تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

نقدم بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين الضامة البشرية وتطبيق هذا على تحديد أثر بيئة منخفضة الأكسجين في الاستقطاب بلعم.

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة. وظائف مختلفة من هذه الخلايا تتصل بدولهم التنشيط، الذي يسمى أيضا الاستقطاب. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال البيولوجيا بلعم. من المسلم به حاليا أن اتباع نهج متعدد الأبعاد ضروري لوصف كيفية التحكم في استقطاب الإشارات البيئية. وفي هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مصمم للحصول على توقيع البروتين استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ويستند هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي للتعبير البروتين بلعم الحصول عليها من مجزأ بهلام ومحتوى تحلل الخلوية Lys ج/التربسين-يهضم خالية من التسمية. نحن نقدم أيضا بروتوكول استناداً إلى الهضم بالحل و isoelectric تركز تجزئة لاستخدامه كبديل لذلك. نظراً لأن تركيز الأكسجين معلمة بيئية ذات صلة في الأنسجة، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف تركيبة الغلاف الجوي كيف أو بيئة منخفضة أكسجين يؤثر على تصنيف بلعم الاستقطاب.

الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة، بما في ذلك إزالة الخلايا أبوبتوتيك وتجديد المصفوفة خارج الخلية¹. تتميز هذه الخلايا اللدونة المظهرية قوية² أن يترجم إلى إمكانية تنشيط العديد من دول، التي تسمى أيضا الاستقطابات. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال علم الأحياء بلعم³. اقترح تصنيف هذه الاستقطابات استخدام ما يسمى الانقسام M1/M2، الذي يمثل M1 برو التحريضية و M2 يمثل الضامة للالتهابات. يناسب هذا النموذج جيدا في مختلف الحالات المرضية مثل الالتهابات الحادة والحساسية والسمنة⁴. ومع ذلك، في الأنسجة الملتهبة المزمن والسرطان، وقد ثبت أن هذا التصنيف غير قادر على فهم مرجع المظهرية الواسعة التي الضامة الموجودة في بعض البيئات الخلوية^{5،6، 7}-توافق الآراء الحالي أن بلعم الاستقطاب أفضل وصف باستخدام نموذج متعدد الأبعاد لدمج إشارات محددة ميكرونفيرونمينتال⁸. وقد أكد هذا الاستنتاج من خلال تحليل ترانسكريبتوميك الضامة البشرية تبين أن طراز M1/M2 غير فعال في وصف الاستقطابات حصل على⁹.

قدمت الدراسة يهدف إلى توفير بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين من استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ونحن تصف كيفية التفريق الضامة البشرية في بيئات لمختلف مستويات الأوكسجين والحصول على الببتيدات من البروتين بلعم كاملة القيام بإجراء تقييم كمي خالية من التسمية. ويسمح هذا التحديد الكمي مقارنة مستويات التعبير من البروتينات المختلفة. كما كشفت الأبحاث حول الخلايا الجذعية أهمية الأوكسجين معلمة رئيسية بيئية¹⁰، نحن نسعى إلى فهم كيف يمكن أن تؤثر هذه المعلمة الأنسجة بلعم الاستقطاب في البشر. الضغط الجزئي للأكسجين قد وجد أن تتراوح من 3 إلى 20% (من مجموع الضغط الجوي) في جسم الإنسان، حيث يقابل 20% تقريبا لما يستخدم عادة في حاضنة ثقافة خلية (القيمة الصحيحة هي حوالي 18.6 في المائة مع مراعاة وجود الماء في الاعتبار).

وقد أظهرت الأعمال السابقة أن السنخية تختلف عن الضامة فراغي من الوظيفية والمورفولوجية نقطة المشاهدات¹¹ وأن هذه الاختلافات على الأرجح جزئيا نظراً لمستويات مختلفة من الأكسجين التي هي عرضه¹². وعلاوة على ذلك، تظهر المشتقة من نخاع العظم الضامة زيادة قدرة على فاجوسيتيزي البكتيريا عند تعرضها ل بيئة منخفضة أكسجين¹². تم العثور على تأثير معاكس الضامة البشرية المتباينة THP1¹³، ولكن هذه النتائج تدعم الفكرة القائلة بأن الأكسجين منظم للبيولوجيا بلعم وأن من الضروري توضيح هذا الدور على المستوى الجزيئي في الضامة البشرية. وفي دراسة سابقة، المطبقة لدينا نهج البروتيوميات لمعالجة هذه القضايا. عن طريق قياس مستويات التعبير لآلاف بروتينات في نفس الوقت، سلطت الضوء على تأثير الأكسجين على الاستقطاب، وقدمت قائمة بالمؤشرات الجزيئية الجديدة. تمكنا أيضا من ربط هذه النتائج ببعض وظائف الضامة. جدير بالذكر أن وجدنا أن معدل البلعمه لخلايا apoptotic قد زيدت في الضامة IL4/IL13-الاستقطاب، التي ترتبط ب upregulation ALOX15 كما يتبين من تحليل البروتين¹⁴. في هذه الدراسة، ونحن تصف كيفية إجراء هذا تحليل.

وتم الحصول على عينات الدم البشري (لرسك) من الجهات المانحة صحية، وإزالة الألغام التي تم تحديدها من EFS (خدمة الدم الوطنية الفرنسية) كجزء من وضع بروتوكول معتمد (DC كوديكوه-2018-3114). وقدم المانحون موافقة موقعة لاستخدام الدم.

1-وسائل الإعلام وإعداد المخزن المؤقت

1. إعداد متوسطة بلعم [جلوتاماكس ربمي + 10 مم حبيس + 1 x الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)] والحارة إلى 37 درجة مئوية.
2. إعداد متوسطة بلعم + 10% مصل البشرية من بلازما AB (SAB)، وتصفية (0.22 ميكرون فلتر)، ثم الحارة إلى 37 درجة مئوية (المشار إليها كالمتوسطة بلعم + 10% صاب الآخرة).
3. إعداد المخزن المؤقت الفرز [1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 0.5% ألبومين المصل البقري (BSA) + حمض 2 مم الإيثيلين (يدتا)]، وتصفية (0.22 ميكرون فلتر)، والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية.

2-عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) من دائرة نظام ليوكوريدوكشن (لرسك)

1. وضع 15 مل من كثافة الخلية التدرج الانفصال الحل (انظر الجدول للمواد) في 50 مل أنبوب الطرد المركزي حيث أنها يمكن أن الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الحصول لرسك.
   ملاحظة: تعتمد كثافة في درجة الحرارة. كما يتم تخزين هذا المنتج عند 4 درجة مئوية، هذه الخطوة يجب أن يتم في وقت مبكر حيث أنه يمكن أن حجته إلى الرايت
2. فارغة في لرسك في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة تصل إلى 50 مل من س 1 برنامج تلفزيوني، ومزيج. ببطء شديد، إضافة 25 مل المزيج أعدت أثناء الخطوة 2، 2 على رأس 15 مل حل متدرج الكثافة استعد أثناء الخطوة 2، 1.
   ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم خلط في المراحل أثناء هذه الخطوة. يجب إضافة الدم على حل متدرج الكثافة دون أي اضطراب في هذه المرحلة.
3. الطرد المركزي سواء أنابيب الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة في 700 x ز دون فواصل.
   ملاحظة: في نهاية استخدام الطرد المركزي التدرج في كثافة، الطبقات من الأسفل إلى الأعلى: الكريات الحمراء والمحببة تشكيل بيليه، مرحلة الحل متدرج الكثافة، طبقة ببمكس، والبلازما.
4. مع بيبيت، اجتياز المرحلة البلازما دون يسفط عليه وجمع طبقة ببمك في أنبوب 50 مل الطرد المركزي جديدة. إضافة تصل إلى 50 مل من 1 x PBS ببمكس كخطوة الغسيل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 x ز.
5. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 40 مل من بلعم المتوسطة.

3-العلامات المغناطيسية وعزل CD14 الخلايا⁺ (وحيدات)

1. عد ببمكس في دائرة مالاسيز. سحب مبلغ ببمكس اللازمة لإجراء التجربة (عادة 100 إلى 300 × 10⁶ خلايا)، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 x ز.
2. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 80 ميليلتر من المخزن المؤقت الفرز الذي أعد خلال الخطوة 1.3 كل 10⁷ ببمكس-إضافة 20 ميليلتر من ميكروبيدس CD14 كل 10⁷ ببمكس-مزيج جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت التحريض المستمر.
3. أضف 1 مل من الفرز العازلة الواحدة 10⁷ ببمكس خطوة الغسيل والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في غ. س 300 نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من الفرز العازلة الواحدة 10⁸ ببمكس.
4. ضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل. إعداد العمود قبل الشطف مع 3 مل من الفرز المخزن المؤقت.
5. تطبيق تعليق خلية على العمود. العمود يعتمد على عدد الخلايا لتكون معزولة (هنا، تستخدم الأعمدة ليرة سورية ليصل إلى 10⁹ ببمكس). جمع من خلال تدفق تحتوي على خلايا غير مسمى.
   ملاحظة: تبدأ في هذه الخطوة، يتم الاحتفاظ جميع الأنابيب (تحديدات سلبية وإيجابية) للتدقيق في وقت لاحق من الخطوات المختلفة بالتدفق الخلوي.
6. أغسل العمود مع 3 × 3 مل من الفرز المخزن المؤقت. جمع الخلايا غير مسمى تمر عبر الأنبوب نفسه من الخطوة 3، 12. تنفيذ خطوات الغسيل بإضافة المخزن المؤقت الفرز، ويجب الحرص على عدم الجاف للعمود الخاص بك. ضع أنبوب جمع تحت العمود وإزالته من الفاصل.
7. "الماصة؛" 5 مل من فرز المخزن المؤقت في العمود. فورا طرد الخلايا المسماة مغناطيسيا بدفع المكبس بقوة إلى العمود. لزيادة نقاء CD14⁺ الخلايا، والكسر التيد أثري فوق عمود ثاني.
8. كرر الخطوات من 3.4 إلى 3.7 مع عمود جديد.

4-طلاء وحيدات

1. عد وحيدات في دائرة مالاسيز. فحص نقاء CD14 الخلايا⁺ بالتدفق الخلوي. سحب مبلغ وحيدات اللازمة للتجربة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.
2. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x زاي Aspirate المادة طافية وريسوسبيند بيليه الوحيدات في المتوسط بلعم. لوحة الخلايا والسماح لهم بتسوية 50 دقيقة إلى حاء 1 نضح المتوسطة واستبدله مع بلعم المتوسطة + 10% صاب + تحفيز مستعمرة بلعم نانوغرام/مل 25 عاملاً (م-CSF) للحث على التفرقة.

5-استقطاب الضامة في يوم 6

1. نضح المتوسطة. استبدالها بالمتوسطة بلعم + 10% صاب مع المحفزات المختلفة. على سبيل المثال، قم بإضافة 10 نانوغرام/مل انترفيرون غاما (INFγ) + 1 نانوغرام/مليلتر lipopolysaccharide (LPS) للحصول على M1 الاستقطاب، أو 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين 4 (IL4) + 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين 13 (IL13) لاستقطاب M2.
   ملاحظة: يمكن أن يؤديها التحفيز بين 24 و 48 ح قبل الشروع في الاختبارات الأخرى.
2. حصاد الخلايا باستخدام حل ديتاتشينج أو مكشطة خلية.

6-خلية ثقافة تحت الظروف منخفضة الأكسجين

1. وبدءا من الخطوة 4، الحفاظ على وحيدات وثم الضامة في بيئة تسيطر عليها الأكسجين إلى القيام بتحليل حالة التاكسج. استخدام محطة عمل نقص بغية الحفاظ على الخلايا تحت ضغط جزئي الأكسجين المطلوب أثناء التجربة.
   ملاحظة: عند العمل تحت ضغط الأكسجين المنخفض، من المهم إعداد جميع وسائل الإعلام ومخازن الغسيل تحت المحطة والانتظار بما فيه الكفاية للحصول على الضغط الجزئي الصحيح في السائل. على سبيل المثال، يتطلب 10 مل من برنامج تلفزيوني في 60 مم طبق بيتري تقريبا 2 ح تصل إلى 25 مم زئبق للضغط الجزئي₂ س بدءاً من الضغط الجوي (كما أننا قد يقاس عليه استخدام جهاز استشعار الأوكسجين الألياف البصرية). في العديد من مراكز التاكسج أو الحاضنات، يتم تعيين ضغط الأكسجين كنسبة مئوية من الضغط الجوي. إذا كانت القياسات الدقيقة ضرورية، فمن الأفضل لاستخدام محطة الإذن لمباشرة تعيين ضغط الأكسجين في ملم زئبق.

7-تحلل وهضم في جل (البروتوكول الأول)

ملاحظة: ويرد في هذا المجال والمقاطع التالية، اثنين من البروتوكولات المستخدمة للحصول على الببتيدات وإجراء تحليل LC-MS/MS. بروتوكول 1 يصف تحلل الخلية وتجزئة في جل والهضم، ويصف البروتوكول 2 تحلل الخلية في حل تليها الهضم في الحل وتجزئة باستخدام أسلوب تركيز إيسويليكتريك.

1. إجراء تحلل الخلية في المخزن المؤقت لايملي [234 ملم تريس-HCL (6.8 درجة الحموضة)، 7.5% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 37%، 33.3% (v/v) β-ميركابتوثانول، بروموفينول الأزرق 0.2% w/v]. تحميل ما يعادل البروتين من الخلايا 300,000 لكل عينة على % 4-12 مكررا-تريس الاكريلاميد المواد الهلامية.
2. التحكم في مدة الهجرة الغرواني الكهربي للسماح لكل عينة البروتين تقسيمها إلى نطاقات هلام 6 كما يتضح في الشكل 3.
3. إصلاح الهلام مع تحديد حل (الإيثانول 30% + حمض الخليك 7.5% لمدة 20 دقيقة)، ثم إضافة الحل المصبوغة (R-250 أخذ 45 دقيقة باللون الأزرق). إضافة حل ديستاينينج (30% إيثانول + 7.5% الخليك حتى تظهر العصابات) قبل نسق نطاقات البروتين مع مشرط نظيف.
4. الزهر كل الفرقة قصت قبل الأخذ في 500 ميليلتر الأنابيب. له ما يبرره على سطح زجاج نظيفة لتفادي التلوث مع كراتين (يمكن استخدام الحل مخزونات النشر الاستراتيجي 5% في المياه لتنظيف السطوح).
5. تغسل شرائح جل 3 مرات في 200 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 25 مم لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها غسل واحد في 25 مم بيكربونات الأمونيوم والاسيتو الانيتريل (50% v/v). يذوي قطع جل مع 200 ميليلتر الاسيتو الانيتريل 100% لمدة 10 دقائق.
6. احتضان كل قطعة هلام مع 10 ملم DTT (ديثيوثريتول) في بيكربونات الأمونيوم 25 مم لمدة 45 دقيقة في 56 درجة مئوية (200 ميليلتر)، تليها إيودواسيتاميدي 55 ملم في بيكربونات الأمونيوم 25 مم (200 ميليلتر) لمدة 35 دقيقة في الظلام في الرايت
7. لإيقاف الألكلة، واحتضان كل قطعة هلام مع 200 ميليلتر من 10 مم DTT في بيكربونات الأمونيوم 25 مم لمدة 10 دقائق في غسل الرايت قطعة جل في 200 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 25 مم، ثم يذوي مع 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل 100% لمدة 10 دقائق.
8. هضم البروتينات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع مزيج التربسين/Lys-ج طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
9. استخراج الببتيدات الناتجة من قطع جل بإضافة 50 ميكروليتر من الاسيتو الانيتريل 50% لمدة 15 دقيقة، ثم 50 ميكروليتر من حمض الفورميك 5% لمدة 15 دقيقة، وأخيراً، 50 ميكروليتر من الاسيتو الانيتريل 100% لتجمع 15 دقيقة والجاف لكل جزء في أنابيب امتصاص منخفضة للحد من امتزاز الببتيدات و فقدان عينة. تخزين العينات في-80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.

8-البروتين الاستخراج والهضم في الحل (بروتوكول 2)

1. إجراء تحلل الخلية (2 × 10⁶ خلايا) مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت تحلل التالي:
   1. اليوريا 7 م وال م 2، 40 مم تريس والفصول 4%، وتستكمل مع مثبطات البروتياز (ميني كاملة، خالية من يدتا مثبط البروتياز كوكتيل).
2. مجانسة الحلول مدة 30 دقيقة في الرايت مع ثيرموشاكير. الطرد المركزي في 13,800 س ز لمدة 20 دقيقة RT وإبقاء المادة طافية.
3. إزالة الملوثات مع مجموعة أدوات تنظيف 2D:
   1. الطقم يحتوي على مرسب الحل والحل بريسيبيتانت المشارك والمخزن المؤقت للغسيل والغسيل المضافة.
   2. إضافة 300 ميليلتر من حل مرسب ومزيج جيد. تبني على الجليد ميليلتر 300 إضافة 15 دقيقة لحل بريسيبيتانت المشارك. الطرد المركزي في الأنابيب (على الأقل) في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق. بيليه صغيرة يجب أن تكون مرئية. تمضي بسرعة إلى الخطوة التالية لتجنب استثارة أو تشتت بيليه. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه.
   3. الطرد المركزي هذه الأنابيب مرة أخرى مع الغطاء المفصلي وبيليه يواجه إلى الخارج جلب أي سائل المتبقية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. نبض قصيرة غير كافية. ينبغي أن يكون هناك لا سائل مرئية المتبقية في الأنابيب.
   4. دون الإخلال بيليه، إضافة 40 ميليلتر لحل بريسيبيتانت المشارك. واسمحوا الأنبوب الجلوس على الجليد لأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق، ثم إزالة وتجاهل المياه والصرف الصحي. إضافة 25 ميليلتر من الماء المتأين الشطب. دوامة كل أنبوب ل s 5-10. يجب تفريق بيليه لكن لا تذوب في الماء.
   5. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (مبردة مسبقاً على الأقل 1 ح في-20 درجة مئوية) و 5 ميليلتر من مضافات الغسيل. دوامة حتى بيليه ينتشر تماما. احتضان هذه الأنابيب في-20 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة دوامة ل 20-30 s كل 10 دقيقة
      ملاحظة: يمكن تخزين الأنابيب في-20 درجة مئوية لتصل إلى 1 الأسبوع مع تدهور البروتين الحد الأدنى أو تعديله.
   6. الطرد المركزي في الأنابيب (على الأقل) في 12,000 × ز 5 كحد أدنى بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. بيليه أبيض يجب أن تكون مرئية. تسمح بيليه إلى أيردري لمدة لا تزيد عن 5 دقائق (إذا كان بيليه الجاف للغاية، فإنه سوف يكون من الصعب على ريسوسبيند).
4. ريسوسبيند بيليه البروتين في 300 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم اليوريا و 0.1 م م 8. الدوامة بشدة للحد الأدنى 1 تحديد تركيز البروتين مقايسة اللونية باستخدام.

9-في حل الهضم (بروتوكول 2)

1. تقليل الجسور ثنائي كبريتيد بإضافة ميليلتر 5.1 حل مائي DTT 700 مم (التركيز النهائي 12.5 ملم) للبروتينات ريسوسبينديد من الخطوة 8.4 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع ثيرموشاكير. الكيلاتي بقايا السيستين بإضافة ميليلتر 20.3 حل مائي إيودواسيتاميدي 700 مم (التركيز النهائي 40 مم) وتفرخ عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام مع ثيرموشاكير.
2. إضافة ميليلتر 990 من بيكربونات الأمونيوم 0.1 M للعينة. إضافة وحدة تخزين المطابقة من مزيج التربسين/Lys-ج (نسبة الإنزيم: الركيزة 1: 100 w/w). احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع ثيرموشاكير.

10-تنظيف خرطوشة (بروتوكول 2)

1. ويت خرطوشة مع 1 حجم العمود (1 مل) من الميثانول. تنظيف الخرطوشة مع 1 حجم العمود (1 مل) من 80% من المياه الاسيتو الانيتريل/[هبلك]-الصف وتجاهل في التدفق من خلال. حجته الخرطوشة مع 4 أحجام العمود (4 مل) 0.1% حمض الفورميك/[هبلك]-الصف المياه وتجاهل في التدفق من خلال.
2. أسيديفي العينات مع ميليلتر 90 من حمض الفورميك 10% أو المياه على درجة الحموضة 2-3 (التحقق من درجة الحموضة بمؤشر الرقم الهيدروجيني). تحميل عينات المحمضة، وجمع في التدفق من خلال. إعادة تحميل--التدفق عبر (يحتوي على الببتيدات الإبقاء على عدم). أغسل الخرطوشة مع 6 حجم العمود (6 مل) 0.1% حمض الفورميك/[هبلك]-الصف المياه.
3. الوت الببتيدات من الخرطوشة مع العمود 1-المجلدات (1 مل) من 0.1% acid/50% الفورميك الاسيتو الانيتريل/[هبلك]-الصف المياه. نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تركيز العينة باستخدام مركز فراغ (150 س ز، فراغ في 160 [مبر]).

11-وجود طريق Isoelectric التركيز (بروتوكول 2)

ملاحظة: يتم فصل الببتيدات وفقا لجهات إيسويليكتريك باستخدام فراكتيوناتور-جيل على شريط 13 سم تغطي نطاق درجة حموضة من 3 إلى 10. ونحن تستخدم البروتوكول التالية المقدمة من المورد (الملخصة أدناه):

1. إعداد الحلول التالية: حل (600 ميليلتر والغليسيرول الحل، 60 ميليلتر من المخزن المؤقت أوفجيل، 4.34 مل من الماء عالي النقاوة) وحل ب (1.776 مل الحل (أ)) و 444 ميليلتر من الماء عالي النقاوة.
2. قم بتجميع شرائط IPG، والإطارات، واقطاب وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
3. ريسوسبيند العينة مع 1.8 مل من حل ب إضافة 40 ميليلتر من حل ب في كل بئر. تحميل 150 ميليلتر من العينة في كل بئر.
4. حدد الأسلوب الافتراضي الببتيدات: OG12PE00 (أوفجيل الأسلوب الافتراضي الببتيدات للاستخدام مع مجموعة 3100 أوفجيل منخفضة الدقة، الأس الهيدروجيني 3-10، 12-جيدا إطارات. الانتظار حتى هذا الأسلوب تم الانتهاء (ح ~ 20). جمع الكسور في أنابيب المسماة بشكل صحيح.

12-تنظيف جامعة هارفارد جهاز عمود C18 عكس وظيفة الضمنية (بروتوكول 2)

1. إضافة ميكروليتر قليلة تدريجيا في وقت من 1% تفا في الماء المتأين الشطب لكل جزء أسيديفي العينة. التحقق من استخدام ورق الأس الهيدروجيني pH هي حوالي 3 أو أقل.
2. إعداد الحلول التالية: 1 (5 مل من الاسيتو الانيتريل، 10 ميليلتر من حمض الفورميك، 4.99 مل من الماء عالي النقاوة) الحل والحل 2 (0.5 مل من الاسيتو الانيتريل، 10 ميليلتر من حمض الفورميك، 9.49 مل من الماء عالي النقاوة).
3. قبل الرطب عمود الدوران مع 150 ميليلتر من الحل 1. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال. أغسل العمود تدور مع 150 ميكروليتر من الحل 2. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال.
4. يمر الكسر من خلال العمود. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال. يغسل مع 150 ميكروليتر من الحل 2. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 × ز وتجاهل التدفق من خلال.
5. الوت الكسر مع 50 ميكروليتر من الحل 1. أجهزة الطرد المركزي ل 90 s في 750 x زاي كرر هذه الخطوات مرة أخرى.
6. جاف-الكسر باستخدام مركز فراغ (150 س ز، فراغ 160 [مبر]) وتخزينها في-80 درجة مئوية

13-تحليل بيانات البروتين والمعلوماتية الحيوية¹⁸

1. مرض التصلب العصبي المتعدد الشامل مطياف استخدام البرمجيات القياس الكمي مثل ماكسكوانت (الإصدار 1.5.2.8) ومحرك البحث أندروميدا/تحليل البيانات التي حصل عليها MS نانو-LC.
2. تعيين معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت) إلى 1% لكل من البروتينات والببتيدات وطول الحد أدنى من الأحماض الأمينية 7. تعيين خصوصية الإنزيم كمحطة ج إلى الأرجنتين و Lys. تسمح 2 الانشقاقات الضائعة في سندات برولين. حدد كارباميدوميثيليشن سيستئين كتعديل ثابت وأكسدة acetylation والميثيونين البروتين الطرفي ن كمتغير التعديلات.
3. كذلك تحليل البيانات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. إجراء تحليل لإثراء وظيفي باستخدام برنامج فونريتش (www.funrich.org/). إجراء تحليل إثراء علم الوجود جينات باستخدام البرمجيات ديفيد (https://david.ncifcrf.gov/).

بدءاً من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) التي تم الحصول عليها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، يسمح البروتوكول الحصول على عدد سكانها CD14⁺ وحيدات مع نقاء المقررة أكثر من 98 في المائة من التدفق الخلوي (الشكل 1). هذه وحيدات تختلف بشكل ثانوي نحو استقطابات مختلفة (الشكل 2). عندما يتم اختياره تجزئة في جل والهجرة في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية تكييف للحصول على عدد الأشرطة المطلوب، والعصابات التي اقتطعت (الشكل 3). ثانوي يتم الهضم في نطاقات قصت جل، ثم يتم استخراج الببتيدات. الببتيدات يتم تحليلها باستخدام نانو-LC (كروماتوغرافيا سائلة)-كتلة MS/MS مطياف. مرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف إعطاء هوية البروتينات المختلفة وفقا لشروح الأطياف الحصول على الببتيدات المعروف (الشكل 4 أ). ثم يتم حساب التقدير الكمي للوفرة من البروتين فيما يتعلق بكمية محددة الببتيدات قادمة من البروتين باستخدام نشر البرمجيات وقواعد البيانات^15،16. يعطي هذا البروتوكول مع الهضم-جيل حوالي 4000 من البروتينات التي تم تحديدها، وتم العثور على النطاق الديناميكي لتغطية 5 وحدات المقياس اللوغاريتمي (الشكل 4 باء). يمكن استخدام تحليل التعبير التفاضلية من هذه البروتينات المحددة لتحديد تجميع استقطابات مختلفة ضمن بيئات مختلفة من الأكسجين.

بهذه الطريقة، يمكن أن ندرك أيضا مجموعات من البروتينات التي تصل-ينظم عند التعرض لتركيز الأوكسجين منخفض من 3% (الشكل 5، الجدول 1). لتقييم كفاءة الهضم، وغير ممكن عندما يستخدم بروتوكولا في جل، اقترحنا طريقة هضم في الحل قد تم تكييفه للبشرية الضامة (الشكل 6A). بهذه الطريقة، يمكننا بسهولة الحصول على (بعد الهضم بالحل) تحديد البروتينات 3600 دون تجزئة، بمعنى أن وجود الإرادة الضمنية معقولة زيادة هذا العدد (الشكل 6B).

رقم 1: التدفق الخلوي تحليل التعبير CD14 من ببمك قبل الفرز (اللوحة اليمنى) وبعد الفرز (اللوحة اليمنى) تبين نقاء تم الحصول عليها بعد التحديد المغناطيسي الخرز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: الصور المرحلة-على النقيض من الضامة البشرية المتباينة إظهار التباين في مورفولوجيس التي تم الحصول عليها لاثنين من استقطابات مختلفة. يمثل الشريط مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تصوير لأخذ الأزرق الملون جل عرض النطاقات المختلفة التي سوف تكون اقتطعت [هنا، والعصابات 6 في الضامة M(Ø)] لاستقطابات 5 من الضامة يتعرض لبيئة منخفضة أكسجين. IC = مأمن المجمعات، DXM = الديكساميتازون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: الطيف MS/MS والقياس الكمي- (أ) مثال الطيف MS/MS. يظهر هنا هو الطيف CID (التفكك الناجم عن الاصطدام) من الببتيد وجدت في m/z 597.29 على طيف مرض التصلب العصبي المتعدد مع شحنة كهربائية من + 2. تم تحديد التسلسل المقابلة من هذا الطيف فالالاجلوليوجلواسنسيرجلوفيارج من البروتين CD58. (ب) رتبة أمرت خالية من تسمية التحديد الكمي لكل من البروتينات التي تم تحديدها (تسجيل₁₀ لفق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: خريطة الحرارة يمثل تجميع التسلسل الهرمي لاستقطاب جميع الدول استخدام خلطات أعرب البروتينات. ويكشف تحليل مجموعة من البروتينات overexpressed في كل الاستقطابات في الشرط₂ 3% O (المستطيل الأحمر). مقياس اللون يمثل إحراز-z (كثافة log2). بروتين من كل صف وكل عمود عينة. وهذا الرقم قد نشأت من منشور سابق¹⁴. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و chromatogram. (أ) الملطخة بالفضة الجل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع البروتين من تحلل الخلية وبعد الهضم بالحل تبين عدم وجود تدهور خلال تحلل وكفاءة الهضم. (ب) تشروماتوجرام التي تم الحصول عليها من بعد الهضم بالحل دون تجزئة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: قائمة البروتينات المعلنة المفرط للبشرية الضامة الشائعة لكل الاستقطاب تحت توتر الأوكسجين منخفض.

لأن البروتيوميات أداة قوية لدراسة التعبير عن البروتينات المختلفة من خلية كاملة أو مقصورات سوبسيلولار، الأمثل للبروتوكول تحلل الخلية وهضم البروتينات قد عولجت بعدد من الدراسات. وهناك ثلاث فئات رئيسية من الأساليب، التي تشمل في جل الهضم (هضم البروتينات في مصفوفة جل polyacrylamide)¹⁷، الهضم في حل¹⁸ والمدعومة بتصفية نموذج إعداد¹⁹. أبلغ هذا الأسلوب الأخير، في البداية وصفت العالمي، يحمل إمكانية تكرار نتائج منخفضة واحتمال فقدان البروتينات في تصفية²⁰. الهضم في جل هو وسيلة قوية يمكن أن تكون مضيعة للوقت وغير ملائم في هذا تقييم كفاءة الهضم ليس من السهل، إذا كان ذلك ممكناً. يتيح هذا الإمكانية الهضم في حل لكن يتطلب تنظيف العينات بعد الهضم والضمنية. عند مقارنة هاتين الطريقتين بين نفس العينة، غلة الهضم في الحل مع الانبعاث تجزئة البروتوكول عدد أعلى من البروتينات المحددة (مع نفس العدد من الكسور) مما في جل الهضم²¹.

وعلى الرغم من هذه الميزة، من الضروري النظر في تدهور البروتين الممكنة خلال تحلل بالحل بسبب البروتياز داخل الخلايا (لا سيما في الخلايا النقوي). كما أنها هامة نضع في اعتبارنا أن هذه التقنيات تقوم على هضم البروتين وفقط قادرة على تحليل البروتينات تقديم التربسين مواقع محددة من الانقسام. من الممكن استخدام نهج من أعلى إلى أسفل البروتين أن يخفف من هذا القيد الهضم لكنه يضيف خطوات تحليل البيانات و الموارد المعلوماتية²². أيضا يمكن أن تكون سولوبيليزاتيون للبروتينات من المكونات الخلوية المختلفة يصعب الحصول عليها، لا سيما من أغشية البلازما، مما أدى إلى أخذ عينات غير المنضبط للبروتين الخلوي. من أجل المضي قدما في إجراء تحليل مطياف كتلة نانو-LC-MS/MS للعينات، من المهم الحصول على كمية كافية من الببتيدات، التي يمكن أن تعتمد على مطياف كتلة المستخدمة (عادة، ابتداء من البروتين الكلي يجب أن يكون على الأقل 1 ميكروغرام لشرط، و هو يعني ضمناً لزيادة هذه الكمية وفقا لعدد الكسر المستخدمة مع الضمنية). قد يكون هذا القيد عيب إذا كان السكان خلية يجري درس النادرة، الذي يميز البروتين من تقنيات الجينوم تضخيم مواد الخام التي من الممكن.

حتى بعد الأشغال المنوي الأغنى والزملاء²³ و باكر وفويهر²⁴، اعترف غير كاف أهمية الأوكسجين في الثقافات الخلية. ونحن نعلم الآن أن استزراع الخلايا تحت تركيزات منخفضة الأكسجين تفضل الالتصاق وعمر وشعبة. المسلم به أن هذا الأمر يكتسي أهمية قصوى في بحوث الخلايا الجذعية²⁵. المسألة التقنية الرئيسية للثقافات الخلية تحت ظروف الأوكسجين التي تسيطر عليها تتصل بالحفاظ على تركيز الأكسجين المطلوب خلال التجربة بأكملها. وهذا يتطلب ما قبل الحضانة لجميع وسائل الإعلام لمنع الإفراج عن الأوكسجين الذائب واستخدام محطات العمل التاكسج لتسمح بالتلاعب بالخلايا تحت الأوكسجين منخفض (تجهيز غرفة مع صندوق قفازات) ومنع المعرض عابرة للظروف الأكسجين المرتفعة .

وكان استخدام البروتوكول وصف الحصول على توقيعات الجزيئية الاستقطابات المختلفة للبشرية الضامة المشتقة من الوحيدات ودراسة آثار التحوير الأكسجين في هذه التوقيعات. هذه الدراسة قد أعطى فكرة عن وصف هذه الاستقطابات وقد كشفت عن بعض الآثار الفنية. على سبيل المثال، نجد أن العديد من البروتينات المشاركة في افيروسيتوسيس كانت عن طريق بيئة منخفضة أكسجين التضمين. ويقدم هذا النهج البروتين البشري، استناداً إلى بروتوكول وصف، فرصة لاستكشاف كيفية تعديل البارامترات البيئية وظائف بلعم وكيف يمكن استخدام هذه الإشارات تصميم جديد النهج العلاجي¹⁴.

البروتين والنهج الوارد وصفها في هذا العمل مكمل لنهج الجينومي التي استخدمت خلال السنوات الأخيرة في مجال الدراسات الاستقطاب بلعم البشرية. البروتيوميات توفر ميزة تحديد مقدار البروتين، الذي قد يقدم تعبير مختلفة مما بهم مرناس المقابلة بسبب التعديلات بوستترانسلاشونال وتؤدي إلى اكتشاف المؤشرات الحيوية الجديدة. وعلى الرغم من هذه الميزة، بيانات البروتين عادة ما يكون من الصعب تفسير، جزئيا بسبب حساسية عالية من الطيف الكتلي، مما يؤدي إلى معقدة جداً مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف والكشف إيجابية كاذبة من الببتيدات. في الآونة الأخيرة، اكتسب برمجيات تحليل الكفاءة بغية منع هذا. حتى لو كان وضع متغير، البروتيوميات أيضا تواجه إمكانية تكرار نتائج أقل من علم الجينوم²⁶ ويترافق مع خطوات التحقق من الصحة باستخدام تقنيات أخرى (التدفق الخلوي، إيمونوبلوتينج) للتأكد من إجراء التعديلات الكمية من البروتين مستويات التعبير.

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

صباحا هو الممول من قبل "برنامج زعيم مجموعة الشباب" (ATIP/افينير Inserm-يزار)، بلوس أنجليس الرابطة الوطنية le مكافحة السرطان ولوس أنجليس "مؤسسة قوس" من أجل la بحوث sur le السرطان. ونحن نشكر مارييت ماتوندو من "قياس الطيف الكتلي" لمنهاج علم الأحياء (أوتيتشس مسبيو، ومعهد باستور، باريس). ونحن نشكر لورين أندرسون للقراءة لها من المخطوطة.