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Protocolos para encenar o período pupal e medição de pigmentação de asa de Drosophila guttifera são descritos. Preparação e quantificação de pigmentação fornecem uma base sólida para estudar os mecanismos do desenvolvimento dos traços adultos e habilitar interespecífica comparação do desenvolvimento de traço.
Diversificadas espécies de Drosophila (mosca de fruta) fornecem oportunidades para estudar os mecanismos de desenvolvimento e alterações genéticas responsáveis por mudanças evolutivas. Em particular, a fase adulta é uma fonte rica de traços morfológicos para comparação interespecífica, incluindo comparação de pigmentação de asa. Para estudar as diferenças de desenvolvimento entre as espécies, a observação detalhada e preparo adequado são necessários para comparação precisa. Aqui descrevemos os protocolos para preparo dos períodos pupal e quantificação de pigmentação da asa de uma mosca de fruta bolinhas, Drosophila guttifera. Primeiro, descrevemos o método por observação morfológica detalhada e definição dos estágios pupal baseado em morfologias. Este método inclui uma técnica para remover o casulo, que é o caso de quitinoso exterior da pupa, para permitir a observação detalhada de morfologias pupal. Em segundo lugar, descrevemos o método para medir a duração da fase pupal definido. Finalmente, descrevemos o método para a quantificação de pigmentação de asa com base na análise de imagem usando imagens digitais e o software ImageJ. Com esses métodos, podemos estabelecer uma base sólida para a comparação de processos de desenvolvimento de traços adultos durante estágios pupal.
Alguns dos traços morfológicos da drosófila são diversificados entre espécies1,2,3,4,5. Vamos aproximar-na questão da diversidade morfológica como surge, comparando os mecanismos de geração destas morfologias. Exemplos de tais morfologias são tricomas larvas, pentes de sexo adulto, aparelho genital externo, pigmentação abdominal e asa pigmentação6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. para estudar diferenças morfológicas entre os adultos, observação e análise da fase de pupa são importantes, porque o destino dos traços adultos é determinado na fase larval atrasado e subsequente morfogênese continua durante o período pupal.
Em estudos de biologia do desenvolvimento da Drosophila melanogaster, "horas APF" (horas depois da formação de pupa) é o método comum para indicar uma fase de pupa,16. Este sistema emprega o tempo absoluto após formação de pupa e é muito conveniente para experimentos de rotina. No entanto, velocidade do desenvolvimento pode diferir entre pupas e pode ser afectada por pequenas diferenças genéticas, epigenéticas ou microenvironmental, e, portanto, tendo o mesmo tempo absoluto após formação pupal não garante que as pupas são ao mesmo estágio do desenvolvimento. Em muitos casos, estágios definidos por características morfológicas são preferíveis para comparar vários indivíduos. Especialmente, uma comparação entre espécies requer preparo preciso e a comparação entre os estágios (homólogos) correspondentes.
Reconhecido de Bainbridge e Bownes17 20 estágios pupal (P1 a P15(ii)) baseada em características morfológicas das pupas de Drosophila melanogaster . Esta plataforma é o mais utilizado sistema de preparo do desenvolvimento morfológico18. Em um estudo anterior, realizamos encenando pupal de Drosophila guttifera para estabelecer uma base para asa pigmentação estudos19. D. guttifera tem um padrão de bolinhas pretas nas asas e é uma das espécies modelo para asa pigmentação formação20. Embora nós referidos os critérios morfológicos descritos na Bainbridge e 'Bownes pesquisa17, medimos diretamente durações de palco por observações serial19, em vez de usando Bainbridge e 'Bownes estimativa de durações de palco observava a frequência. Aqui descrevemos o método de preparo pupal e medição de durações dos estágios pupal de Drosophila usado em Fukutomi et al.19.
Para estudar o mecanismo do desenvolvimento de pigmentação de asa, precisamos saber quando nas fases de pupa ou adultos a pigmentação ocorre. Fukutomi et al. 19 quantificada densidades ópticas (ODs) de pigmentação durante estágios pupal e adultos por análise de imagem de imagens de asa. A pigmentação da drosófila asas é pensada para ser causado pelo acúmulo de melanina negra21. Para quantificação de ODs, foram utilizadas imagens de escala de cinza e ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Para reconhecer e quantificar a pigmentação local-específicos (ΔOD), subtraímos o OD fora de um local o OD dentro de um lugar. Para tornar este método reprodutível e objetiva, os locais de medição de OD devem ser determinados utilizando as veias da asa como Marcos. Neste artigo, descrevemos detalhadamente este método de quantificação de pigmentação de asa em Drosophila guttifera.
1. estoque de voar
2. observação de pupa e definição dos estágios pupal
Nota: A pupa para observação é retirada o mosca estoque mantido com um 12:12 h claro/escuro ciclo a 25 ° C. Bainbridge e Bownes17 descrito um baixo risco de mover d. melanogaster pupas do local original de pupação em um pedaço de papel de tecido umedecido (sobrevivência de 97% de 946 pupas movidas). D. guttifera pupas podem ser preparadas por essencialmente o mesmo método.
3. remover o casulo
Nota: Pupas de drosófila são cobertas por uma estrutura chamada o casulo. Um inseto do Muscomorpha (moscas) não derramou sua cutícula larval em pupa; em vez disso, ele endurece a cutícula depois de apolysis e usa-lo como uma capa protetora da pupa, o casulo24. Uma pupa que residem dentro de um casulo tem uma cutícula pupal verdadeira, que é muito macia e frágil. Antes de apolysis ocorre em torno de P4(ii), epitélios e casulo estão ligados juntos, e, portanto, remover o casulo sem danos é muito difícil. Depois P5, remover o casulo é trabalhoso, mas útil para observação morfológica e definição dos estágios pupal. O processo é realizado da seguinte forma.
4. duração dos estágios pupal de medição
5. medida da intensidade das manchas pretas na asa
Nota: A intensidade das manchas pretas na asa pupa ou adulta pode ser quantificada através da medição de densidade óptica (OD). Um filtro de vidro com conhecidos ODs (filtro de densidade escalonado) é usado para calibração de25, para que se pode calcular o OD de uma determinada área de uma imagem digital de uma asa. Medem-se a OD em um ponto e o OD fora do local, e o último é subtraído de primeira para obter a intensidade do spot (ΔOD). Aqui, descrevemos o método de dissecação, medição e cálculo de ΔOD. Este procedimento pode ser feito depois do passo 2, independente da etapa 3 e a etapa 4. Uma vez que executou o passo 2 e compreende todas as fases de pupa, um diretamente pode iniciar ou repita o passo 5.
O período pupal de d. guttifera é dividido em 17 estágios (P1 - P15(ii); imagens de representante de três estágios (P1, P5 - 6, P10) são mostrados a Figura 3e todas as 17 fases estão ilustradas na Figura 4). Embora Bainbridge e Bownes17 reconhecido 20 fases no d. melanogaster, alguns destes estágios não poderiam ser aplicado a d. guttifera. A ordem dos dois eventos do desenvolvimento, a aparência do corpo amarelo (massa de células de galpão dentro do intestino26) e o timing de túbulos de Malpighi, ficando verde, não são estritamente controlados em guttifera d., e, portanto, nós não pode separar P5 (i ), P5(ii) e P6. Também, ao contrário de d. melanogaster, o timing de enegrecimento das cerdas torácicas e abdominais foi sincronizado, e, portanto, nós não pode separar P11(i) e P11(ii)19.
Nós poderia medir o comprimento dos estágios pupal de d. guttifera (tabela 3, de Fukutomi et al.19). Todo o período pupal é mais do que d. melanogaster em 25 ° C17aproximadamente 20 h. Calculamos o ΔODs das áreas ao redor de um campaniform sensillum, dica de veia longitudinal e posterior crossvein. Aqui, nós mostramos o ODs e ΔODs em adultos 7 dias após a eclosão (tabela 4). Comparando os dados de múltiplos estágios, encontramos que o palco P12(i) é a hora de início da pigmentação, e essa pigmentação é completada por 24 h após a eclosão (Figura 5, as medições original usado em Fukutomi et al. 19).
Figura 1. Ilustração de remoção casulo. (A) Coloque um lado ventral crisálidas em um pedaço de fita dupla-face. Remova a parte anterior do casulo. (B) quebre o casulo com pinça do lado ventral. (C) depois de quebrar o casulo, tire a pupa usando um pincel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Definição da área de medição pigmentação. (A) o ponto A para um lugar associado com um sensillum de campaniform. (B) o ponto B por um ponto associado com uma ponta de veia longitudinal. (C) o ponto C para um local associado a uma posterior crossvein. (D) ponto D para uma área de controle. Escala barras indicam 250 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exemplos de estágios pupal definidos. (A) pupa do palco coberto de P1 com o casulo. (B) pupa da fase P5 - 6. (C) Pupa do palco P10. Os casulos são removidos antes de observação em (B) e (C). Escala barras indicam 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Ilustrações de 17 estágios pupal identificados em d. guttifera. (A) P1, o casulo é branco. (B) P2, a cor do casulo é marrom claro. (C) P3, uma bolha é observada no lado lateral (seta preta). (D) P4(i), a bolha é maior do que em P3 (seta preta), e a pupa é flutuante em PBS. (E) P4(ii), uma lacuna é observada em parte anterior (seta preta) e a parte posterior (seta cinza). (F) P5 - 6, Malpighi túbulos migram (difícil de ver se coberto por casulo). A forma de pupa é formada por epitélio pupal e cutícula pupal. (G) P7, o corpo amarelo pode ser observado no lado dorsal (seta preta). (H) P8, os olhos são amarelos. (I) P9, os olhos são âmbar. (J) P10, os olhos estão vermelhos. (K) P11, cerdas Orbital e ocellar (seta cinza), vibrissae, macrochaetae torácica (seta preta) e do Tarso cerdas são preto e visível. (L) P12(i), as pontas das asas são cinza. (M) P12(ii), todas as partes das asas são cinza (seta preta). (N) P13, as asas são completamente pretas. (O) P14, a cabeça e as pernas estão completamente escurecidas. (P) P15(i), o mecônio pode ser observado no abdômen dorsal (seta preta). (Q) P15(ii), a mosca é eclosing. Detalhes destes estágios foram descritos em Fukutomi et al. 19 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Desenvolvimento de pigmentação ao redor de um sensillum de companiform numa asa. Círculos indicam ΔODs individuais, e barras horizontais indicam médias. P10: n = 10, P11: n = 10, 12(i): n = 10, P15(i): n = 11, 3 h: n = 8, 24 h: n = 7, 7 dias: n = 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Componente de | |
Açúcar branco macio | 51,6 g |
Farinha de milho | g 172,4 |
Grãos de milho - C | g 86,4 |
Levedura de cerveja seca | 106 g |
Pó de ágar-ágar | g 35,28 |
ddH2O | 4000 mL |
Ferva por 30 min e deixe esfriar até 70 ° C. | |
Adicione 4 g de p-hidroxibenzoato de butilo dissolvido em 40 mL de etanol. | |
Misture bem e despeje 9 mL cada frascos plásticos (diâmetro 25 mm x altura 96 mm). |
Tabela 1. A composição dos alimentos de farinha de milho/açúcar/levedura/ágar padrão.
Componente de | Quantidade |
NaCl | 80 g |
KCl | 2 g |
Na2HPO4·12H2, O | 29 g |
KH2PO4 | 2 g |
ddH2O | até 10 L |
definir pH 7,4 |
Tabela 2. A composição de PBS (1x).
Estágio | Quer dizer de duração (h) | s.d. | n |
P1 - 2 | 1.7 | 0.65 | 16 |
P3 | 2.1 | 0.65 | 16 |
P4(i) | 2.1 | 1,69 | 19 |
P4(II) | 0.3 | 0.28 | 29 |
P5 - 6 | 5.0 | 3,07 | 30 |
P7 | 31,9 | 7,22 | 46 |
P8 | 9.6 | 2,81 | 57 |
P9 | 10.9 | 2.66 | 55 |
P10 | 11,7 | 2,96 | 39 |
P11 | 4.4 | 2,81 | 44 |
P12(i) | 1.1 | 0.76 | 44 |
P12(II) | 2.0 | 0.70 | 43 |
P13 | 2.2 | 0,68 | 10 |
P14 - 15(i) | 28,6 | 2.75 | 10 |
P15(II) | 1.4 | 0.87 | 10 |
Total | 121.7 |
Tabela 3. Medido durações dos estágios pupal de guttifera d..
OD | ΔOD | |||||||
Campaniform sensilum | Dica de veia longitudinal | Crossvein posterior | Controle | Campaniform sensilum | Dica de veia longitudinal | Crossvein posterior | ||
Indivíduo | (Ponto A) | (Ponto B) | (Ponto C) | (Ponto D) | (Ponto A - ponto D) | (Ponto B - ponto D) | (Ponto C - ponto D) | |
1 | 0,549 | 0.484 | 0.515 | 0.256 | 0,293 | 0.228 | 0,259 | |
2 | 0.529 | 0.489 | 0.516 | 0.254 | 0.275 | 0,235 | 0.262 | |
3 | 0.546 | 0,48 | 0.533 | 0,255 | 0.291 | 0,225 | 0.278 | |
4 | 0.583 | 0.496 | 0.566 | 0,255 | 0.328 | 0,241 | 0,311 | |
5 | 0.523 | 0.479 | 0.528 | 0,235 | 0,288 ponto | 0.244 | 0,293 | |
6 | 0.572 | 0.509 | 0.546 | 0,265 | 0,307 | 0.244 | 0,281 | |
7 | 0.568 | 0,511 | 0,56 | 0.256 | 0,312 | 0,255 | 0.304 | |
8 | 0,56 | 0.507 | 0.562 | 0,27 | 0,29 | 0,237 | 0.292 | |
9 | 0.551 | 0,485 | 0.569 | 0,259 | 0.292 | 0,226 | 0.31 |
Tabela 4. Medido ODs e ΔODs de d. guttifera adultos 7 dias após a eclosão.
Aqui descrevemos os protocolos para definição dos estágios pupal, removendo o casulo para observação detalhada, medindo durações dos estágios pupal e a medida da intensidade das manchas de preto em uma ala em d. guttifera. Esses protocolos podem ser aplicados para muitos Drosophila e relacionados a moscas espécies, especialmente com pigmentação de asa.
Observação em profundidade e descrição de eventos mais detalhados do desenvolvimento permitiria mais subdivisão dos estágios. Em muitos casos, um evento do desenvolvimento, exigindo dissecação ou seccionamento de uma pupa não é adequado para definição de estágio, porque um tem que matar uma pupa para estadiamento e posterior utilização de que o indivíduo é difícil. Para o uso de uma nova espécie de drosófila , um deve empregar distinguíveis de fora o casulo do desenvolvimento eventos como o primeiro passo. Dependendo da finalidade do estudo, um pode então subdividir mais fases baseadas em particular organogênese ou outros eventos do desenvolvimento.
Para comparação interespecífica de múltiplos estágios, uma dificuldade potencial é uma inversão da ordem do desenvolvimento eventos entre espécies (heterocronia27). Por exemplo, em d. melanogaster, o túbulo de Malpighi torna-se verde e em seguida o corpo amarelo se torna visível, Considerando que esta ordem pode ser invertida em algumas pupas de guttifera d.19. Nesse caso, a comparação estrita entre fases homólogas é difícil. Dependendo o fenômeno de interesse, um pode precisar de re-definir ou subdividir um estágio particular com base em um evento do desenvolvimento. Por exemplo, podemos mais ou menos selecione pupas de P5 - 6 e fazer comparação interespecífica de expressões de gene em asas pupal usando morfologia da asa como um indicador de temporização do desenvolvimento14.
Normalmente, demora de 10-30 min para remover o casulo. Se alguém quiser observar uma fase curta, pupas devem ser preparadas tendo em conta o tempo que passa durante a remoção do casulo. Por exemplo, se você quiser observar a P12(i) de d. guttifera, que tem apenas 1,1 h duração, preparando-se pupas no P11 daria um bom resultado.
Em nosso protocolo, papel de tecido umedecido é usado para o fundo das imagens pupal. Dependendo do estágio de observação e de estruturas quer mostrar em uma figura, pode-se usar papel de tecido branco ou preto. Para o P3 para a transição de P4(ii), a posição da bolha em pupa é importante para distinguir fases, e papel de tecido preto ajuda a observar a posição da bolha. Para as fases após P5, papel de tecido branco é melhor porque ajuda a observar o corpo amarelo, a cor dos olhos, cerdas e cor do corpo.
Bainbridge e Bownes17 calcula-se a duração da fase pupal da sua frequência de aparecimento. Sua mesa de preparo é o mais amplamente utilizado por d. melanogaster18. Para o seu método, eles preparados quatro garrafas de alimentos contendo cinco fêmeas adultas e cinco adultos do sexo masculino e os manteve no escuro, e em seguida pupas foram aleatoriamente retiradas uma garrafa a cada 11, 12, 13 e 14 dias após o início da postura de ovos. Eles contado o número de pupas em estágios particulares e calculadas as médias. O comprimento de cada fase de pupa pode ser estimado com base em dados da duração total do período pupal e estes dados de frequência. Um problema com este método é que não pode ser usada para estimar a duração exacta dos estágios pupal se cronometrando do desenvolvimento tende a ser sincronizada entre pupas.
Na verdade, nós tentamos Bainbridge e do Bownes método em d. guttifera, e obtivemos dados tendenciosos devido à sincronização entre pupas. Nós não pôde identificar a causa deste fenômeno, mas algumas possibilidades são pupas 1) manteve o ritmo circadiano de sua fase jovem e/ou 2) reagiram para as exposições à luz que ocorreu em observação. Portanto, decidimos para medir a duração do estágio real pela observação direta. Isso minimiza a polarização causada pelo ritmo circadiano.
O método descrito aqui é um método para quantificar o acúmulo extra de melanina, em manchas, em comparação com seus arredores de controle (ΔOD), subtraindo-se do OD da área de controle do OD da área local. Este método foi inspirado por um método para quantificar o conteúdo de DNA nuclear por coloração de Feulgen coloração e análise de imagem (densitometria28,.29). Como um dos potenciais problemas para a aplicação deste método para pigmentação de asa, ΔOD pode ser um valor negativo, especialmente quando uma pupa é muito jovem e não tem quase nenhuma pigmentação. Em fases mais tardias, pode haver alguma pigmentação na área de controle. O uso do OD simples da área local em si pode ser apropriado em vez de ΔOD dependendo da finalidade do estudo. No caso de d. guttifera, uso do OD simples em vez de ΔOD não alterou a tendência dos dados ou as conclusões do estudo.
Os autores não têm nenhum conflito de interesses.
Agradecemos a Sean B. Carroll e Thomas Werner para fornecer estoques voar, Naoyuki fusível para equipamentos, Byung Seok Jin por sua assistência na filmagem, Kiyokazu Agata para tutoria e Elizabeth Nakajima para edição inglesa. Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI 17K 19427 e Takeda Science Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Corn grits - C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits - C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
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