ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.

המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת מעורב מספר פונקציות פיזיולוגיים ועד תגובות למחלות זיהומיות רקמות הומאוסטזיס. הפונקציות השונות של תאים אלה קשורים הברית ההפעלה שלהם, אשר נקרא גם קיטוב. תיאור מדויק מולקולרית של polarizations שונים אלה היא עדיפות בתחום הביולוגיה מקרופאג. זה כרגע הוא הודה כי בגישה רב-ממדי הכרחי לתאר איך קיטוב נשלטת על ידי אותות סביבתיים. בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול המיועד להשיג את החתימה פרוטיאומיה מבנית של polarizations שונים ב מקרופאגים אנושי. פרוטוקול זה מבוסס על כימות ללא תווית של ביטוי חלבון מקרופאג המתקבל בבית-ג'ל fractionated ותוכן פירוק התאית Lys C/טריפסין-מעוכלים. אנו מספקים גם פרוטוקול מבוסס על עיכול תוך-פתרון ו לגירויי כאב תוך התמקדות fractionation להשתמש כחלופה. בגלל ריכוז חמצן הוא פרמטר הסביבתיים הרלוונטיים ברקמות, אנו משתמשים בפרוטוקול זה לחקור את הרכב האטמוספירה איך או סביבה חמצן נמוך משפיע על הסיווג של מקרופאג קיטוב.

המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת מעורב מספר פונקציות פיזיולוגיים ועד רקמות הומאוסטזיס, כולל הסרה של מוות תאים ו remodelling של מטריצה חוץ-תאית¹תגובות למחלות זיהומיות. תאים אלה מאופיינים חזק פנוטיפית² שמתרגמת מדינות רבות הפעלה אפשריים, אשר נקראים גם polarizations. תיאור מדויק מולקולרית של polarizations שונים אלה היא עדיפות בתחום הביולוגיה מקרופאג³. זה הוצע לסווג אלה polarizations באמצעות הדיכוטומיה M1/M2 כביכול, שבו M1 מייצג פרו דלקתיים ו M2 מייצג מקרופאגים אנטי דלקתיות. מודל זה מתאים גם מצבים פתולוגיים שונים כמו זיהומים חריפים, אלרגיה, השמנת יתר⁴. עם זאת, רקמות דלקתי כרוני, סרטן, זה הוכח כי סיווג זה אינו מסוגל להבין את הרפרטואר פנוטיפי הרחב שמציגים מקרופאגים מסוימים סביבות הסלולר^{5,6, 7}. הקונצנזוס הנוכחי הוא מקרופאג קיטוב יותר מתואר באמצעות מודל רב-ממדי כדי לשלב את אותות מסוימים microenvironmental⁸. מסקנה זו אושרה באמצעות ניתוח transcriptomic של מקרופאגים האנושי מראה כי המודל M1/M2 הוא יעיל בתיאור שהושג polarizations⁹.

המחקר הציג שואפת לספק פרוטוקול להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של polarizations שונים ב מקרופאגים אנושי. אנחנו מתארים כיצד להבדיל מקרופאגים האנושי בסביבות של רמות החמצן שונים ולקבל פפטידים פרוטאום מקרופאג כל לביצוע של כימות ללא תווית. כימות זו מאפשרת ההשוואה של רמות ביטוי של חלבונים שונים. כמו מחקר בתאי גזע חשף את חשיבות החמצן הסביבה פרמטר מפתח¹⁰, אנו שואפים להבין כיצד פרמטר רקמות יכולים להשפיע על קיטוב מקרופאג בבני אדם. לחץ חלקי של חמצן נמצאה בטווח מ-3 עד 20% (לחץ אטמוספרי סך) בגוף האדם, שבו 20% מקביל בערך מה הוא נפוץ של חממה התרבות התא (הערך המדויק הוא בסביבות 18.6% בזמן נטילת הנוכחות של מים בחשבון).

עבודה קודמים הראו כי מכתשי נבדלים בין-תאי מקרופאגים מ פונקציונלי, נקודת מורפולוגי של נופים¹¹ וכי ההבדלים הללו הם כנראה חלקית עקב רמות החמצן שונים שאליהם הם חשופים¹². יתר על כן, מקרופאגים הנגזרות מח עצם מראים יכולת מוגברת כדי phagocytize חיידקים כאשר הם נחשפים בסביבת חמצן נמוך¹². האפקט ההפוך נמצאה עבור מקרופאגים האנושי הבדיל THP1¹³, אך תוצאות אלו תומך את הרעיון כי חמצן הוא מווסת של ביולוגיה מקרופאג וכי זהו צורך להבהיר את התפקיד הזה ברמה המולקולרית בתוך המקרופאגים אנושי. במחקר הקודם, אנחנו החלת בגישה פרוטאומיקס לטיפול בבעיות אלה. על ידי מדידת רמות הביטוי אלפי חלבונים בו-זמנית, אנו הדגיש את ההשפעה של חמצן על קיטוב, מספק רשימה של סמנים מולקולריים חדשים. הצלחנו גם להתייחס ממצאים אלה כמה פונקציות מקרופאגים. ראוי לציין, מצאנו כי הקצב של phagocytosis של מוות תאים הוגדל ב IL4/IL13-מקוטב מקרופאגים, אשר היה קשור קולטנים upregulation של ALOX15 כפי ניתוח פרוטיאומיה מבנית¹⁴. במחקר הנוכחי, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח כזה.

דגימות דם אדם (LRSC) מתורמים בריאים, מבטל את מזוהה, התקבלו EFS (שירות דם הלאומית הצרפתית) במסגרת פרוטוקול מורשה (CODECOH DC-2018-3114). תורמים נתן הסכמה חתומים לשימוש של דם.

1. הכנת מאגר ומדיה

1. להכין המדיום מקרופאג [RPMI glutamax + 10 מ מ HEPES + חומצות אמינו שאינן הכרחיות x 1 (NEAA)], לחמם את זה ל- 37 מעלות צלזיוס.
2. להכין את מקרופאג בינוני + 10% בנסיוב אדם מ AB פלזמה (SAB), סינון (0.22 מסנן מיקרומטר), ואז לחמם את זה עד 37 ° C (המכונה מקרופאג בינוני + 10% SAB להלן).
3. הכנת המאגר המיון [1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + 0.5% אלבומין שור (BSA) + 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)], סינון (מסנן מיקרומטר 0.22) ולתחזק אותו ב 4 º C.

2. בידוד של תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) של מערכת Leukoreduction קאמרית (LRSC)

1. לשים 15 מ"ל של צפיפות תא הדרגתיות ההפרדה פתרון (ראה טבלה של חומרים) ב- 50 מל צנטריפוגה צינור אז זה יכול לחמם לטמפרטורת החדר (RT) לפני קבלת את LRSC.
   הערה: צפיפות תלוי בטמפרטורה. ככל מוצר זה מאוחסן ב 4 ° C, שלב זה חייב להיעשות מראש אז זה יכול equilibrate כדי RT.
2. לרוקן את LRSC לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ ל, להוסיף עד 50 מ של 1 x PBS ומערבבים. לאט מאוד, להוסיף 25 מ של המיקס שהוכנו במהלך שלב 2.2 מעל 15 מ"ל של צפיפות פתרון הדרגתי להתחמם במהלך שלב 2.1.
   הערה: יש להיזהר לא לערבב את השלבים במהלך שלב זה. יש להוסיף את הדם על הפתרון הדרגתיות צפיפות ללא כל הפרעה של שלב זה.
3. Centrifuge שני צינורות צנטריפוגה עבור 25 דקות ב 700 g x ללא הפסקות.
   הערה: בסוף צנטריפוגה מעבר צבע צפיפות, השכבות מלמטה למעלה הם: אריתרוציטים של גרנולוציטים ויוצרים את צניפה, צפיפות פתרון מעבר פאזה, שכבה של PBMCs, פלזמה.
4. עם pipet, עוברים שלב פלזמה ללא כ רפה בעברית זה ולאסוף את השכבה PBMC לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ. להוסיף עד 50 מ של 1 x PBS PBMCs הכביסה צעד, צנטריפוגה 10 דקות ב 300 x g.
5. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 40 מיליליטר מקרופאג בינוני.

3. מגנטי תיוג ובידוד של CD14⁺ תאים (Monocytes)

1. לספור את PBMCs בחדר Malassez. למשוך את הסכום של PBMCs הדרושים לביצוע הניסוי (בדרך כלל 100 עד 300 x 10⁶ תאים), מקם אותם בתוך שפופרת צנטריפוגה ולאחר צנטריפוגה 10 דקות ב 300 x g.
2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 80 µL של המאגר המיון הכין במהלך שלב 1.3 לכל 10⁷ µL PBMCs. הוספת 20 של גרגרי CD14 לכל 10⁷ PBMCs. לערבב טוב ותקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות מתמדת.
3. להוסיף 1 מ"ל של מיון מאגר לכל 10⁷ PBMCs שלב כביסה וחדר צנטריפוגה 10 דקות ב 300 x ג' וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 500 µL של מיון מאגר לכל 10⁸ PBMCs.
4. מקום בעמודה שדה מגנטי למפריד. הכן את העמודה באמצעות שטיפה זה עם 3 מ"ל של מיון מאגר.
5. החל התליה תא אל העמודה. העמודה תלוי מספר התאים להיות מבודד (כאן, האם עמודות עבור PBMCs⁹ עד 10 משמשים). לאסוף זרימה דרך המכיל תאים ללא תווית.
   הערה: החל בשלב זה, כל הצינורות (בחירות שליליים או חיוביים) נשמרים לבדיקת מאוחר יותר של השלבים השונים על-ידי cytometry זרימה.
6. לשטוף את העמודה עם 3 x 3 מ"ל של מיון מאגר. איסוף תאים ללא תווית עובר דרך הצינור אותו מהשלב 3.12. לבצע צעדים כביסה על-ידי הוספת המאגר המיון, יש להקפיד לא לייבש את הטור שלך. הצב צינור אוסף תחת העמודה ולהסיר אותו מן המפריד.
7. פיפטה 5 מ של מיון מאגר לתוך העמודה. מיד לשטוף החוצה את התאים דיסקות שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה. כדי להגדיל את הטוהר של CD14⁺ תאים, השבר eluted מועשר על עמודה שנייה.
8. חזור על שלבים 3.4 ל 3.7 עם עמודה חדשה.

4. ציפוי של Monocytes

1. לספור את ומונוציטים בתוך תא Malassez. לבדוק את טוהר CD14⁺ תאים על-ידי cytometry זרימה. למשוך את כמות ומונוציטים הכרחי עבור הניסוי ולמקם אותם בצינור צנטריפוגה.
2. צנטריפוגה 10 דקות ב x 300 ג' לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר מונוציט מקרופאג בינוני. צלחת התאים ולתת להם מסתפק 50 דקות לח' 1 תשאף המדיום ולהחליף אותו עם מקרופאג בינוני + 10% SAB + 25 ng/mL מקרופאג המושבה מגרה פקטור (M-CSF) כדי ליצור בידול.

5. קיטוב של מקרופאגים-יום 6

1. האחות של המדיום. להחליף אותו עם מקרופאג בינוני + 10% SAB עם גירויים שונים. לדוגמה, הוסף 10 ננוגרם למ"ל אינטרפרון גמא (INFγ) + 1 ng/mL ליפופוליסכריד (LPS) כדי להשיג קיטוב M1, או 20 ng/mL אינטרלוקין 4 (IL4) + 20 ng/mL אינטרלוקין 13 (IL13) עבור M2 קיטוב.
   הערה: ניתן לבצע הגירוי בין 24 ל- 48 h לפני שימשיך בדיקות אחרות.
2. קציר תאים באמצעות פתרון התולש או המגרד של התא.

6. תרבית תאים בתנאים חמצן נמוך

1. החל משלב 4, לשמר את ומונוציטים ולאחר מכן מקרופאגים בסביבה מבוקרת חמצן לביצוע ניתוח מצב ובשפתיים. השתמש תחנת עבודה היפוקסיה על מנת לשמור על התאים תחת לחץ חלקי חמצן הרצוי במהלך הניסוי.
   הערה: כאשר עובד בלחץ חמצן נמוכה, חשוב להכין כל מאגרי כביסה תחת תחנת ומדיה ולחכות מספיק כדי להשיג את לחץ חלקי הנכונה בתוך הנוזל. לדוגמה, 10 מ ל- PBS ל 60 מ מ פטרי דורש בערך שעתיים להגיע 25 מ מ כספית עבור לחץ חלקי של₂ O החל מן הלחץ האטמוספרי (כפי שיש מדדנו בעזרת חיישן חמצן סיבים אופטיים). הרבה תחנות ובשפתיים או חממות, הלחץ חמצן מוגדר כאחוז מן הלחץ האטמוספרי. אם מידות מדויקות נחוצים, עדיף להשתמש תחנת המאשר ישירות להגדיר את הלחץ חמצן מ מ כספית.

7. פירוק ועיכול בג'ל (פרוטוקול 1)

הערה: זה, בסעיפים הבאים, מתוארים שני פרוטוקולים המשמשים כדי להשיג פפטידים ולבצע ניתוח LC-MS/MS. פרוטוקול 1 מתאר פירוק התא ואת בג'ל fractionation עיכול, פרוטוקול 2 מתאר פירוק התא בפתרון ואחריו בפתרון לעיכול, fractionation באמצעות שיטת התמקדות לגירויי כאב.

1. לבצע פירוק התא במאגר Laemmli [234 מ מ טריס-HCL (pH 6.8), 7.5% מרחביות, 37% גליצרול, 33.3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol כחול 0.2% w/v...]. לטעון את המקבילה חלבון של 300,000 תאים עבור כל דגימה על 4-12% bis-טריס אקרילאמיד ג'לים.
2. לקבוע את משך הזמן של העברה electrophoretic כדי לאפשר כל מדגם חלבון ניתן לפצל ג'ל 6 להקות כפי שהודגם באיור3.
3. לתקן את הג'ל עם פתרון תיקון (30% אתנול + 7.5% חומצה אצטית כעשרים דקות) ולאחר מכן להוסיף את הפתרון מכתימים (Coomassie R-250 כחול למשך 45 דקות). הוסף את הפתרון destaining (30% אתנול + 7.5% אצטית עד יופיעו להקות) לפני excising הלהקות חלבון עם איזמל נקי.
4. קוצצים את כל הלהקה נכרת לפני מבוא 500 µL צינורות. משטח זכוכית נקי היא מוצדקת כדי למנוע זיהום, עם keratins (5% פתרון מרחביות במים יונים ניתן לניקוי משטחים).
5. לשטוף את הפרוסות ג'ל 3 פעמים ב 200 µL של 25 מ מ אמוניום ביקרבונט כעשרים דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריו לרחוץ אחת 25 מ מ אמוניום ביקרבונט ו- acetonitrile (50% v/v). מייבשים את חתיכות ג'ל עם 200 µL של 100% acetonitrile למשך 10 דקות.
6. דגירה כל חתיכה ג'ל עם 10 מ מ DTT (dithiothreitol) ב- 25 מ מ אמוניום ביקרבונט למשך 45 דקות ב- 56 ° C (200 µL), ואחריו 55 מ"מ iodoacetamide ב- 25 מ מ אמוניום ביקרבונט (200 µL) עבור 35 דקות בחושך-RT.
7. כדי להפסיק את אלקילציה, דגירה כל חתיכה ג'ל עם 200 µL של 10 מ מ DTT 25 מ מ אמוניום ביקרבונט 10 דקות בשטיפת RT. את השברים ג'ל 200 µL של 25 מ מ אמוניום ביקרבונט, ואז מייבשים עם 200 µL של 100% acetonitrile למשך 10 דקות.
8. לעכל את החלבונים בן לילה ב 37 ° C עם תערובת טריפסין/ליס-C על-פי הוראות היצרן.
9. לחלץ את פפטידים וכתוצאה מכך מפיסות ג'ל על-ידי הוספת μL 50 של 50% acetonitrile במשך 15 דקות, ואז μL 50 של 5% חומצה פורמית למשך 15 דקות, לבסוף, 50 μL של 100% acetonitrile על 15 דקות בריכת ויבשה כל שבר הקליטה נמוכה-צינורות להגבלת ספיחה של פפטידים, אובדן הדגימה. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.

8. חלבון החילוץ ועיכול בפתרון (פרוטוקול 2)

1. לבצע פירוק התא (2 x 10⁶ תאים) עם 150 µL של המאגר פירוק הבאים:
   1. שבעה מ' אוריאה thiourea 2 מ', 40 מ מ טריס, חברים 4%, בתוספת מעכבי פרוטאז (מיני מלא, ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטייל).
2. Homogenize הפתרונות למשך 30 דקות ב- RT עם thermoshaker. צנטריפוגה ב g x 13,800 כעשרים דקות RT ולשמור את תגובת שיקוע.
3. הסרת מזהמים עם ערכת ניקיון דו-מימדית:
   1. הערכה כוללת פתרון precipitant, פתרון משותף precipitant, שטיפת מאגר שטיפת מוספים.
   2. להוסיף 300 µL של פתרון precipitant ומערבבים היטב. דגירה על קרח במשך 15 דקות להוסיף 300 µL של פתרון משותף precipitant. Centrifuge הצינורות (לפחות) ב g x 12,000 במשך 5 דקות. גלולה קטנה צריך להיות גלוי. המשך במהירות אל השלב הבא כדי להימנע resuspension או פיזור של בגדר. הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
   3. Centrifuge צינורות שוב עם כובע-ציר, גלולה פונה החוצה להביא כל הנוזל הנותר לתחתית הצינור. דופק קצר מספיקה. צריך להיות לא גלוי נוזלי שנותרו בתוך הצינורות.
   4. מבלי להפריע בגדר, להוסיף 40 µL של פתרון משותף precipitant. תן את הצינור לשבת על קרח 5 דק צנטריפוגה במשך 5 דקות, ואז להסיר ולמחוק לשטוף. להוסיף 25 µL של מים מיוננים. מערבולת כל צינור עבור s 5-10. בגדר צריך להתפזר אך אינם מתמוססים במים.
   5. להוסיף 1 מ"ל של מאגר לשטוף (טרום מקורר במשך לפחות שעה ב-20° C) ו µL 5 של שטיפת כתוסף. מערבולת עד בגדר מפוזרת באופן מלא. דגירה הצינורות ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות מערבולת עבור 20-30 s כל 10 דקות
      הערה: הצינורות שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 1 לשבוע עם חלבון מינימאלית השפלה או שינוי.
   6. Centrifuge הצינורות (לפחות) ב 12,000 × g עבור 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. גלולה לבן צריך להיות גלוי. לאפשר בגדר כדי airdry עבור לא יותר מ 5 דקות (אם בגדר יבש מדי, שזה יהיה קשה resuspend).
4. Resuspend בגדר חלבון ב- 300 µL של שמונה מ' אוריאה ו 0.1 M אמוניום ביקרבונט. מערבולת בתוקף עבור מינימלית 1 לקבוע ריכוז חלבון באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים.

9. בפתרון עיכול (פרוטוקול 2)

1. להפחית דיסולפידי גשרים על-ידי הוספת µL 5.1 של תמיסה מימית DTT 700 מ מ (הריכוז הסופי 12.5 מ מ) חלבונים resuspended מן צעד 8.4 ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם thermoshaker. Alkylate ציסטאין שאריות על-ידי הוספת µL 20.3 של תמיסה מימית iodoacetamide 700 מ מ (הריכוז הסופי 40 מ מ), המקננת ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך עם thermoshaker.
2. להוסיף 990 µL של 0.1 M אמוניום ביקרבונט המדגם. להוסיף נפח המתאימים של טריפסין/ליס-C מיקס (סובסטרט: יחס 1: 100 w/w). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם thermoshaker.

10. לנקות מחסנית (פרוטוקול 2)

1. רטוב מחסנית עם 1 עמודה של אמצעי אחסון (1 מ"ל) של מתנול. לנקות את המחסנית עם 1 עמודה של אמצעי אחסון (1 מ"ל) מים acetonitrile/HPLC-ציונים 80% ולמחוק את הזרימה דרך. Equilibrate את המחסנית עם 4 עמודות-כרכים (4 מ ל) של 0.1% חומצה פורמית/HPLC-כתה מים וזורקים את הזרימה דרך.
2. Acidify דגימות עם 90 µL של 10% חומצה פורמית או מים pH 2-3 (בדוק את ה-pH עם מחוון ה-pH). לטעון את הדגימות acidified ולאסוף את הזרימה דרך. לטעון מחדש את הזרימה דרך (המכיל את פפטידים לא נשמר). לשטוף את המחסנית עם 6 עמודה של אמצעי אחסון (6 מ ל) של 0.1% חומצה פורמית/HPLC-כתה מים.
3. Elute פפטידים מהמחסנית עם עמודה 1-אמצעי אחסון (1 מ"ל) של 0.1% formic acid/50% acetonitrile/HPLC-כתה מים. העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL. לרכז את הדגימה באמצעות רכז ואקום (g x 150, ואקום-160 mBar).

11. fractionation על ידי התמקדות לגירויי כאב (פרוטוקול 2)

הערה: פפטידים מופרדים על-פי נקודות לגירויי כאב שלהם באמצעות fractionator של חופש-ג'ל על רצועה 13 ס מ המכסים מגוון pH 3 עד 10. השתמשנו הפרוטוקול. הבא מסופקים על ידי הספק (מסוכמים להלן):

1. להכין את הפתרונות הבאים: פתרון (µL 600 של גליצרול פתרון, 60 µL מאגר OFFGEL, 4.34 מיליליטר מים הנדסה גנטית) והפתרון B (1.776 מ"ל של פתרון A) ו- µL 444 מים הנדסה גנטית.
2. להרכיב את IPG רצועות מסגרות, אלקטרודות על-פי הוראות היצרן.
3. Resuspend הדגימה עם 1.8 מ של פתרון µL B. להוסיף 40 של פתרון B בכל טוב. לטעון µL 150 מדגם כל טוב.
4. בחר את שיטת ברירת המחדל עבור פפטידים: OG12PE00 (OFFGEL שיטת ברירת המחדל פפטידים לשימוש עם 3100 OFFGEL נמוך Res ערכת, pH 3-10, 12-ובכן מסגרות. המתן עד בשיטה זו כבר הושלמה (~ 20 h). לאסוף את השברים צינורות שכותרתו כראוי.

12. לנקות הרווארד המנגנון עמודה סי18 הפוכה פוסט-הפורום הישראלי לאנרגיה (פרוטוקול 2)

1. בהדרגה להוסיף כמה μL בזמן של 1% TFA במים מיוננים כדי כל שבר כדי acidify את הדגימה. בדקו בעזרת נייר pH, ה-pH הוא על 3 או להלן.
2. להכין את הפתרונות הבאים: פתרון 1 (5 מ של acetonitrile, 10 µL של חומצה פורמית, ב- 4.99 מ ל מים הנדסה גנטית) ופתרון 2 (0.5 מ של acetonitrile, µL 10 חומצה פורמית, 9.49 מיליליטר מים הנדסה גנטית).
3. טרום רטוב העמודה ספין עם 150 µL של פתרון 1. צנטריפוגה עבור 90 s ב 750-g ולהשליך הזרימה דרך. לשטוף את העמודה ספין עם 150 μL של פתרון 2. צנטריפוגה עבור 90 s ב 750-g ולהשליך הזרימה דרך.
4. עוברים את השבר באמצעות המדור. צנטריפוגה עבור 90 s ב 750-g ולהשליך הזרימה דרך. לשטוף עם 150 μL של פתרון 2. צנטריפוגה עבור 90 s ב 750-g ולהשליך הזרימה דרך.
5. Elute השבר עם 50 μL של פתרון 1. צנטריפוגה עבור 90 s ב 750 ג x חזור על שלבים אלה פעם נוספת.
6. יבש, שבר באמצעות רכז ואקום (150 גר' x, mBar ואקום 160) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס

13. ניתוח של נתונים פרוטיאומיה מבנית, ביואינפורמטיקה¹⁸

1. לנתח נתונים שהושגו על-ידי MS ננו-LC/MS מסה ספקטרומטר באמצעות כימות תוכנה כגון MaxQuant (גירסה 1.5.2.8), מנוע החיפוש אנדרומדה.
2. הגדר קצב גילוי שקר (פד) 1% חלבונים ופפטידים וגם אורך מינימלי של 7 חומצות אמינו. הגדרת אנזים ירידה לפרטים כמו C-מסוף ועד Lys Arg. אפשר 2 אדמירל שלא נענתה-פרולין חוב. בחר carbamidomethylation של ציסטאין שינוי קבוע ו N-מסוף חלבון acetylation ומתיונין חמצון שינויים משתנה.
3. עוד לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ניתוח סטטיסטי. ביצוע ניתוח העשרה תפקודית באמצעות תוכנת FunRich (www.funrich.org/). לבצע ניתוח העשרת אונטולוגיה של הגן באמצעות תוכנה דוד (https://david.ncifcrf.gov/).

החל מ היקפיים תאי תאי דם (PBMCs) מתקבל על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, הפרוטוקול מאפשר השגת אוכלוסייה של CD14⁺ ומונוציטים עם טוהר המוערך של יותר מ- 98% על ידי cytometry זרימה (איור 1). אלה ומונוציטים בגיחות מובחנים לכיוון polarizations השונות (איור 2). כאשר נבחר של fractionation-ג'ל, ההעברה על ג'לים מרחביות-דף זה מותאם כדי להשיג את המספר של להקות הרצוי הלהקות הדליות (איור 3). העיכול בגיחות מבוצע במסגרת הלהקות נכרת של הג'ל, ולאחר מכן פפטידים מחולצים. פפטידים מנותחים באמצעות ננו-LC (כרומטוגרפיה נוזלית)-MS/MS מסה ספקטרומטר. MS/MS ספקטרה לתת את זהותו של חלבונים שונים לפי הביאור של ספקטרה השיג עבור ידוע פפטידים (איור 4A). כימות של השפע של חלבון לאחר מכן מחושב בקשר עם הכמות של פפטידים מזוהה מגיע החלבון באמצעות תוכנה שפורסמה, מסדי נתונים^15,16. פרוטוקול זה בתוך ג'ל עיכול נותן כ 4000 חלבונים מזוהה, הטווח הדינמי נמצאה כדי לכסות את סרגל לוגריתמי 5 יחידות (איור 4B). ניתוח של הביטוי דיפרנציאלית של חלבונים אלה שזוהו יכול לשמש כדי לקבוע את קיבוץ באשכולות של polarizations שונים תחת סביבות שונות חמצן.

בשיטה זו, אנו יכולים לזהות גם אשכולות של חלבונים שמווסתים למעלה-כאשר נחשף ריכוז חמצן נמוך של 3% (איור 5, טבלה 1). כדי להעריך את היעילות של העיכול, וזה לא אפשרי כאשר פרוטוקול בג'ל משמשת, שהצענו שיטה בפתרון העיכול כי כבר מותאם האנושי מקרופאגים (איור 6A). בשיטה זו, אפשר בקלות להשיג (לאחר עיכול תוך-פתרונות) זיהוי של חלבונים 3600 ללא fractionation, כלומר את fractionation עם הרצון הציבורית בהגיון להגדיל מספר זה (איור 6B).

איור 1: Flow cytometry ניתוח של ביטוי CD14 של PBMC לפני מיון (החלונית הימנית), לאחר מיון (לוח נכון) מציג את הטוהר שהושג לאחר הבחירה beads מגנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: תמונות בניגודיות שלב של הבדיל מקרופאגים האנושי מראה הטרוגניות של מורפולוגיות שהושג עבור שני polarizations שונים. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: הדמיה של Coomassie blue מוכתמת ג'ל מציג את להקות שונות זה להוציא [כאן, להקות 6 ב מקרופאגים M(Ø)] 5 polarizations של מקרופאגים חשופים לסביבה חמצן נמוך. IC = מכלולי המערכת החיסונית DXM = דקסמתזון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: ספקטרום MS/MS, כמת. (א) דוגמה ספקטרום MS/MS. המוצג כאן הוא הספקטרום CID (התנגשות-induced דיסוציאציה) של פפטיד ב מ/z 597.29 מספקטרום MS עם מטען חשמלי של +2. הרצף המתאים נקבע מתוך ספקטרום נרחב זה כמו Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg של החלבון CD58. (ב) דרגה הורה כמת ללא תווית עבור כל אחד החלבונים מזוהה (כניסה₁₀ LFQ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: מפת החום מייצג את קיבוץ הירארכי באשכולות של קיטוב כל מדינות באמצעות באופן שונה הביע חלבונים. ניתוח מגלה מקבץ של חלבונים overexpressed ב polarizations כל מצב₂ 3% O (מלבן אדום). הסולם צבע מייצג עשרות z (log2 בעוצמה). בכל שורה הוא חלבון והוא כל עמודה מדגם. איור זה מקורו הפרסום הקודם¹⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: עמודים מרחביות, chromatogram. (א) כסף מוכתם ג'לים מרחביות-דף עם חלבונים מן התא פירוק ואחרי עיכול תוך-פתרון מציג העדר של השפלה במהלך פירוק והיעילות של העיכול. (ב) chromatogram המתקבל לאחר עיכול תוך-פתרון ללא fractionation. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: רשימת יתר ביטוי חלבונים עבור מקרופאגים אנושיים המשותפים לכל קיטוב תחת מתח נמוך חמצן.

מכיוון פרוטאומיקס הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד הביטוי של חלבונים שונים תא שלם או תאים subcellular, אופטימיזציה של פרוטוקול פירוק תא ועיכול של חלבונים טופלה על ידי מספר מחקרים. יש שלוש מחלקות עיקריות של שיטות, הכוללים בג'ל עיכול (עיכול חלבונים במטריצת לזיהוי ג'ל)¹⁷, עיכול פתרון¹⁸ , דוגמת בעזרת מסנן הכנה¹⁹. שיטה זו, בשלב הראשון מתואר אוניברסלית, דווח שהפגינו הפארמצבטית נמוכה, אובדן אפשרי של חלבונים על מסנן²⁰. בג'ל לעיכול היא שיטה חזקה כי יכול להיות חסרון ועתירת כי הערכת היעילות של מערכת העיכול אינה קלה, במידת האפשר. בפתרון עיכול מציעה את האפשרות הזו אבל דורש הניקוי של דגימות לאחר לעיכול, הפורום הישראלי לאנרגיה. כאשר שתי השיטות מושווים בין באותה דגימת זרע, עיכול בפתרון עם פרוטוקול fractionation הציבורית מניבה מספר גבוה יותר של חלבונים מזוהה (עם מספר זהה של שברים) מאשר בג'ל עיכול²¹.

למרות יתרון זה, יש צורך לשקול השפלה חלבון אפשרי במהלך פירוק בבית-פתרון בשל פרוטאזות תאיים (במיוחד בתאי מיאלואידית). זה גם חשוב שיש לזכור כי שיטות אלה מבוססים על חלבון עיכול ומסוגל רק לנתח חלבונים הצגת טריפסין אתרים ספציפיים המחשוף. . זה ניתן להשתמש בגישה פרוטיאומיה מבנית מלמעלה למטה זה מקל על אילוץ זה לעיכול, אך מוסיפה צעדים analysis נתונים וביואינפורמטיקה במשאבים²². Solubilization של חלבונים של תאים סלולריים שונים יכול להיות גם קשה להשיג, במיוחד של ממברנות פלזמה, המוביל דגימה לא מבוקרת של פרוטאום הסלולר. כדי להמשיך עם ניתוח ננו-LC-MS/MS ספקטרומטר מסה של הדגימות, חשוב להצטייד בכמות מספקת של פפטידים, אשר יכולים להיות תלויים ספקטרומטר מסה פעם (בדרך כלל, מתחיל הכוללת חלבון צריך להיות לפחות 1 µg על תנאי, ו זה משתמעת להגדיל כמות זו על פי מספר שבר עם הפורום הישראלי לאנרגיה). אילוץ זה יכול להיות חיסרון אם האוכלוסייה תא נחקר הוא נדיר, אשר מבדילה פרוטיאומיה מבנית של טכניקות גנומית שבו הגברה של חומר גלם אפשרי.

גם אחרי העבודות החלוצי של ריצ'ר ועמיתיו²³ ו- פקר, Fuehr²⁴, החשיבות של חמצן בתרבויות תא הוכר דיו. אנו יודעים כעת כי culturing התאים תחת ריכוז חמצן נמוך טובות אדהזיה, תוחלת חיים, חטיבת. הוא מוכר כי זה בעל חשיבות עליונה מחקר תאי הגזע²⁵. ההיבט הטכני המרכזי עבור תרביות תאים בתנאים מבוקרים חמצן קשור תחזוקה של ריכוז החמצן הרצוי במהלך הניסוי כולו. פעולה זו דורשת מראש דגירה של כל אמצעי התקשורת למנוע שחרור של חמצן מומס, שימוש ובשפתיים תחנות עבודה כדי לאפשר המניפולציה של התאים תחת חמצן נמוך (עיבוד קאמרית עם הכפפות) ולמנוע תערוכות זמניות לתנאים חמצן גבוהה .

הפרוטוקול המתואר שימש כדי להשיג את החתימה מולקולרית של polarizations שונים של מקרופאגים נגזר מונוציט האנושי ואת לחקור את ההשפעות של חמצן מודולציה על חתימות אלה. מחקר זה נותן תובנה על התיאור של האלה polarizations, חשף כמה השלכות תפקודיות משמעותיות. לדוגמה, מצאנו כי רבים החלבונים המעורבים efferocytosis היו מווסת על ידי סביבה חמצן נמוכה. גישה זו פרוטיאומיה מבנית, המבוסס על פרוטוקול המתואר, מציג את ההזדמנות לחקור כיצד פרמטרים סביבתיים לשנות פונקציות מקרופאג וכיצד אותות אלה ניתן להשתמש כדי לעצב גישות טיפוליות חדשות¹⁴.

הגישה פרוטיאומיה מבנית המתואר בעבודה זו הוא משלים סימביונטים נעשה בהם שימוש במהלך השנים האחרונות בתחום של מחקרים קיטוב מקרופאג אנושי. פרוטאומיקס מציעים את היתרון של כימות חלבון, אשר עשויה להציג ביטוי שונה מאשר mRNAs המקביל שלהם עקב שינויים post-translational, להוביל גילוי סמנים חדשים. למרות יתרון זה, פרוטיאומיה מבנית נתונים הוא בדרך כלל קשה לפרש, בין השאר עקב הרגישות הגבוהה של ספקטרומטר מסה, שמוביל ספקטרה MS מאוד מורכב וזיהוי חיובי כוזב של פפטידים. לאחרונה, ניתוח תוכנה צבר יעילות על מנת למנוע זאת. אפילו אם זה מצב המשתנה, פרוטאומיקס גם פונה הפארמצבטית נמוכה יותר מאשר גנומיקה²⁶ והיא קשורה עם השלבים אימות באמצעות טכניקות אחרות (cytometry זרימה, immunoblotting) כדי לאשר שינויים כמותיים של חלבון רמות הביטוי.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

AM ממומן על-ידי התוכנית מנהיג קבוצה צעירה (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), על ידי לה ליגה נאסיונאל חדר מרווח וחדיש le סרטן ו la Fondation ARC למזוג לה רשרש sur le סרטן. אנו מודים מארייט Matondo מספקטרומטריית לפלטפורמה ביולוגיה (UTECHS MSBIO, מכון פסטר, פריז). אנו מודים לורן אנדרסון על אותה קריאה של כתב היד.