Method Article
אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.
בשנים האחרונות התברר כי ריבוזומים לא רק מפענחים את ה-mRNA שלנו אלא גם מנחים את הופעתה של שרשרת הפוליפפטידים לסביבה התאית הצפופה. ריבוזומים מספקים את הפלטפורמה לקשירה מבוקרת מרחבית וקינטית של גורמי מיקוד ממברנה, אנזימים משנים ומלווים מתקפלים. אפילו ההרכבה לקומפלקסים אוליגומריים מסדר גבוה, כמו גם לשלבי היווצרות רשת חלבונים-חלבונים, התגלו לאחרונה כמתואמים עם סינתזה.
כאן אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה שפותחה כדי ללכוד אינטראקציות תרגום משותף in vivo. אנו נפרט את שלבי טיהור הזיקה השונים הנדרשים ללכידת קומפלקסים של שרשרת ריבוזום-מתהווה יחד עם אינטראקציות תרגום משותף, כמו גם את שלבי מיצוי ה-mRNA, הרחקת הגודל, השעתוק ההפוך, הריצוף העמוק וניתוח הביג-דאטה, הנדרשים כדי לפענח אינטראקציות של תרגום משותף ברזולוציה של כמעט קודון.
Selective Ribosome Profiling (SeRP) היא השיטה היחידה, עד כה, הלוכדת ומאפיינת אינטראקציות תרגום משותף, in vivo, באופן ישיר 1,2,3,4,5,6. SeRP מאפשר פרופיל גלובלי של אינטראקציות של כל גורם עם תרגום ריבוזומים ברזולוציה של כמעט קודון 2,7.
השיטה מסתמכת על הקפאת הבזק של תאים גדלים ושמירה על תרגום פעיל. לאחר מכן, ליזטים של תאים מטופלים באמצעות RNase I כדי לעכל את כל ה-mRNA בתא, למעט שברי mRNA המוגנים על-ידי ריבוזומים המכונים "עקבות ריבוזומים". לאחר מכן מתפצלים המדגם לשני חלקים; חלק אחד משמש ישירות לבידוד של כל עקבות הריבוזומליות התאיות, המייצגות את כל התרגום המתמשך בתא. החלק השני משמש לטיהור זיקה של תת-קבוצה ספציפית של ריבוזומים הקשורים לגורם עניין, לדוגמה: שינוי אנזימים, גורמי טרנסלוקציה, מלווים מתקפלים ואינטראקציות של הרכבה מורכבת. עקבות הריבוזומליות המטוהרות זיקה נקראות באופן קולקטיבי האינטראקציה. לאחר מכן, ה-mRNA המוגנים בריבוזום מופקים ומשמשים ליצירת ספריית cDNA, ולאחר מכן לריצוף עמוק.
ניתוח השוואתי של סך כל דגימות התרגום והאינטראקציה מאפשר זיהוי של כל האורפים המתקשרים עם גורם העניין, כמו גם אפיון של כל פרופיל אינטראקציה של orf. פרופיל זה מדווח על רצפי ההתחלה והסיום המדויקים של ההתקשרות שמהם ניתן להסיק את הקודונים המפוענחים ואת השאריות המתאימות של שרשרת הפוליפפטידים המתהווה, כמו גם על שינויי מהירות הריבוזומים במהלך האינטראקציה 7,8. איור 1 מתאר את הפרוטוקול כשרטוט.
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול SeRP. פרוטוקול זה יכול להתבצע בשלמותו תוך 7-10 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
1. יצירת זנים עבור פרופיל ריבוזום סלקטיבי
הערה: Selective Ribosome Profiling (SeRP) היא שיטה המסתמכת על טיהור זיקה של גורמים מעניינים, כדי להעריך את אופן האינטראקציה שלהם עם קומפלקסים של שרשרת ריבוזומים-מתהווים. רקומבינציה הומולוגית9, כמו גם שיטות מבוססות CRISPR/Cas910 משמשות כדי למזג גורמים שונים של עניין עם תגים לטיהור זיקה. תגים כאלה הם GFP, עבור טיהורי זיקה של מלכודת GFP, תג TAP עבור טיהורי חרוזי IgG-Sepharose וכן AVI-Tag המטוהר על ידי אבידין או סטרפטווידין, כדי למנות כמה דוגמאות מוצלחות מהשנים האחרונות.
2. צמיחת תרבות
3. איסוף תאים וליזיס
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
10 מ"ג/מ"ל CHX (ציקלוהקסימיד) | 220 | 0.5 מ"ג/מ"ל |
1M Tris-HCl pH 8.0 | 88 | 20 mM |
3M KCl | 205.7 | 140 mM |
1M MgCl2 | 26.4 | 6 מ"מ |
1M PMSF | 4.4 | 1 מ"מ |
NP-40 | 4.4 | 0.10% |
מעכב פרוטאז | 2 טבליות | |
DNase I | 8.8 | 0.02 U/מ"ל |
הכרך הסופי | 4,400 |
טבלה 1: מתכון לתערובת המאסטר של מאגר הליזיס.
הערה: ניתן לשנות את מאגר ה-Lysis כך שיכיל יותר מעכבי פרוטאזות (כגון בסטטין, לאופפטין, אפרוטינין וכו') במקרה שהחלבון המעניין מאוד לא יציב, אך חשוב להימנע מ-EDTA על מנת לשמור על תת-היחידות הקטנות והגדולות של הריבוזום שהורכבו במהלך השלבים הבאים. מסיבות דומות, תמיד לשמור על לפחות 6 mM MgCl2 בתמיסת המאגר.
אזהרה: HCl הוא מאוד קורוזיבי ו-PMSF רעיל. ללבוש כפפות וטפל בזהירות.
4. טיהור קומפלקסים של שרשראות ריבוזום-מתהוות עבור SeRP
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
50% סוכרוז | 200 | 25% |
1M Tris-HCl pH 8.0 | 8 | 20 mM |
3M KCl | 18.7 | 140 mM |
1M MgCl2 | 4 | 10 mM |
100 מ"ג/מ"ל CHX | 0.4 | 0.1 מ"ג/מ"ל |
מעכב פרוטאז | 1 טבליה | |
הכרך הסופי | 400 |
טבלה 2: מתכון לתערובת מאסטר כרית סוכרוז.
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
10 מ"ג/מ"ל CHX | 50 | 0.1 מ"ג/מ"ל |
1M Tris-HCl pH 8.0 | 100 | 20 mM |
3M KCl | 233 | 140 mM |
1M MgCl2 | 50 | 10 mM |
1M PMSF | 5 | 1 מ"מ |
NP-40 | 0.5 | 0.01% |
מעכב פרוטאז | 2 טבליות | |
50% גליצרול | 1,000 | 10% |
הכרך הסופי | 5,000 |
טבלה 3: מתכון לתערובת המאסטר של מאגר הכביסה.
5. הכנת ספריית cDNA לריצוף עמוק
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
50% PEG 8000 מסונן סטרילי | 16 | 20% |
DMSO | 4 | 10% |
10× T4 RNA ליגאז 2 חיץ | 4 | 1x |
מעכב SUPERase-in RNase | 2 | 2 U |
10 mM adenylated linker 3-L1 | 0.1 | 25 מיקרומטר |
מים שטופלו ב-DEPC | 2.9 | |
הכרך הסופי | 29 |
טבלה 4: מתכון לתערובת מאסטר של קשירת סוף 3 אינץ'.
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
10 mM dNTPs | 1 | 0.5 מ"מ |
25 μM Linker L(rt) | 0.5 | 625 ננומטר |
מים שטופלו ב-DEPC | 1.5 | |
הכרך הסופי | 3 |
טבלה 5: מתכון לתערובת הראשית של מאגר השעתוק ההפוך לפני דנטורציה של חומצות גרעין.
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
5× מאגר FS | 4 | 1x |
מעכב SUPERase-in RNase | 1 | 2 U |
DTT 0.1 M | 1 | 5 מ"מ |
הכרך הסופי | 6 |
טבלה 6: מתכון לתערובת הראשית של מאגר השעתוק ההפוך לאחר דנטורציה של חומצות גרעין.
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
10× חיץ CircLigase II | 2 | 1x |
5 M בטאין (אופציונלי) | 1 | 0.25 מ' |
50 mM MnCl2 | 1 | 2.5 מ"מ |
הכרך הסופי | 4 |
טבלה 7: מתכון לתערובת מאסטר של מעגליות ssDNA .
מגיב | כמות לדוגמה (μL) | ריכוז סופי |
מים שטופלו ב-DEPC | 61.6 | |
5× מאגר התגובה של Phusion HF | 17.6 | 1x |
10 mM dNTPs | 1.8 | 200 מיקרומטר |
100 μM PCR פריימר קדימה | 0.2 | 225 ננומטר |
HF Phusion פולימראז | 0.8 | 1.6 U |
הכרך הסופי | 82 |
טבלה 8: מתכון לתערובת מאסטר להגברת PCR.
מחזור | דנטורציה (98 °C) | חישול (60 °C) | הרחבה (72 °C) |
1 | 30 שניות | ||
2-16 | 10 שניות | 10 שניות | 5 שניות |
טבלה 10: תוכנית PCR לתגובת PCR.
6. ניתוח נתונים
כפי שמודגם בתרשים הזרימה של פרוטוקול זה (איור 1), התאים גודלו לפאזה של רישום, ולאחר מכן נאספו במהירות על ידי סינון ונשחקו על ידי שחיקה קריוגנית. לאחר מכן חולק הליסאט לשניים: האחד עבור עקבות mRNA כוללות המוגנות על-ידי ריבוזומים והשני עבור עקבות mRNA נבחרות המוגנות על-ידי ריבוזומים, שבהן ביצענו טיהור זיקה כדי למשוך מטה את קומפלקסי השרשראות המתהוות של חלבון-ריבוזום-מתהווה. הבטחנו את ביטוי החלבון המתויג ואת הצלחת המשיכה כלפי מטה על ידי ניתוח כתמים מערבי, כפי שניתן לראות באיור 2. אימתנו את הבידוד של עקבות מוגנות ריבוזומים, שבדרך כלל הן באורך של 20-45 nt על ידי אלקטרופורזה קטנה של RNA (מערכת BioAnalyzer 2100), מה שמאפשר שינוי גודל של 5-10 nt, על פי מדריך המערכת (איור 3). לאחר מכן, יצרנו ספריית cDNA לריצוף עמוק וניתוח ביג דאטה. בעת יצירת ספריית cDNA, שימו לב שתת-מחזוריות יכולה להוביל לתפוקה נמוכה (כפי שניתן לראות בנתיב 2 באיור 3), אך הגברה מחדש אפשרית כדי לשחזר את הספרייה שנוצרה. רכיבה על אופניים יתר עלולה להתרחש כאשר פריימרים PCR מתרוקנים אך התגובה נמשכת. כאשר dNTPs עדיין קיימים, התגובה ממשיכה, ומייצרת ממצאי PCR ארוכים יותר עם רצפים כימריים עקב מוצרי PCR המגדירים את עצמם13 (כפי שניתן לראות בנתיבים 3-4 באיור 3, המסומן על ידי המריחה הנראית לעין). אם גם הריכוז של ה-dNTPs הופך להיות מגביל, יכולים להופיע מוצרים המעידים על נוכחות של הטרודופלקסים המורכבים מקטעי ספרייה הומולוגיים חלקיים בלבד. איור 4 משמש כאסמכתא, כאשר נתיב 2 מייצג הגברה אופטימלית, ונתיב 3 הוא הגברה מקובלת. אין להשתמש בדגימות מנתיבים 4 ו-5 (מחזורים 10 ו-11) בשל האפשרות להציג כפילויות וממצאים של PCR. הספרייה שנוצרה אומתה עוד יותר על ידי אלקטרופורזה של דנ"א ברגישות גבוהה (אותה מערכת BioAnalyzer שימשה) לצורך התפלגות גודל וכימות מדויקים (איור 5). לאחר קשירת קישור קצה של 3', שעתוק הפוך והגברת PCR, צפויה התפלגות אורך cDNA ככזו, עם שיא חד סביב 175 nt.
קיצצנו והסרנו מתאמים וברקודים מהספרייה הרצופה, ורק הקריאות בין 20 ל-45 nt נבחרו לניתוח נוסף. איור 6 מציג את התפלגות האורך המתקבלת. הקריאות חולקו לקבוצות שונות של: רצפי קידוד, אינטרונים ורצפים אינטרגניים (איור 7), וסווגו עוד יותר כפי שמוצג באיור 8.
ניתוח סופי לאיתור ואפיון של אינטראקציות תרגום משותף בוצע על סמך העשרת שברי mRNA המוגנים על ידי ריבוזומים, והפיק את הגרפים באיור 9. השווינו את תפוסת הריבוזומים המנורמלת (בכל נוקלאוטיד לאורך כל אורף) של התרגום הכולל לתרגום הנבחר המתאים לו (nascent-interactome). לכל השוואת נוקלאוטידים מבטלת את שיעורי התרגום. יכולת השכפול בין שכפול ביולוגי הוערכה על ידי מתאם פירסון (סף > 0.6). אנו מציגים פרופילי ריבוזומים סלקטיביים, המנתחים אינטראקציות תרגומיות משותפות של Vma2p עם שלושה חלבונים: המלווה הקשור לריבוזום Ssb1p, Pfk2p (Phosphofructokinase) ו- Fas1p (חומצת שומן סינתאז), כאשר כל חלבון C' מתויג באופן סופי על ידי GFP. ביצענו את הפרוטוקול בשכפולים ביולוגיים. תרשים 9 A, D ו- G מראים את הסכימה הניסויית של כל טיהור זיקה. לאחר מכן אנו מראים את תפוסת הריבוזומים של סך התרגומים בהשוואה לאינטראקציות Ssb1 לאורך ה-Vma2p orf, המקודדות עבור תת-יחידה של ה-vacuolar H+-ATPase (איור 9 B, E ו-H). לבסוף, ביצענו פרופיל העשרת ריבוזומים מבוסס יחס (IP/Total) בכל מיקום ריבוזום ב-[codon/aa] לאורך ה-orf (איור 9 C, F ו-I). השוואת האינטראקציות התרגומיות המשותפות של שלושת החלבונים הללו עם Vma2p, המסונתז על ידי הריבוזום, גילתה כי מלווה Ssb1 מפעיל את ה-Vma2p המתהווה בארבעה אזורים שונים לאורך האורף, כפי שזיהינו ארבעה שיאי העשרה משמעותיים על ידי SeRP. באופן שונה, Pfk2p מראה רק שיא העשרה משמעותי אחד, כפי שזוהה על ידי SeRP, בעמדה שונה בהשוואה למלווה התרגום המשותף Ssb1. ניתוח של אינטראקציות התרגום המשותף של Fas1 עם Vma2p המתהווה לא זיהה העשרה משמעותית. לפיכך, ההשוואה בין פרופילי ריבוזום העשרה מבוססי יחס אלה מדגימה את כוחו של פרוטוקול זה בזיהוי ואפיון של אינטראקציות תרגום משותפות שונות ברזולוציה כמעט קודונית.
איור 2: תוצאה מייצגת של כתם מערבי לאחר טיהור זיקה של זן BY4741 עם Naa10 המתויג כ-HA. תוצאת כתם מערבי מייצגת לאחר טיהור זיקה של זן BY4741 עם Naa10 מתויג HA המציג רצועה סביב 27.8 kDa, בעוד שהסוג הפראי, כבקרה שלילית, אינו מראה רצועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תוצאת BioAnalyzer מייצגת לאחר בידוד טביעת רגל ומיצוי RNA עם חומצה-פנול:כלורופורם, וגודל ממוצע של 25 nt. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אלקטרופורזה מייצגת של ג'ל-אלקטרופורזה של PCR. ג'ל-אלקטרופורזה מייצגת של הגברת PCR עם נתיבים 2-5 עמוסים במוצרי PCR ממחזורים 8-11, וסולמות משני הצדדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תוצאת BioAnalyzer מייצגת שהתקבלה בעקבות יצירת ספריית cDNA. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: התפלגות האורך הצפויה של הקריאות לאחר הסרת המתאמים עם Cutadapt (הסרת קריאות קצרות מ-20 או יותר מ-45). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: אחוזי ההצלחה הצפויים ביישור לאחר הסרת קריאות RNA שאינן מקודדות עם Bowtie2 ושימוש ב-TopHat כדי ליישר את הקריאות הנותרות לאורגניזמים שונים. הדגימה נלקחה מ- S. cerevisiae (גרסה מוטציה של BY4741). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: גרף שנוצר עם RiboToolkit המייצג קידוד צפוי לעומת יחס שאינו מקודד של קריאות מיושרות לאחר שימוש ב-Bowtie2 כדי להסיר רכיבי rRNA בקריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: אינטראקציות תרגום משותפות של שלושה חלבונים שונים: Ssb1p, Pfk2p ו-Fas1p עם Vma2p, אשר מסונתז על-ידי הריבוזום, מנותח על-ידי SeRP. כל צירי ה-y מוצגים בקריאה למיליון (סל"ד) קריאות. (א, ד, ז) סכימה ניסיונית של SeRP של Ssb1p, Pfk2p ו- Fas1p C' מתויגת באופן סופי על ידי GFP, בהתאמה. (ב, ה, ח) תפוסת ריבוזום לאורך ה-orf של סך התרגומים בהשוואה לאינטראקציות Ssb1, Pfk2p ו-Fas1p, בהתאמה (בשכפולים ביולוגיים). (ג, פ, א) העשרה ממוצעת של Ssb1p, Pfk2p ו-Fas1p (יחס IP/Total) בכל מיקום ריבוזום ב-[קודון/aa] לאורך ה-orf, בהתאמה. השונות בין השכפולים הביולוגיים מסומנת על ידי האזור המוצל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 9: 3' רצפי קישור ופריימר. 3' Linker L1: Linker 3-L1 עם אדנילציה של 5ʹ ו-3ʹ דידאוקסי-ציטידין מזהים מולקולריים ייחודיים ('NN...') (טיהור HPLC ללא RNase; מקשר תעתיק הפוך: שעתוק הפוך (L(rt)) עם 5ʹ זרחן, מזהים מולקולריים ייחודיים (טיהור HPLC ללא RNase); פריימר קדמי PCR: PCRf; HPLC מטוהר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
כאן, הפרוטוקול מפרט את גישת פרופיל הריבוזומים הסלקטיבית ללכידת אינטראקציות של תרגום משותף ברזולוציה של כמעט קודון. ככל שהריבוזום עולה כמרכז לתיאום הופעת השרשרת המתהווה לתוך הציטופלסמה הצפופה, זוהי שיטה חיונית לזיהוי ואפיון האינטראקציות השונות של התרגום המשותף הנדרשות כדי להבטיח פרוטאום תפקודי, כמו גם לחקר מחלות שונות. נכון להיום, SeRP היא השיטה היחידה שיכולה ללכוד ולאפיין את האינטראקציות הללו, באופן ישיר, in vivo 14,15,16.
השלב הראשון והקריטי ביותר הוא איסוף תאים וליזיס. חובה ללכוד, תוך שניות, תרגום מתמשך, על ידי הקפאת הבזק ואחריה תזה במצב קפוא. איסוף התאים חייב להיעשות בחיפזון על מנת למנוע נגר ריבוזומלי וכן לגרום לתגובות תרגום מתח, שיכולות להתרחש במהירות. השלב הקריטי השני הוא שלב טיהור הזיקה. זה הכרחי כדי להפחית את קשירת הרקע על ידי שטיפה קפדנית תוך הקפדה על אינטראקציות תרגום משותף נשמרות, אשר ניתן להקל על ידי in vivo cross-linking. מכיוון שפרוטוקול זה מבוסס על הרקע הגבוה הרגיש ביותר של NGS (ריצוף הדור הבא) בשלבים הראשונים ניתן להגביר בשלבי ההכנה הבאים של ספריית cDNA, מה שמוביל ליחסי אות לרעש נמוכים.
יש להעריך את הטיפול בנוקלאז, כדי לעכל את כל ה-mRNA שאינם מוגנים על ידי פרופיל פוליאזום17 יחד עם הערכה זהירה של התפלגות גודל העקבות הריבוזומליות המבודדות (כמפורט לעיל) כדי למנוע עיכול RNA מעל או תחת. כיול ריכוז הנוקלאז וזמני העיכול יכול להקל על התאוששות מדויקת של טביעת הרגל, שכן עיכול יתר עלול להוביל לעיכול rRNA ריבוזומלי, מה שיוביל לאובדן עקבות מוגנות ריבוזום. חשוב לציין שתת-עיכול יכול גם להוביל לשיעורי גילוי נמוכים יותר של עקבות מוגנות ריבוזומים, שכן שלבי ההכנה של ספריית cDNA, כמו גם שלבי ניתוח הנתונים המתוארים כאן, מבטלים קריאות ארוכות ולא אופייניות.
בעוד שדלדול rRNA לא תמיד מהווה צעד קריטי ואינו חובה, יש לו כמה יתרונות כגון דגימות נקיות יותר, ולכן שיעור גבוה יותר של קריאות ממופות גנום. מצד שני, קיימת אפשרות של הטיות, שכן פרוטוקולים רבים של דלדול rRNA עלולים גם לגרום לדלדול של השברים המוגנים בריבוזומים הרצויים. יש לקחת בחשבון גם את העלויות של ערכות דלדול ה-rRNA. ניתן לבצע דלדול rRNA לאחר שלב הבידוד של הדפסת ריבוזום-רגל או לאחר שלב העגליזציה של cDNA.
שלבי ההכנה של ספריית cDNA כמתואר כאן, הותאמו לקלט mRNA נמוך, מכיוון ששלבי הזיקה וטיהור הריבוזומים מפחיתים מאוד את כמות קלט ה-mRNA, בהשוואה למחקרי ביטוי RNA-seq. הגדלת הכמות הראשונית של תרביות תאים יכולה להקל מאוד על יצירת ספריית cDNA. לחלופין, כל פרוטוקול בחירת ספריית cDNA יכול להתאים לשלבי טיהור הזיקה ובידוד טביעת הרגל המתוארים כאן. חשוב לציין כי הטיפול בנוקלאז המייצר את טביעות הרגל הריבוזומליות דורש את תיקון קצוות ה-mRNA שנוצר כתוצאה מכך (הכנת ספריית cDNA, שלב Dephosphorylation) כדי לאפשר ביצוע שלבי קשירת קישור בפרוטוקול cDNA המתואר כאן בפרוטוקול שבחרת.
במהלך הריצוף, חשוב להבדיל בין SeRP ל-RNA-Seq, שכן ההטרוגניות של הספריות שנוצרו משתנה מאוד, בהתאם לגורמי הזיקה המתויגים. מלווים מולקולריים וגורמי מיקוד הם לעתים קרובות מופקרים יותר בקשירתם, ומקיימים אינטראקציה עם מאות או אלפי מצעים במהלך התרגום, מה שמוביל לספריות cDNA מגוונות ביותר. עם זאת, אינטראקציות ספציפיות מאוד, כגון אינטראקציות הרכבה מורכבות של תרגום משותף, יכולות לעתים קרובות להוביל ליצירת ספריות cDNA הרבה פחות מגוונות. עלייה חדה בספריות מגוונות ולא מגוונות באותו נתיב יכולה לשפר מאוד את הריצוף ואת תוצאות ניתוח הנתונים.
תכונה ייחודית נוספת של SeRP היא היכולת שלו ללכוד וריאציות מקומיות בתפוסות ריבוזומים לאורך האורף ומאפשרת גילוי של תזוזות ריבוזומליות בקצב התרגום הקשורות לכל קבוצת אינטראקציות. לכן חובה להשוות את תפוסת הריבוזומים בכל קודון לאורך האורף כדי לזהות נכון את ההעשרה. שימוש בממוצעי אורפס עלול להוביל לאובדן אינטראקציות חולפות או לגילוי שגוי.
שימוש נכון בשיטת SeRP פותח מסלולים רבים של תרגום משותף לניתוח ישיר, ומגלה תכונות מכניסטיות חדשניות כמו גם גורמים חדשים הקשורים לריבוזומים, ומחולל מהפכה בתחום החלבון-ביוסינתזה.
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה על הדיונים הפוריים ולמוחמד מחזומי על הקריאה הביקורתית בכתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מענק ISF (הקרן הישראלית למדע) 2106/20.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide | IDT | custom order | RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3' |
Absolute ethanol | VWR | 20821 | |
Acid phenol–chloroform | Ambion | AM9722 | |
Antibody: mouse monclonal anti-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
Aprotinin | Roth | A162.3 | |
ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
Bacto agar | BD | 214030 | |
Bacto peptone | BD | 211820 | |
Bacto tryptone | BD | 211699 | |
Bacto yeast extract | BD | 212720 | |
Bestatin hydrochloride | Roth | 2937.2 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
CircLigase II ssDNA Ligase* | Epicentre | CL9025K | 100 U/μL |
Colloidal Coomassie staining solution | Roth | 4829 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 29384100 | |
Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
DEPC treated and sterile filtered water* | Sigma | 95284 | |
D-Glucose anhydrous | Merck | G5767-500G | |
Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
Dimethylsulfoxide* | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
DNA loading dye* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6× |
DNase I, recombinant | Roche | 4716728001 | RNAse free |
dNTP solution set* | NEB | N0446S | |
EDTA* | Roth | 8043 | |
Glycerol | VWR | 24388.260. | |
Glycine solution | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/mL |
HEPES | Roth | HN78.3 | |
HF Phusion polymerase* | NEB | M0530L | |
HK from S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
Hydrochloric acid | AppliChem | A1305 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Roth | CN08 | |
Kanamycin | Roth | T832.4 | |
KCl | Roth | 6781.1 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
Linker L(rt) | IDT | custom order | |
Liquid nitrogen | |||
MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
Na2HPO4·2H2O | Roth | T879.3 | |
NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
NaH2PO4·H2O | Roth | K300.2 | |
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads | GE Life Sciences | 17090601 | |
Nonidet P 40 substitute | Sigma | 74385 | |
Pepstatin A | Roth | 2936.2 | |
Phenylmethyl sulfonyl fluoride | Roth | 6367 | |
Precast gels | Bio-Rad | 5671034 | 10% and 12% |
RNase I | Ambion | AM2294 | |
SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNase free |
Sodium acetate* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5.5 |
Sodium azide | Merck | S8032-100G | |
Sodium chloride | Roth | 9265 | |
Sodium hydroxide* | Sigma | S2770 | 1 N |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Superscript III Reverse Transciptase* | Invitrogen | 18080-044 | |
SYBR Gold* | Invitrogen | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase* | NEB | M0201L | |
T4 RNA ligase 2* | NEB | M0242L | |
TBE polyacrylamide gel* | Novex | EC6215BOX | 8% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC68752BOX | 10% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC6885BOX | 15% |
TBE–urea sample buffer* | Novex | LC6876 | 2× |
Tris | Roth | 4855 | |
Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7.0 |
Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8.0 |
UltraPure 10× TBE buffer* | Invitrogen | 15581-044 | |
* - for library preparation | |||
gasket and spring clamp , 90 mm, | Millipore | XX1009020 | |
ground joint flask 1 L , | Millipore | XX1504705 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved