낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

대 식 세포는 타고 난 면역 세포 조직의 항상성 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 배열 하는 생리 기능 수에 관련 된. 이러한 셀의 다양 한 기능 활성화 상태로 또한 양극 화 라는 관련이 있습니다. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 현재 다차원 접근은 분극 환경 신호에 의해 제어 되는 방법을 설명 하는 데 필요한 인정 했다. 이 보고서에서 우리는 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명을 얻기 위해 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 대 식 세포 단백질 표정에-젤 분류 한 내용과 리스 C/트립 신-소화 세포 세포의 용 해에서 얻은의 레이블 없는 정량화를 기반으로 합니다. 우리는 또한 프로토콜 기반 솔루션에서 소화 하 고 전자 안으로 사용 하는 분류를 초점을 제공 합니다. 산소 농도 조직에 관련 된 환경 매개 변수, 때문에 우리는 어떻게 대기 구성 탐험이 프로토콜을 사용 또는 저 산소 환경에 영향을 미치는 macrophage 분극의 분류.

대 식 세포는 여러 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 조직의 항상성, apoptotic 세포의 제거를 포함 하 여, 세포 외 기질¹의 리 모델링에 이르기까지 생리 기능에 타고 난 면역 세포. 이 세포는 강한 phenotypic가 소성² 분극 라고도 하는 많은 가능한 활성화 상태를 변환 하는 특징. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학³의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 소위 M1/M2 이분법, 있는 m 1 프로-염증 성 나타내고 M2 염증 세포를 사용 하 여 이러한 분극 분류 제안 되었습니다. 이 모델은 급성 감염, 알레르기, 비만⁴같은 다양 한 병 적인 상황에 잘 맞는. 그러나, 만성 염증된 조직 및 암, 그것은 증명 되었습니다이 분류는 대 식 세포 특정 세포 환경^5,6, 에서 제공 하는 광범위 한 phenotypic 레 퍼 토리를 파악 수 없습니다. ⁷. 현재 일치는 대 식 세포 양극 화 더 나은 설명 다차원 모델을 사용 하 여 특정 microenvironmental 신호⁸을 통합 하는. 이 결론은 M1/M2 모델은 획득된 분극⁹에 비효율적 보여주는 인간 대 식 세포의 transcriptomic 분석을 통해 확인 됐다.

연구를 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명 프로토콜을 제공 하는 것을 목표로 제시. 우리는 다양 한 산소 레벨의 환경에 인간의 세포를 분화 하 고 레이블 없는 정량화를 수행 하기 위해 전체 대 식 세포 프로테옴에서 펩 티 드를 얻을 하는 방법을 설명 합니다. 이 정량화 다양 한 단백질의 표현 레벨의 비교를 허용 한다. 줄기 세포에 대 한 연구 환경 키 매개 변수¹⁰으로 산소의 중요성을 계시 했다, 우리는이 조직 매개 변수 인 간에 있는 대 식 세포 분극 영향을 미칠 수 어떻게 이해를 추구 합니다. 산소의 부분 압력에서에서 발견 되었습니다 범위 3 (총 대기 압력)의 20% ~ 20% (정확한 값은 약 18.6% 물의 존재 하면서 세포 문화 인큐베이터에서 일반적으로 사용 되는 약 해당 인체 에 계정).

이전 작품과 형태학의 조회¹¹ 지점과 이러한 차이 아마 부분적으로는 그들은 노출된¹²다른 산소 수준 때문에 치경 다 기능에서 중간 세포를 보이고 있다. 또한, 골 수 유래 세포 박테리아¹²낮은 산소 환경 노출 되 면 phagocytize를 증가 능력을 보여줍니다. 인간의 세포 THP1 차별화 된¹³, 반대의 효과가 발견 되었습니다 있지만 이러한 결과 산소 대 식 세포 생물학의 레 귤 레이 터는 고 인간의 세포에 분자 수준에서이 역할을 명확히 하는 데 필요한 아이디어를 지 원하는. 이전 연구에서 우리는 이러한 문제를 해결 하는 proteomics 접근 방식을 적용 했습니다. 단백질의 수천에 대 한 식 레벨을 동시에 측정 하 여 우리는 분극에 산소의 영향을 강조 하 고 새로운 분자 마커의 목록을 제공. 우리는 또한 일부 세포 기능에 이러한 연구 결과 관련 된 수 있습니다. 특히, 우리는 apoptotic 세포의 식 균 작용의 속도 증가 되었다 IL4/IL13-편광 세포에서 밝혀 proteomic 분석¹⁴ALOX15의 upregulation에 연결 했다 발견. 현재 연구에서 우리는 이러한 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

건강 하 고, 취소 확인 된 기증자 로부터 인간의 혈액 샘플 (LRSC) 인증된 프로토콜 (CODECOH DC-2018-3114)의 일환으로 EFS (프랑스 국가 혈액 서비스)에서 얻은 했다. 기증자는 혈액의 사용에 대 한 서명된 동의 했다.

1. 미디어와 버퍼 준비

1. 대 식 세포 매체 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA)]를 준비 하 고 37 ° c.에 따뜻한
2. 대 식 세포 매체 + AB 플라즈마 (SAB)에서 10% 인간의 혈 청을 준비, 그것은 (0.22 μ m 필터) 필터 다음 37 ° C에 따뜻한 (macrophage 매체 + 10%로이 SAB).
3. 정렬 버퍼 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) x [1]를 준비 하 고, 그것은 (0.22 μ m 필터), 필터링 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다

2. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) Leukoreduction 시스템 챔버 (LRSC)에서 격리

1. 밀도 그라데이션 세포 분리 솔루션의 15 mL를 넣어 ( 재료의 표참조) 50 mL에 원심 튜브는 LRSC를 수신 하기 전에 실내 온도 (RT)에 따뜻한 수 있습니다 그래서.
   참고: 밀도 온도에 따라 다릅니다. 이 단계 실시간에 equilibrate 수 있도록 사전에 수행 해야 합니다이 제품을 4 ° C에서 저장으로
2. 50 mL 원심 분리 관으로는 LRSC를 빈 1 x PBS의 최대 50 mL를 추가 하 고 혼합. 아주 천천히, 혼합 밀도 그라데이션 솔루션 2.1 단계 워밍업의 15 mL 위에 2.2 단계 준비의 25 mL를 추가 합니다.
   참고: 수 단계가 단계를 혼합 하지 않도록 주의 하십시오. 혈액이 단계의 어떤 소요도 없이 밀도 그라데이션 솔루션에 추가 되어야 합니다.
3. 휴식 없이 700 x g에 25 분 동안 원심 분리 튜브 두 원심
   참고: 조밀도 기온 변화도 원심 분리의 끝에, 맨 아래쪽에서 레이어는: 적혈구와 granulocytes 펠 릿, 밀도 그라데이션 솔루션 위상, PBMCs, 그리고 플라즈마의 레이어를 형성.
4. 피펫으로와 함께 그것을 발음 하지 않고 플라즈마 단계를 통과 하 고 새로운 50 mL 원심 분리 관으로 PBMC 레이어를 수집 합니다. 세척 단계 및 300 x g에서 10 분 원심 분리기로 서 PBMCs에 1 x PBS의 최대 50 mL를 추가 합니다.
5. 발음은 상쾌한 고 대 식 세포 매체의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.

3. 자기 라벨의 및 절연 CD14⁺ 세포 (Monocytes)

1. Malassez 챔버에 PBMCs를 계산 합니다. PBMCs (일반적으로 100 ~ 300 x 10⁶ 셀) 실험 수행에 필요한 금액을 철회, 원심 관, 및 300 x g에서 10 분 원심 분리기에 넣어.
2. 발음은 상쾌한 고 펠 릿 10 당 1.3 단계 준비 정렬 버퍼의 80 µ L에서 resuspend⁷ PBMCs. 추가 20 µ L 10 당 CD14 microbeads의⁷ PBMCs 믹스 잘 하 고 지속적인 동요에서 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.
3. 세척 단계 및 300 x g.에서 10 분 원심 분리기는 상쾌한 발음 하 고 펠 릿 당 10⁸ PBMCs 버퍼를 정렬의 500 µ L에서 resuspend 10⁷ PBMCs 당 버퍼를 정렬의 1 mL를 추가 합니다.
4. 자기 필드 구분 기호에서 열을 배치 합니다. 버퍼를 정렬의 3 mL와 함께 그것을 rinsing 하 여 열을 준비 합니다.
5. 열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 열 격리 되어야 하는 셀의 수에 따라 달라 집니다 (여기, 최대 10⁹ PBMCs LS 열 사용 됩니다). 포함 레이블된 셀 흐름을 통해 수집 합니다.
   참고:이 단계에서 시작, 모든 튜브 (부정과 긍정적인 선택) cytometry에 의해 나중의 다른 단계 검사에 대 한 보관 됩니다.
6. 열 정렬 버퍼의 3 x 3 mL을 씻어. 레이블이 없는 세포 단계의 3.12 같은 튜브를 통해 전달 수집 합니다. 추가 정렬 버퍼에 의해 세척 단계를 수행, 열 건조 하지 않도록 주의 하십시오. 열 컬렉션 튜브를 놓고 구분 기호에서 그것을 제거 합니다.
7. 버퍼 열에 정렬의 5 mL 플라스틱 즉시 단단히 열에 플런저를 추진 하 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시. CD14의 순도 높이기 위해⁺ 두 번째 열에 셀, eluted 분수 농축입니다.
8. 새로운 열 3.4 3.7 단계 반복 합니다.

4입니다. 도금 Monocytes의

1. Malassez 챔버에 monocytes를 계산 합니다. CD14의 순도 확인⁺ cytometry에 의해 세포. Monocytes는 실험에 필요한 금액을 철회 하 고 원심 분리 관에 넣어.
2. 10 분에 300 x g. Aspirate는 상쾌한 centrifuge 고 대 식 세포 매체에 monocyte 펠 릿 resuspend. 셀 접시와 SAB + 25 ng/mL 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 차별화를 유도 하는 것 1 h. 50 분 매체를 발음 하 고 대 식 세포 매체와 + 10%에 대 한 합의 하자.

5입니다. 하루 6 대 식 세포의 양극 화

1. 매체 발음 대 식 세포 매체 + 10% 대체 SAB 다양 한 자극으로. 예를 들어 10 ng/mL 인터페론 감마 (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide M1 양극 화를 (LPS) 또는 20 ng/mL 인터 루 킨 4 (IL4) + 20 ng/mL 인터 루 킨 (IL13) 13 m 2 양극 화에 대 한 추가 합니다.
   참고: 자극 사이 24 및 48 h 다른 테스트를 진행 하기 전에 수행할 수 있습니다.
2. 파견 솔루션 또는 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확.

6. 낮은 산소 조건 세포 배양

1. 4 단계에서 starting, monocytes 그리고 대 식 세포 hypoxic 조건 분석을 수행 하는 산소 제어 환경에서 유지 관리 합니다. Hypoxia 작업 역을 사용 하 여 실험 기간 동안 원하는 산소 부분 압력 하에서 세포를 유지 하기 위하여.
   참고: 낮은 산소 압력 하에서 작업 하는 경우 그것은 중요 한 모든 미디어와는 역 아래 세척 버퍼를 준비 하 고 액체에서 올바른 부분 압력을 얻기 위해 충분히 기다릴. 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에에서 10 mL PBS의 대략 2 h O₂ 부분 압력 시작 대기 압력에서 (우리 광섬유 산소 센서를 사용 하 여 측정)에 대 한 25 mmHg에 도달 필요 합니다. 많은 hypoxic 역 또는 incubators, 산소 압력 대기압의 백분율로 설정 됩니다. 정확한 측량이 필요한 경우 직접 mmHg에 산소 압력을 설정 하는 권한을 부여 하는 역을 사용 하 여이 낫다.

7. 세포와에서 젤 소화 (프로토콜 1)

참고: 에이 다음 섹션, 펩 티 드를 가져오고 LC-MS/MS 분석을 수행 하는 데 사용 하는 두 개의 프로토콜을 설명 합니다. 세포 세포의 용 해 및 젤에 분류 및 소화, 프로토콜 1 설명 하 고 솔루션에서 소화 및 분류는 전자 초점 메서드를 사용 하 여 솔루션에 셀 세포 프로토콜 2에 설명 합니다.

1. 세포 세포의 용 해 Laemmli 버퍼 [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7.5 %SDS, 37% 글리세롤, 33.3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol 파랑 0.2 %w / v]를 수행 합니다. 4-12% 두번째-트리 스 아크릴 아 미드 젤에 각 샘플에 대 한 300000 셀에 해당 하는 단백질을 로드 합니다.
2. 각 단백질 견본 그림3에서 exemplified 6 젤 대역으로 분할 될 수 있도록 전기 이동 이동의 기간을 제어 합니다.
3. (30% 에탄올 + 7.5% 초 산 20 분), 고정 솔루션 젤 수정 다음 얼룩 솔루션 (R-250 Coomassie 파란 45 분)을 추가 합니다. (30% 에탄올 + 7.5% 아세트산 밴드 표시 될 때까지) destaining 솔루션 추가 단백질 밴드 깨끗 한 메스로 절 개 하기 전에.
4. 주사위 각 500 µ L 튜브에 소개 전에 밴드 excised. 깨끗 한 유리 표면 keratins (이온된 수에 5 %SDS 솔루션 표면 청소를 사용할 수 있습니다)와 오염을 피하기 위하여 보증 된다.
5. 워시 젤 조각 한 워시 25 m m 염화 중 탄산염에 이기 (50 %v / v) 뒤 37 ° C에서 20 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염의 200 µ L에서 3 번. 10 분 100% 이기의 200 µ L 젤 조각을 탈수.
6. 각 젤 조각 10 m 55 m m iodoacetamide 25 m m 염화 중 탄산염 (200 µ L)에 실시간에 어둠 속에서 35 분 뒤 56 ° C (200 µ L)에서 45 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염에 DTT (dithiothreitol)를 품 어
7. 알을 막으려고 품 어 실시간 세척에서 10 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염에서 10 mM DTT의 200 µ L와 각 젤 조각 25 m m 염화 중 탄산염의 200 µ L에서 젤 조각 다음 10 분 동안 100% 이기의 200 µ L로 탈수.
8. 제조업체의 지침에 따라 트립 신/리스-C 믹스와 함께 37 ° C에서 하룻밤 단백질 소화.
9. 추가 하 여 15 분, 다음 15 분 동안 5% 포 름 산의 50 μ에 대 한 50% 이기의 50 μ 그리고 마지막으로, 50 μ 15 분 수영장에 대 한 100% 이기의 젤 조각에서 결과 펩 티 드를 추출 하 고 펩 티 드의 흡착을 제한 하는 낮은 흡수 관에 각 분수를 건조 하 고 샘플 손실입니다. 추가 분석까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

8. 단백질 추출 및 솔루션에 소화 (프로토콜 2)

1. 다음 세포의 용 해 버퍼의 150 µ L로 세포 세포의 용 해 (2 x 10⁶ 셀)를 수행:
   1. 7 M 요소, 2 M thiourea, 40mm 트리 스, 그리고 4% 챕 스, 프로 테아 제 억제제 (완전 한 미니, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일)와 보충.
2. thermoshaker와 RT에 30 분 동안 해결책 균질 20 분 RT 13,800 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 유지.
3. 2D 정리 키트와 오염 물질을 제거:
   1. 키트에는 precipitant 솔루션, 공동 비례적 솔루션, 워시 버퍼, 그리고 세척 첨가제 포함 되어 있습니다.
   2. Precipitant 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 15 분 추가 300 µ L 공동 비례적 솔루션의 ice에 품 어. 12000 x g 5 분에서 (적어도) 튜브를 원심. 작은 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 빠르게 물의 resuspension 또는 펠 릿의 분산을 피하기 위해 다음 단계를 진행 합니다. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
   3. 다시 뚜껑 경첩 및 펠 렛 튜브의 바닥에 남아 있는 액체를가지고 밖으로 직면 튜브 원심 짧은 펄스는 충분 합니다. 아니 보이는 액체 튜브에 남아 있어야 합니다.
   4. 펠 릿을 방해 하지 않고 공동 비례적 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 튜브 5 분 5 분 동안 원심 분리기에 대 한 얼음에 앉아 다음 제거 하 고 세척을 삭제 하자. 드 이온의 25 µ L를 추가 합니다. 각 동 5-10에 대 한 관. 펠 릿 분산 해야 하지만 물에 분해 되지.
   5. (사전-20 ° C에서 1 시간 이상 냉장) 워시 버퍼의 1 mL 및 세척 첨가물의 5 µ L를 추가 합니다. 와 동 펠 릿 완전히 분산 될 때까지 20-30 s 마다 10 분 이상 30 분 소용돌이-20 ° C에서 튜브를 품 어
      참고: 튜브 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최대 1 주일 최소한의 단백질 저하 또는 수정.
   6. 원심 관 (이상) 12000 × g에서 5 분 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 흰색 공 표시 되어야 합니다. (해당 되는 경우 펠 릿이 너무 건조 하 고, resuspend 하는 것이 어려울 것 이다) airdry 더 이상 5 분 동안에 펠 릿을 허용 합니다.
4. 8 M 요소와 0.1 M 염화 중 탄산염의 300 µ L에서 단백질 펠 릿을 resuspend. 1 분에 강하게 소용돌이 색도계 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.

9. 솔루션 소화 (프로토콜 2)

1. 700 mM DTT 수성 해결책의 5.1 µ L을 추가 하 여 이황화 다리를 감소 (최종 농도 12.5 m m)에서 resuspended 단백질에 8.4 단계와 thermoshaker와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 700 m m iodoacetamide 용액의 20.3 µ L을 추가 하 여 시스테인 잔류물을 알 (최종 농도 40 m m)는 thermoshaker와 함께 어둠 속에서 30 분 25 ° C에서 배양 하 고.
2. 샘플을 0.1 M 염화 중 탄산염의 990 µ L를 추가 합니다. 트립 신/리스-C 믹스 (효소: 기판 비율 1: 100 w/w)의 해당 볼륨을 추가 합니다. Thermoshaker는 37 ° C 하룻밤에 품 어.

10. 청소 카트리지 (프로토콜 2)

1. 젖은 1 열-볼륨 (1 mL) 메탄올의 카트리지. 1 열-볼륨 (1 mL) 80% 이기/HPLC 급 물 카트리지를 청소 하 고 흐름을 통해 삭제. 4 열-볼륨 (4 mL) 0.1% 포 름 산/HPLC-등급 물 카트리지 equilibrate 그리고 흐름을 통해 삭제.
2. 샘플 10% 개미 산 성 또는 pH 2-3 (pH 산도 표시기 확인)에 물 90 µ L 시 어 지 다. Acidified 샘플을 로드 하 고 흐름을 통해 수집 합니다. 자형 (not 유지 펩 티 드 포함) 다시 로드 합니다. 6 열-볼륨 (6 mL) 0.1% 포 름 산/HPLC-등급 물 카트리지를 씻어.
3. 0.1% 개미의 acid/50% 이기/HPLC 급 물 펩 티 드 1 열-볼륨 (1 mL)으로 카트리지의 elute. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송. 진공 농축 기 (150 x g, 160 mBar에서 진공)를 사용 하 여 샘플을 집중 한다.

11. 전자 초점 (프로토콜 2) 분류

참고: 펩 티 드 3에서 10의 pH 범위 13 cm 스트립 오프 젤 fractionator를 사용 하 여 그들의 전자 포인트에 따라 구분 됩니다. (아래 요약) 공급 업체에서 제공 하는 다음 프로토콜을 사용 했습니다.

1. 준비 하는 다음과 같은 솔루션: 솔루션은 (600 µ L의 글리세롤 솔루션, 60 OFFGEL 버퍼의 µ L, 초순의 4.34 mL) 및 솔루션 (해결책의 1.776 mL)-초순의 444 µ L B.
2. IPG 스트립, 프레임 및 제조업체의 지침에 따라 전극 조립.
3. B 각 잘으로 솔루션의 솔루션 B. 추가 40 µ L의 1.8 mL과 샘플 resuspend 각 잘으로 150 µ L의 샘플을 로드 합니다.
4. 펩 티 드의 기본 방법 선택: OG12PE00 (3100 OFFGEL 낮은 해상도 키트, pH 3-10, 12-잘 프레임 사용에 대 한 펩 티 드 OFFGEL 기본 방법. 이 방법은 완성 된 (~ 20 h) 되었습니다 때까지 기다립니다. 제대로 분류 관에 분수를 수집 합니다.

12. 청소 하버드 장치 열 역 C18 게시물-IEF (프로토콜 2)

1. 1%의 한 번에 몇 μ를 점진적으로 추가 TFA 각 분수 드 이온된 수에 샘플을 시 어 지 다 하. PH는 약 3 또는 아래 pH 종이 사용 하 여 확인 합니다.
2. 준비 하는 다음과 같은 솔루션: 솔루션 1 (이기의 5 mL, 10 µ L의 포 름 산, 초순 4.99 mL) 및 솔루션 2 (이기의 0.5 mL, 포 름 산, 초순 9.49 mL의 10 µ L).
3. -스핀 열 솔루션 1의 150 µ L 젖은. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s. 솔루션 2의 150 μ와 스핀 열 세척. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s.
4. 열을 통해 분수를 전달 합니다. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s. 솔루션 2의 150 μ 씻어. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s.
5. 솔루션 1의 50 μ와 분수 elute 90에 대 한 원심 분리기 s 750 x g.에서 한 번 더 이러한 단계를 반복.
6. 드라이-분수 (150 x g, 진공 160 mBar) 진공 집중 장치를 사용 하 여-80 ° C에서 저장

13. Proteomic 데이터와 생물 정보학¹⁸ 의 분석

1. 나노-LC MS에 의해 얻은 데이터를 분석/MS 질량 분석기 MaxQuant (버전 1.5.2.8) 등 정량화 소프트웨어 안드로메다 검색 엔진을 사용 하 여.
2. 틀린 발견 비율 (FDR) 1% 단백질 및 펩 티 드와 아미노산 7의 최소 길이를 설정 합니다. C 터미널으로 효소 특이성을 설정 Arg를 리스. 프롤린 채권에 2 놓친된 분열을 허용 합니다. 변수 수정으로 고정된 수정 및 N 맨끝 단백질 acetylation 및 메티오닌 산화 시스테인의 carbamidomethylation를 선택 합니다.
3. 추가 통계 분석 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다. FunRich 소프트웨어 (www.funrich.org/)를 사용 하 여 기능 농축 분석을 수행 합니다. 데이비드 소프트웨어 (https://david.ncifcrf.gov/)를 사용 하 여 유전자 온톨로지 농축 분석을 수행 합니다.

주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 차등 원심 분리 하 여 얻은에서 시작, 프로토콜 허용 CD14의 인구를 얻는⁺ monocytes cytometry (그림 1)에 의해 98% 이상의 평가 순도 함께. 이러한 monocytes secondarily 다양 한 분극 (그림 2)으로 구분 됩니다. 젤에 분류 선택, SDS 페이지 젤에 마이그레이션 원하는 밴드의 번호에 맞게 이며 밴드 excised 됩니다 (그림 3). 소화는 젤의 삭제 밴드에서 secondarily 수행 후는 펩 티 드 추출 됩니다. 나노-LC (액체 크로마토그래피)를 사용 하는 펩 티 드 분석-MS/MS 질량 분 서 계. MS/MS 스펙트럼 알려진된 펩 티 드 (그림 4A)에 대 한 얻은 스펙트럼의 주석에 따라 다양 한 단백질의 id를 제공 합니다. 단백질의 풍부의 정량화 다음 게시 된 소프트웨어를 사용 하 여 데이터베이스^15,16단백질에서 오는 확인 된 펩 티 드의 수량 관련 하 여 계산 됩니다. 이 프로토콜에서 젤 소화 약 4000 확인 된 단백질을 제공 하 고 동적 범위 커버 5 로그 눈금 단위 (그림 4B) 발견 되었습니다. 이 확인 된 단백질의 차동 식의 분석 결정 다른 산소 환경 하에서 다양 한 분극의 클러스터링을 사용할 수 있습니다.

이 방법으로, 우리 또한 최대-통제 된다 (그림 5, 표 1) 3%의 낮은 산소 농도에 노출 될 때 단백질의 클러스터를 인식할 수 있습니다. 소화의 효율성을 평가 하기 위해 불가능에 젤 프로토콜을 사용 하는 경우 우리 제안 인간의 세포 (그림 6A)에 적응 된 솔루션에서 소화 방법. 이 방법으로, 우리가 쉽게 (후에 솔루션 소화) 얻을 수 있습니다 분류, IEF 것 그 분류를 현명 하 게 의미 없이 3600 단백질의 증가이 (그림 6B).

그림 1: 표현의 CD14 PBMC 정렬 (왼쪽된 패널) 전후 (오른쪽 패널) 정렬 cytometry 분석 흐름 자석 구슬 선택 후 얻은 순도 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 두 개의 다른 분극에 대 한 획득된 형태학의이 보여주는 차별화 된 인간 세포의 단계 대조 이미지. 눈금 막대 나타냅니다 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 스테인드 Coomassie 파란의 이미징 젤 excised 됩니다 다양 한 밴드를 보여주는 [여기, M(Ø) 세포에서 6 밴드] 대 식 세포는 저 산소 환경에 노출의 5 분극에 대 한. IC = 면역성이 있는 복합물, DXM dexamethasone =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: MS/MS 스펙트럼 및 정량화. (A)는 MS/MS 스펙트럼의 예입니다. 여기에 표시 된 + 2 전기 요금 MS 스펙트럼에 m/z 597.29에 펩 티 드의 CID (충돌 유도 된 분리) 스펙트럼이 이다. 해당 시퀀스 CD58 단백질에서 Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg로이 스펙트럼에서 결정 했다. (B) 순위 (로그인₁₀ LFQ) 확인 된 단백질의 각 레이블 없는 정량화를 주문 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 단백질 표현 사용 하 여 차동 열 지도 대표 하는 모든 분극의 계층적 클러스터링 상태. 분석 3% O₂ 상태 (빨간 사각형)에 있는 모든 분극에 overexpressed 단백질의 클러스터를 보여준다. 색 눈금은 z-점수 (log2 강도)을 나타냅니다. 각 행은 단백질 이며 각 열은 샘플입니다. 이 그림은 이전 게시¹⁴에서 유래. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: SDS 페이지 및 크로마. (A)은 스테인드 SDS 페이지 젤 세포 동안 저하의 부재와 소화의 효율을 보여주는 솔루션에 소화 후 단백질 세포 세포의 용 해에서와. (B)에서 분별 없이 솔루션에 소화 후 얻은 크로마. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 각 분극 낮은 산소 긴장의 밑에 일반적인 인간의 세포에 대 한-표현된 단백질의 목록입니다.

Proteomics 전체 셀 또는 subcellular 구획에서 다른 단백질의 표현을 공부 하는 강력한 도구 이므로 세포 세포의 용 해 프로토콜의 최적화 및 단백질의 소화 연구의 숫자에 의해 수정 되었습니다. 젤 소화 (polyacrylamide 젤 매트릭스에 단백질의 소화)¹⁷, 솔루션¹⁸ 및 필터 지원 샘플 준비¹⁹에서 소화를 포함 하는 방법의 세 가지 주요 클래스 있다. 이 마지막 방법은 보편적으로 설명 하는 처음에 낮은 재현성 및 필터²⁰에 단백질의 가능한 손실에 보고 되었습니다. 젤 소화 가능한 경우 소화의 효율성을 평가 하는 것은 쉽게, 어렵고 불리 될 수 있는 강력한 방법입니다. 솔루션에서 소화 소화와 IEF 후 샘플을 청소 하지만이 가능성을 제공 합니다. 비교 될 때 이러한 두 메서드는 동일한 샘플 사이, IEF 분별 프로토콜 솔루션에 소화 보다 젤 소화²¹(와 같은 수의 분수) 확인 된 단백질의 높은 번호를 생성 합니다.

이 장점에도 불구 하 고 (특히 골수성 세포)에 세포내 프로 테아 제 때문에 솔루션 세포 중 가능한 단백질 저하를 고려할 필요가 있다. 이러한 기술을 기반으로 단백질 소화에서 중요 하 고 특정 분열 사이트 트립 신을 제시 하는 단백질을 분석할 수 이기도 합니다. 이 소화 제약을 해소 하지만 데이터 분석 단계와 생물 정보학 능숙해²²추가 내려 proteomic 접근을 사용 하 여 가능 하다. 다양 한 세포질 구획에서 단백질의 가용 화 세포 프로테옴의 통제 샘플링을 선도 하는 플라즈마 세포 막에서 특히 얻기도 어려울 수 있습니다. 샘플의 나노-LC-MS/MS 질량 분석기 분석으로 진행 하기 위해서는 펩 티 드 질량 분석기 사용에 따라 수의 충분 한 수량을 얻을 하는 것이 중요 하다 (일반적으로, 총 단백질 시작 있어야 조건에 대 한 적어도 1 µ g 및 그것은 암시 IEF와 함께 사용 하는 분수의 수에 따라이 수량 증가). 이 제약 조건은 단점은 공부 되 고 세포 인구 부족, 경우 proteomic 게놈 기술 원료의 증폭 가능 하다에서 분화 하 수 있습니다.

더 부유한과 동료²³ , 패 커와 Fuehr²⁴의 정액 작품 후에 세포 배양에서 산소의 중요성을 충분히 인식 하고있다 하지. 우리는 지금 그 접착, 수명과 호의 낮은 산소 농도에서 세포 배양 알고 있다. 이 줄기 세포 연구²⁵에 최대 중요성은 인식 된다. 제어 산소 조건에서 세포 배양에 대 한 주요 기술 문제는 전체 실험 기간 동안 원하는 산소 농도의 유지 보수 관련. 이 녹은 산소의 방출을 방지 하 고 사용 하 hypoxic 작업 스테이션의 낮은 산소 (글러브 박스와 챔버 처리)에서 세포의 조작을 허용 하 고 높은 산소 조건에 일시적인 폭발 방지 모든 미디어의 사전 부 화 필요 .

설명된 프로토콜의 인간 monocyte 파생 된 대 식 세포의 다양 한 분극 분자 서명이 서명에 산소 변조 효과 공부 하 사용 되었다. 이 연구에 그의 분극의 설명 통찰력을 부여 하고있다와 일부 기능 결과 드러났다. 예를 들어 우리는 efferocytosis에 관련 된 많은 단백질 저 산소 환경에 의해 변조 했다 발견. 설명 된 프로토콜에 따라이 proteomic 접근 방법과 이러한 신호 사용하실 수 있는 새로운 치료 접근¹⁴디자인 환경 매개 변수는 대 식 세포 기능을 수정 하는 방법을 탐구 하는 기회를 선물 한다.

이 작품에서 설명 proteomic 접근은 인간 대 식 세포 양극 화 연구의 분야에서 최근 몇 년 동안 사용 된 게놈 접근을 보완. Proteomics는 포스트 번역 상 수정 때문에 그들의 대응 mRNAs 보다 다른 식을 제시 하 고 새로운 바이오 마커의 발견으로 이어질 수 있습니다 단백질 정량화의 이점을 제공 합니다. 이러한 장점에도 불구 하 고 proteomic 데이터는 일반적으로 질량 분석, 매우 복잡 한 MS 스펙트럼 및 펩 티 드의 거짓인 긍정적인 탐지의 높은 감도 때문에 해석 하기가. 최근, 분석 소프트웨어는 이것을 방지 하기 위해 효율을 얻고 있다. Proteomics 또한 유전체학²⁶ 보다 낮은 재현성을 직면 하 고 다른 기술 (cytometry immunoblotting) 단백질의 양적 수정 확인을 사용 하 여 유효성 검사 단계와 연결 된 변화 상황 인 경우에 식 수준입니다.

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

오전 국가 리그 죄수 르 암과 라 Fondation 아크 부 라 검색 쉬르 르 암 라 하 여 젊은 그룹 지도자 프로그램 (ATIP/미래 Inserm-CNRS)에 의해 자금이 다. 우리는 생물학 플랫폼 (UTECHS MSBIO, 파스퇴르 연구소, 파리)에 대 한 질량 분석에서 Mariette Matondo 감사합니다. 우리는 원고의 그녀의 독서에 대 한 로렌 앤더슨을 감사합니다.