélation éclair des cellules en croissance et la préservation de la traduction active. Les lysats cellulaires sont ensuite traités avec de la RNase I pour digérer tout l’ARNm dans la cellule, à l’exception des fragments d’ARNm protégés par les ribosomes appelés « empreintes de ribosomes ». L’échantillon est ensuite divisé en deux parties; une partie est directement utilisée pour l’isolement de toutes les empreintes ribosomiques cellulaires, représentant toute la traduction en cours dans la cellule. La deuxième partie est utilisée pour la purification d’affinité du sous-ensemble spécifique de ribosomes associés à un facteur d’intérêt, par exemple: enzymes modificatrices, facteurs de translocation, chaperons de repliement et interactions d’assemblage complexe. Les empreintes ribosomiques purifiées par affinité sont collectivement appelées interactome. Ensuite, les ARNm protégés par les ribosomes sont extraits et utilisés pour la génération de bibliothèque d’ADNc, suivie d’un séquençage en profondeur.
L’analyse comparative des échantillons totaux de translatome et d’interactome permet d’identifier tous les orfs associés au facteur d’intérêt, ainsi que la caractérisation de chaque profil d’interaction orf. Ce profil rapporte les séquences précises d’apparition et de terminaison de l’engagement à partir desquelles on peut déduire les codons décodés et les résidus respectifs de la chaîne polypeptidique émergente, ainsi que sur les variations de vitesse des ribosomes au cours de l’interaction 7,8. La figure 1 illustre le protocole sous forme de schéma.
Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole SeRP. Ce protocole peut être effectué dans son intégralité dans un délai de 7 à 10 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Génération de souches pour le profilage sélectif des ribosomes
NOTE: Lerofiling Ribosome P(SeRP) est une méthode qui repose sur la purification d’affinité des facteurs d’intérêt, pour évaluer leur mode d’interaction avec les complexes de chaînes naissantes de ribosomes. La recombinaison homologue9, ainsi que les méthodes basées sur CRISPR/Cas910 sont utilisées pour fusionner divers facteurs d’intérêt avec des étiquettes pour les purifications d’affinité. Ces étiquettes sont GFP, pour les purifications d’affinité de piège GFP, TAP-tag pour les purifications de perles d’IgG-Sepharose ainsi que AVI-Tag purifié par avidine ou streptavidine, pour énumérer quelques exemples réussis de ces dernières années.
2. Croissance de la culture
3. Collecte et lyse des cellules
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
10 mg/mL DE CHX (cycloheximide) | 220 | 0,5 mg/mL |
1M Tris-HCl pH 8,0 | 88 | 20 mM |
3M KCl | 205.7 | 140 mM |
1M MgCl2 | 26.4 | 6 mM |
1M PMSF | 4.4 | 1 mM |
NP-40 | 4.4 | 0.10% |
Inhibiteur de la protéase | 2 comprimés | |
DNase I | 8.8 | 0,02 U/mL |
Volume final | 4,400 |
Tableau 1 : Recette du mélange maître tampon de lyse.
REMARQUE: Le tampon de lyse peut être modifié pour contenir plus d’inhibiteurs de la protéase (tels que la bestatine, la leupétine, l’aprotinine, etc.) au cas où la protéine d’intérêt serait très instable, mais il est important d’éviter l’EDTA afin de maintenir les petites et grandes sous-unités du ribosome assemblées au cours des étapes suivantes. Pour des raisons similaires, maintenez toujours au moins 6 mM de MgCl2 dans la solution tampon.
ATTENTION : Le HCl est très corrosif et le PMSF est toxique. Portez des gants et manipulez-les avec soin.
4. Purification des complexes ribosomes-chaînes naissantes pour SeRP
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
50% de saccharose | 200 | 25% |
1M Tris-HCl pH 8,0 | 8 | 20 mM |
3M KCl | 18.7 | 140 mM |
1M MgCl2 | 4 | 10 mM |
100 mg/mL CHX | 0.4 | 0,1 mg/mL |
Inhibiteur de la protéase | 1 comprimé | |
Volume final | 400 |
Tableau 2 : Recette du mélange maître de coussin de saccharose.
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
10 mg/mL CHX | 50 | 0,1 mg/mL |
1M Tris-HCl pH 8,0 | 100 | 20 mM |
3M KCl | 233 | 140 mM |
1M MgCl2 | 50 | 10 mM |
1M PMSF | 5 | 1 mM |
NP-40 | 0.5 | 0.01% |
Inhibiteur de la protéase | 2 comprimés | |
50% Glycérol | 1,000 | 10% |
Volume final | 5,000 |
Tableau 3 : Recette du mélange maître tampon de lavage.
5. Préparation de la bibliothèque d’ADNc pour le séquençage en profondeur
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
50% de PEG 8000 filtré stérile | 16 | 20% |
DMSO | 4 | 10% |
Tampon 10× ARN ligase 2 T4 | 4 | 1x |
Inhibiteur de la RNase SUPERase-In | 2 | 2 U |
Linker adénylé 10 mM 3-L1 | 0.1 | 25 μM |
Eau traitée au DEPC | 2.9 | |
Volume final | 29 |
Tableau 4 : Recette du mélange maître de ligature finale de 3'.
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
10 mM dNTPs | 1 | 0,5 mM |
Linker L(rt) de 25 μM | 0.5 | 625 nM |
Eau traitée au DEPC | 1.5 | |
Volume final | 3 |
Tableau 5 : Recette du mélange maître tampon de transcription inverse avant la dénaturation des acides nucléiques.
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
5× Tampon FS | 4 | 1x |
Inhibiteur de la RNase SUPERase-In | 1 | 2 U |
TNT 0,1 M | 1 | 5 mM |
Volume final | 6 |
Tableau 6 : Recette du mélange maître tampon de transcription inverse après dénaturation des acides nucléiques.
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
10× Tampon CircLigase II | 2 | 1x |
5 M Bétaïne (facultatif) | 1 | 0,25 m |
50 mM MnCl2 | 1 | 2,5 mM |
Volume final | 4 |
Tableau 7 : Recette du mélange maître de circularisation de l’ADNSS .
Réactif | Quantité par échantillon (μL) | Concentration finale |
Eau traitée au DEPC | 61.6 | |
5× Tampon de réaction PHusion HF | 17.6 | 1x |
10 mM dNTPs | 1.8 | 200 μM |
Amorce avant PCR 100 μM | 0.2 | 225 nM |
HF Phusion polymérase | 0.8 | 1,6 U |
Volume final | 82 |
Tableau 8 : Recette du mélange maître d’amplification PCR.
Cycle | Dénature (98 °C) | Recuit (60 °C) | Étendre (72 °C) |
1 | 30 s | ||
2-16 | 10 s | 10 s | 5 s |
Tableau 10 : Programme de PCR pour la réaction par PCR.
6. Analyse des données
Comme l’illustre l’organigramme de ce protocole (Figure 1), les cellules ont été cultivées en phase logarithmique, puis collectées rapidement par filtration et lysées par broyage cryogénique. Le lysat a ensuite été divisé en deux: l’un pour les empreintes totales d’ARNm protégées par les ribosomes et l’autre pour les empreintes d’ARNm protégées par les ribosomes sélectionnées, sur lesquelles nous avons effectué une purification d’affinité pour abaisser les complexes de chaînes protéine-ribosome-naissantes marqués. Nous avons assuré l’expression des protéines marquées et le succès de l’analyse par transfert western, comme on peut le voir à la figure 2. Nous avons validé l’isolement des empreintes protégées par les ribosomes, qui mesurent généralement de 20 à 45 nt de long par électrophorèse à petit ARN (système 2100 BioAnalyzer), permettant un décalage de taille de 5 à 10 nt, selon le manuel du système (Figure 3). Ensuite, nous avons généré une bibliothèque d’ADNc pour le séquençage en profondeur et l’analyse de données volumineuses. Lors de la génération de la bibliothèque d’ADNc, notez que le sous-cycle peut entraîner un faible rendement (comme on peut le voir dans la voie 2 de la figure 3), mais une réamplification est possible afin de récupérer la bibliothèque générée. Un recyclage excessif peut se produire lorsque les amorces de PCR sont épuisées, mais que la réaction se poursuit. Lorsque les dNTP sont encore présents, la réaction se poursuit, générant des artefacts PCR plus longs avec des séquences chimériques dues aux produits PCR qui s’amorcenteux-mêmes 13 (comme on peut le voir dans les voies 3-4 de la figure 3, indiquée par le frottis visible). Si la concentration des dNTP devient également limitative, des produits indiquant la présence d’hétéroduplexes composés uniquement de fragments de bibliothèque partiellement homologues peuvent apparaître. La figure 4 sert de référence, la voie 2 représentant une amplification optimale et la voie 3 une amplification acceptable. Les échantillons des voies 4 et 5 (cycles 10 et 11) ne devraient pas être utilisés en raison de la possibilité d’introduire des doublons et des artefacts de PCR. La bibliothèque générée a ensuite été validée par électrophorèse de l’ADN à haute sensibilité (le même système de bioanalyseur a été utilisé) pour la distribution et la quantification exactes de la taille (figure 5). Après une ligature de liaison d’extrémité de 3', une transcription inverse et une amplification par PCR, une distribution de longueur d’ADNc en tant que telle est attendue, avec un pic aigu d’environ 175 nt.
Nous avons découpé et retiré les adaptateurs et les codes-barres de la bibliothèque séquencée, et seules les lectures comprises entre 20 et 45 nt ont été sélectionnées pour une analyse plus approfondie. La figure 6 montre la distribution de longueur résultante. Les lectures ont été divisées en différents groupes de : séquences codantes, introns et séquences intergéniques (figure 7), et classées comme illustré à la figure 8.
L’analyse finale pour la détection et la caractérisation des interactions co-translationnelles a été réalisée sur la base de l’enrichissement de fragments d’ARNm protégés par les ribosomes, produisant les graphiques de la figure 9. Nous avons comparé l’occupation normalisée des ribosomes (à chaque nucléotide le long de chaque orf) du translatome total à son translatome sélectionné correspondant (naissant-interactome). La comparaison par nucléotide élimine les artefacts des taux de traduction. La reproductibilité entre les réplicats biologiques a été évaluée par corrélation de Pearson (seuil > 0,6). Nous présentons des profils ribosomes sélectifs, analysant les interactions co-translationnelles de Vma2p avec trois protéines: le chaperon associé aux ribosomes Ssb1p, Pfk2p (Phosphofructokinase) et Fas1p (acide gras synthase), chaque protéine C’étant marquée en phase terminale par GFP. Nous avons effectué le protocole dans des répliques biologiques. Graphique 9 A, D et G montrent le schéma expérimental de chaque purification d’affinité. Nous montrons ensuite l’occupation des ribosomes des translatomes totaux par rapport aux interactomes Ssb1 le long de l’orf Vma2p, codant pour une sous-unité de la H+-ATPase vacuolaire (Figure 9 B, E et H). Enfin, nous avons effectué un profilage de l’enrichissement des ribosomes basé sur le ratio (IP/Total) à chaque position du ribosome dans [codon/aa] le long de l’orf (Figure 9 C, F et I). La comparaison des interactions co-translationnelles de ces trois protéines avec Vma2p, qui est synthétisé par le ribosome, a révélé que le chaperon Ssb1 engage le Vma2p naissant dans quatre régions différentes le long de l’orf, car nous avons identifié quatre pics d’enrichissement significatifs par SeRP. Différemment, Pfk2p ne montre qu’un seul pic d’enrichissement significatif, tel qu’identifié par SeRP, dans une position différente de celle du chaperon co-translationnel Ssb1. L’analyse des interactions co-translationnelles de Fas1 avec Vma2p naissant n’a détecté aucun enrichissement significatif. Ainsi, la comparaison de ces profils de ribosomes d’enrichissement basés sur les ratios démontre la puissance de ce protocole dans la détection et la caractérisation de diverses interactions co-traductionnelles en résolution proche du codon.
Figure 2 : Résultat représentatif du transfert western après purification par affinité de la souche BY4741 avec Naa10 marqué HA. Résultat de western blot représentatif après purification d’affinité de la souche BY4741 avec Naa10 marqué HA montrant une bande autour de 27,8 kDa, tandis que le type sauvage, en tant que contrôle négatif, ne montre aucune bande. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultat représentatif du bioanalyseur après isolement de l’empreinte et extraction de l’ARN avec acide-phénol:chloroforme, et une taille moyenne de 25 nt. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Électrophorèse sur gel représentative de l’amplification par PCR. Électrophorèse sur gel représentative de l’amplification par PCR avec des voies 2 à 5 chargées de produits PCR des cycles 8 à 11 et des échelles des deux côtés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultat représentatif du bioanalyseur obtenu à la suite de la création d’une bibliothèque d’ADNc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Distribution attendue de la longueur des lectures après le retrait des adaptateurs avec Cutadapt (retrait des lectures inférieures à 20 ou supérieures à 45). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Pourcentage de réussite de l’alignement attendu après avoir retiré les lectures d’ARN non codantes avec Bowtie2 et utilisé TopHat pour aligner les lectures restantes sur différents organismes. L’échantillon a été prélevé sur S. cerevisiae (une variante mutée de BY4741). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Un graphique généré avec RiboToolkit représentant le rapport prévu entre le codage et le rapport non codant des lectures alignées après avoir utilisé Bowtie2 pour supprimer les éléments d’ARNr dans les lectures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Interactions co-translationnelles de trois protéines différentes : Ssb1p, Pfk2p et Fas1p avec Vma2p, qui est synthétisé par le ribosome, analysé par SeRP. Tous les axes y sont affichés en lectures par million de lectures (RPM). (A, D, G) Schéma expérimental de SeRP de Ssb1p, Pfk2p et Fas1p C’marqués en terminal par GFP, respectivement. (B, E, H) Occupation des ribosomes le long de l’orf des translatomes totaux par rapport aux interactomes Ssb1, Pfk2p et Fas1p, respectivement (dans les répliques biologiques). (C, F, I) Enrichissement moyen de Ssb1p, Pfk2p et Fas1p (rapport IP/Total) à chaque position de ribosome dans [codon/aa] le long de l’orf, respectivement. La variation entre les répliques biologiques est indiquée par la zone ombragée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 9 : Séquences d’agent de liaison et d’amorce 3'. Linker L1 de 3' : Linker 3-L1 avec adénylation de 5ʹ et identificateurs moléculaires uniques de 3ʹ didéoxy-cytidine (« NN... ») (Purification HPLC sans RNase; Inverseur de transcription : transcription inverse (L(rt)) avec 5ʹ phosphorylés, identificateurs moléculaires uniques (purification HPLC sans RNase) ; Amorce avant PCR: PCRf; HPLC purifié. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Dossier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Ici, le protocole détaille l’approche de profilage sélectif des ribosomes pour capturer les interactions co-traductionnelles dans une résolution proche du codon. Au fur et à mesure que le ribosome devient une plaque tournante pour coordonner l’émergence de la chaîne naissante dans le cytoplasme surpeuplé, il s’agit d’une méthode cruciale pour identifier et caractériser les diverses interactions co-translationnelles nécessaires pour assurer un protéome fonctionnel, ainsi que pour étudier diverses maladies. À ce jour, seRP est la seule méthode qui permet de capturer et de caractériser ces interactions, de manière directe, in vivo 14,15,16.
La première et la plus critique étape est la collecte et la lyse des cellules. Il est impératif de capturer, en quelques secondes, la traduction en cours, par congélation éclair suivie d’une lyse à l’état figé. La collecte des cellules doit être effectuée à la hâte afin d’éviter le ruissellement ribosomique ainsi que d’induire des réponses translationnelles de stress, qui peuvent se produire rapidement. La deuxième étape critique est l’étape de purification par affinité. Il est impératif de réduire la liaison de fond par un lavage rigoureux tout en s’assurant que les interactions co-traductionnelles sont maintenues, ce qui peut être facilité par la réticulation in vivo . Comme ce protocole est basé sur le NGS (Next Generation Sequencing) très sensible, l’arrière-plan élevé dans les premières étapes peut être amplifié dans les étapes suivantes de préparation de la bibliothèque d’ADNc, ce qui conduit à de faibles rapports signal/bruit.
Le traitement par nucléases, pour digérer tous les ARNm non protégés, doit être évalué par profilage polysome17 ainsi que par une évaluation minutieuse de la distribution granulométrique des empreintes ribosomiques isolées (comme détaillé ci-dessus) afin d’éviter une digestion excessive ou insuffisante de l’ARN. L’étalonnage de la concentration en nucléases et des temps de digestion peut faciliter une récupération précise de l’empreinte, car une digestion excessive peut entraîner une digestion de l’ARNr ribosomique, entraînant la perte d’empreintes protégées par les ribosomes. Il est important de noter que la sous-digestion peut également entraîner des taux de découverte plus faibles d’empreintes protégées par les ribosomes, car les étapes de préparation de la bibliothèque d’ADNc, ainsi que les étapes d’analyse des données décrites ici éliminent les lectures longues et inhabituelles.
Bien que l’épuisement de l’ARNr ne constitue pas toujours une étape critique et n’est pas obligatoire, il présente certains avantages tels que des échantillons plus propres et, par conséquent, un taux plus élevé de lectures cartographiées par le génome. D’autre part, il existe la possibilité de biais, car de nombreux protocoles d’épuisement de l’ARNr pourraient également entraîner l’épuisement des fragments protégés par les ribosomes souhaités. Il faut également prendre en considération les coûts des kits d’épuisement de l’ARNr. L’épuisement de l’ARNr peut être effectué après l’étape d’isolement de l’empreinte ribosome-pied ou après l’étape de circularisation de l’ADNc.
Les étapes de préparation de la bibliothèque d’ADNc décrites ici ont été optimisées pour une faible entrée d’ARNm, car les étapes d’affinité et de purification des ribosomes réduisent considérablement la quantité d’entrée d’ARNm, par rapport aux études d’expression de l’ARN-seq. La mise à l’échelle de la quantité initiale de cultures cellulaires peut grandement faciliter la génération de bibliothèque d’ADNc. Alternativement, n’importe quel protocole de bibliothèque d’ADNc de choix peut s’adapter aux étapes de purification d’affinité et d’isolation de l’empreinte décrites ici. Il est important de noter que le traitement par nucléase générant les empreintes ribosomiques nécessite la réparation des extrémités d’ARNm résultante (préparation de la bibliothèque d’ADNc, étape de déphosphorylation) pour permettre les étapes de ligature de liaison suivantes dans le protocole d’ADNc décrit ici dans le protocole de votre choix.
Pendant le séquençage, il est important de différencier SeRP de RNA-Seq, car l’hétérogénéité des bibliothèques générées varie considérablement, en fonction des facteurs marqués d’affinité. Les chaperons moléculaires et les facteurs de ciblage sont souvent plus promiscuités dans la liaison, interagissant avec des centaines ou des milliers de substrats pendant la traduction, ce qui conduit à des bibliothèques d’ADNc très diverses. Cependant, des interacteurs très spécifiques, tels que les interacteurs d’assemblage complexes co-translationnels, peuvent souvent conduire à la génération de bibliothèques d’ADNc beaucoup moins diversifiées. L’augmentation du nombre de bibliothèques diverses et non diversifiées sur la même voie peut grandement améliorer le séquençage et le suivi des résultats de l’analyse des données.
Une autre caractéristique unique de SeRP est sa capacité à capturer les variations locales dans les occupations de ribosomes le long de l’orf permettant la découverte de changements ribosomiques dans le taux de translation associés à chaque ensemble d’interactions. Il est donc impératif de comparer les occupations de ribosomes dans chaque codon le long de l’orf pour identifier correctement l’enrichissement. L’utilisation de moyennes orfs peut entraîner la perte d’interactions transitoires ou de fausses découvertes.
L’utilisation correcte de la méthode SeRP ouvre de nombreuses voies co-traductionnelles vers l’analyse directe, découvrant de nouvelles caractéristiques mécanistes ainsi que de nouveaux facteurs associés aux ribosomes, révolutionnant le domaine de la biosynthèse des protéines.
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire pour les discussions fructueuses et Muhammad Makhzumy pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par la subvention 2106/20 de l’ISF (Israeli Science Foundation).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide | IDT | custom order | RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3' |
Absolute ethanol | VWR | 20821 | |
Acid phenol–chloroform | Ambion | AM9722 | |
Antibody: mouse monclonal anti-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
Aprotinin | Roth | A162.3 | |
ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
Bacto agar | BD | 214030 | |
Bacto peptone | BD | 211820 | |
Bacto tryptone | BD | 211699 | |
Bacto yeast extract | BD | 212720 | |
Bestatin hydrochloride | Roth | 2937.2 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
CircLigase II ssDNA Ligase* | Epicentre | CL9025K | 100 U/μL |
Colloidal Coomassie staining solution | Roth | 4829 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 29384100 | |
Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
DEPC treated and sterile filtered water* | Sigma | 95284 | |
D-Glucose anhydrous | Merck | G5767-500G | |
Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
Dimethylsulfoxide* | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
DNA loading dye* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6× |
DNase I, recombinant | Roche | 4716728001 | RNAse free |
dNTP solution set* | NEB | N0446S | |
EDTA* | Roth | 8043 | |
Glycerol | VWR | 24388.260. | |
Glycine solution | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/mL |
HEPES | Roth | HN78.3 | |
HF Phusion polymerase* | NEB | M0530L | |
HK from S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
Hydrochloric acid | AppliChem | A1305 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Roth | CN08 | |
Kanamycin | Roth | T832.4 | |
KCl | Roth | 6781.1 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
Linker L(rt) | IDT | custom order | |
Liquid nitrogen | |||
MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
Na2HPO4·2H2O | Roth | T879.3 | |
NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
NaH2PO4·H2O | Roth | K300.2 | |
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads | GE Life Sciences | 17090601 | |
Nonidet P 40 substitute | Sigma | 74385 | |
Pepstatin A | Roth | 2936.2 | |
Phenylmethyl sulfonyl fluoride | Roth | 6367 | |
Precast gels | Bio-Rad | 5671034 | 10% and 12% |
RNase I | Ambion | AM2294 | |
SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNase free |
Sodium acetate* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5.5 |
Sodium azide | Merck | S8032-100G | |
Sodium chloride | Roth | 9265 | |
Sodium hydroxide* | Sigma | S2770 | 1 N |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Superscript III Reverse Transciptase* | Invitrogen | 18080-044 | |
SYBR Gold* | Invitrogen | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase* | NEB | M0201L | |
T4 RNA ligase 2* | NEB | M0242L | |
TBE polyacrylamide gel* | Novex | EC6215BOX | 8% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC68752BOX | 10% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC6885BOX | 15% |
TBE–urea sample buffer* | Novex | LC6876 | 2× |
Tris | Roth | 4855 | |
Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7.0 |
Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8.0 |
UltraPure 10× TBE buffer* | Invitrogen | 15581-044 | |
* - for library preparation | |||
gasket and spring clamp , 90 mm, | Millipore | XX1009020 | |
ground joint flask 1 L , | Millipore | XX1504705 |
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