재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

Stromal 상호 작용 분자-1 (STIM1)은-내가 막 횡단 단백질 바인딩과 그물 (ER) 및 플라즈마 막 (오후)에 위치 해 있습니다. ER-상주 STIM1 오후 Orai1 채널 알려져 주 캘리포니아^{2 +} 신호 과정 면역 응답을 구동 하는 운영된 칼슘 (캘리포니아^{2 +}) 항목을 저장 하는 과정에서의 활동을 통제 한다. STIM1 Ca^{2 +} 감지의 도메인 내에서 분자 두 luminal Asn 사이트에 닢 Nglycosylation를 겪 습. 그러나,는 생화학, 생물, 그리고 N-당화 STIM1의 구조 생물학적 효과 쉽게 균질 N-당화 단백질의 높은 수준을 얻을 수 없음 인해 최근까지 제대로 이해 했다. 여기, 우리가 시험관에 화학 접근의 단백질 구조와 메커니즘에 Nglycosylation의 기본 효과 이해 하는 데 적용 하는 특정 단백질 사이트로 포도 moieties 부착 구현을 설명 합니다. 우리 모두 효율성의 수정 뿐만 아니라 단일 샘플 포도 당 첨부 파일의 구조 결과 평가 솔루션 핵 자기 공명 분광학을 사용 하 여. 이 이렇게 자연에서 발견 하는 무수 한 당화 단백질 연구를 쉽게 적응 수 있습니다.

운영된 칼슘 (캘리포니아^{2 +}) 저장 항목 (SOCE)는 면역 세포는 cytosol로 세포 외 공간에서 캘리포니아^{2 +} 을 차지 하는 주요 통로 이다. T 세포, T 세포 수용 체 (오후) 원형질 막에 있는 항 원 단백질 tyrosine kinases ( ^1,2,3검토)을 활성화 하는 바인딩합니다. 인 산화 폭포 phospholipase-γ (PLCγ)는 이후 diacylglycerol 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate (IP_{3에 막 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)의 가수분해를 중재의 활성화로 연결} ). IP₃ 은 응급실에서 농도 기온 변화도 아래로 흐름 IP₃ 수용 체 (IP₃R) 바인딩과 그물 (ER)에 그로 인하여이 수용 체 수로 열고 허용 캘리포니아^{2 +} 바인딩하는 작은 diffusible 메신저 cytosol ( ^4에서검토)에 루멘. 수용 체 G 단백질 결합 및 다양 한 기타 고르기 및 비 고르기 셀 유형 리드에에서 티로신 키 니 아 제 수용 체에서 IP₃ 의 동일한 생산 및 IP₃Rs의 활성화 신호.

유한 캘리포니아^{2 +} 의 저장 용량은 응급실, IP₃인-중재 릴리스 및 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 에서 결과 증가 일시적;만 그러나, 응급실 luminal 캘리포니아^{2 +} 이 고갈 뿌리깊은 stromal 상호 작용 분자-1 (STIM1), 유형 효과-난 막 횡단 (TM) 단백질은 주로 응급실 막 ^5,,67에 발견. STIM1 루멘 지향 Ca^{2 +} 감지 도메인을 EF-손 쌍과 마른 α-주제 (EFSAM) 구성 포함 되어 있습니다. Cytosolic 지향 코일 코일 도메인 3 개 ( ⁸에서 검토) 단일 TM 도메인에서 EFSAM에서 분리 된다. ER luminal 캘리포니아^{2 +} 고갈, 시 EFSAM TM 및 코일 코일 도메인 ¹⁰의 구조상 재배열을 일으키는 원인이 되는 불안정 결합 oligomerization ^7,9 을 겪 습. 이러한 구조 변화 응급실 오후 접속점 ^11,12,13,14 오후 phosphoinositides ^15, 와 상호 작용을 통해 STIM1의 트랩에 달 하다 ¹⁶ 및 Orai1 소 단위 ^17,18. Orai1 단백질은 조립 형태로 캘리포니아^{2 +} 채널 ^19,20,,2122는 오후 소 단위. ER-오후 접합에서 STIM1 Orai1 상호 작용 촉진는 오픈 캘리포니아^{2 +} 릴리스 활성화 캘리포니아^{2 +} (CRAC) 채널 구조의 높은 농도에서 cytosol에 캘리포니아^{2 +} 의 움직임을 가능 하 게 합니다 세포 외 공간입니다. 면역 세포에는 지속적인된 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 고도 CRAC 채널을 통해 유도 캘리포니아^{2 +}-calmodulin/calcineurin 종속 dephosphorylation 이후 핵을 입력 하면 활성화 된 T-세포의 핵 요인의 고 T 세포 활성화 ^1,3를 홍보 하는 유전자의 transcriptional 규칙을 시작 합니다. STIM1 ^23,24 주 작동 근 유도 응급실 luminal 캘리포니아^{2 +} 고갈 통해 결과 지속적인된 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 고도로 CRAC 채널 활성화의 과정은 공동으로 SOCE ²⁵불린다. T-세포에 SOCE의 중요 한 역할은 STIM1와 Orai1에서 상속 변이 심한 결합 된 면역 결핍 증후군 ^3,,1926, 를 발생할 수 있습니다 입증 하는 연구에 의해 분명 하다 ²⁷. 정식 EF-손에서 궁극적으로 자체 협회 불안 결합 ^7, 로 이어지는 Ca^{2 +} 조정의 손실을 통해 응급실 luminal 캘리포니아^{2 +} 고갈 감지 후 SOCE를 시작 하는 EFSAM ^28,29.

Glycosylation 공유 첨부 파일 올리고 당 구조, 일컬어 glycans, ER 및 Golgi ( ^30,,3233검토) 다양 한 생 합성 단계를 통해의 처리입니다. 진핵생물에서 glycosylation의 두 가지 주된 유형이 있다: N-연결 된 및 O-연결, 특정 아미노산 및 atom 가교 결합에 따라. N-glycosylation에서 glycans, Asn의 사이드 체인 아 미드에 연결 그리고 개시 단계 응급실에서 발생 하는 대부분의 경우에는 polypeptide 사슬 루멘 ³⁴로 이동. N-glycosylation의 첫 번째 단계는 포도 당 (Glc)만 노 오 스 (남자), 및 N-acetylglucosamine (GlcNAc) (예: Glc₃남자₉GlcNAc₂)는 ER에서 만들어진 14 설탕 코어 구조 이전 oligosaccharyltransferase ^35,36여 막 지질. 분열 또는 포도 당 잔류물의 양도 등의 더 단계는 특정 glycosidases와 glycosyltransferases 응급실에서 촉매. 응급실을 두고는 골으로 이동 하는 일부 단백질은 처리 ³⁷추가 될 수 있습니다. Oglycosylation Ser 또는 Thr 잔류물의 사이드 체인 수 산 기 그룹에 일반적으로 glycans의 추가를 참조 하 고이 수정 골 복잡 한 ^33,34에서 전적으로 발생 합니다. Nacetylglucosamine, fucose, 갈 락 토스, 구성 될 수 있는 여러 오-glycan 구조 이며 각 단 당 류와 sialic acid ³³순차적으로 추가.

아니 특정 순서 Oglycosylation의 많은 종류에 대 한 사전 요구 사항 확인 되었습니다 동안 일반적인 합의 순서 N와 연결 되었습니다-수정 연결: Asn-X-Ser/Thr/Cys, X 어떤 아미노산을 될 수 있는 프로 ³³제외 하 고. STIM1 EFSAM 두 이러한 합의 N-glycosylation 사이트 포함: Asn131-Trp132-Thr133와 Asn171-Thr172-Thr173. 실제로, 이전 연구 EFSAM Asn131 및 Asn171 ^38,39,,4041에서 포유류 세포에서 N-당화 수 나타났습니다. 그러나, 이전 연구의 SOCE에서 Nglycosylation의 결과 되었다 합동, 제안 억제, potentiated 또는 SOCE 활성화 ^38, 에이 포스트 번역 상 수정에 의해 영향을 주지 않습니다"외부 참조" = > 39^,,4041. 따라서, EFSAM Nglycosylation의 기본, 생화학, 생물 및 구조 결과 대 한 연구는이 수정의 규제 효과 이해 하는 중요 한. 이러한 생체 외에서 실험에 균질 단백질의 높은 수준에 대 한 요구 사항으로 인해 포도 당 moieties EFSAM covalently 연결할 사이트 선택적 접근 방식을 적용 했다. 흥미롭게도, Asn131 및 Asn171 glycosylation EFSAM 코어 내 수렴을 홍보 STIM1이 중재 SOCE ⁴²생물 속성 강화 구조 변경 발생 합니다.

Cys thiols glycosyl 그룹의 화학 첨부 파일 정액 작품 처음 시연 단백질 기능 ⁴³ , glycosylation의 사이트 효과 이해 하 고이 효소 무료로 접근의 유틸리티에 의해 잘 설립 되었습니다. ^{, 44}. 최근에 STIM1에 관하여 Asn131과 Asn171 잔류물 했다 Cys을 돌연변이 glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] covalently 무료 thiols ⁴²에 포도 당을 연결 하는 데 사용 되었다. 여기, 우리 뿐만 아니라 mutagenesis 통합 수정에 대 한 사이트 특정 Cys의 잔류물을 사용 하지만 빠르게 수정 효율성 및 구조적 평가 솔루션 핵 자기 공명 (NMR) 분광학은 또한 적용 됩니다이 이렇게 설명 섭은 glycosylation 결과로입니다. 특히,이 일반적인 방법론 중 O-의 효과 연구에 쉽게 적응 또는 N-glycosylation의 recombinantly 단백질을 생산.

1. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)-세균 애완 동물-28a 식 벡터에 Cys의 설립에 대 한 사이트 이동 mutagenesis 중재.

1. 260에서 0.020 (μ g/mL) cm ^-1의 자외선 (UV) 소멸 계수를 사용 하 여 애완 동물-28a 벡터 (즉, 두 배 좌초 된 DNA)의 농도 결정 nm.
2. 합성 각 Cys 돌연변이 대 한 보완 돌연변이 뇌관의 쌍 난) 이전에 1 루 불일치 및 15 뉴클레오티드 보완 후 서식 파일에 서식 파일을 보완 15 뉴클레오티드의 최소 있다는 마지막 기본 불일치, ii) 45 뉴클레오티드, 및 iii 총 뇌관 길이 초과 하지 않는) 구 아닌 또는 시 토 신은 각 뇌관 (표 1)의 첫 번째 및 마지막 뉴클레오티드 위치에 위치. 뇌관 종합 0.025 μmol 규모 및 카트리지 정화를 사용 하 여 수행 됩니다 확인 하십시오.
3. 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 두 개의 20 µ L PCR 반응 혼합물을 설정: 앞으로 뇌관과 두 번째가지고 있는 역방향 뇌관을 포함. 1.5 m m MgCl ₂, 0.2 m m dNTPs, 0.5 μ M 뇌관, 0.4 μ DMSO, 1 x PCR 버퍼의 최종 농도 포함 하는 각 혼합물 준비 1.25 ng/μ 템플릿 DNA, 0.02 U/μ 고 충실도 DNA 중 합 효소.
4. 열 3 단계 프로토콜을 사용 하 여 별도 혼합물을 주기: 98 ° C 30에 대 한 s (변성 시키기), 53-56 ° C 30에 대 한 s (어 닐 링), 30 s kilobase(kb) ^-1 (확장) 서식 파일 DNA의 72 ° C. 5 주기 위한 온도 프로그램을 반복 하 고 추가 7.5 분에 대 한 최종 72 ° C 확장 단계
5. 별도 튜브에 앞으로 역 뇌관으로 초기 PCR 후 단일 튜브 (즉 40 μ 총)으로 제품을 결합 하 고 계속 1.4 단계에서 설명한 대로 동일한 자전거 매개 변수를 사용 하 여 추가 20 사이클에 대 한 PCR 반응.
6. 1% (w/v) agarose에 PCR 반응 혼합물의 electrophorese 15 μ 젤 0.5 x Tris, 아세트산, 에틸렌 diamine tetra 아세트산 (EDTA) 실행 버퍼 (태)을 사용 하 여. 컨트롤 템플릿 하지 PCR에 의해 증폭 된 DNA의 상응 하는 금액 및 마커 밴드 모두 큰 고 예상된 PCR 제품의 크기 보다는 더 적은 포함 하는 참조 DNA 사다리의 약 수를 electrophorese.
7. 40 분 120 V에서 전기 이동 법, 후 잠수함 물 0.5 μ g/mL ethidium 평범한 사람 및 실 온에서 30 분 동안 동요에에서 젤. 전체 길이 서식 파일은 증폭 되었다 돌연변이 뇌관에 의해 증가으로 UV 빛에서 컨트롤 템플릿 밴드에 비해 증폭된 밴드의 상대 ethidium 평범한 사람 형광 강도 확인 (302 nm).
   1. 아무 증폭 명백한 경우 0.5 ° C 증가 53-56 ° C 온도 범위에서 어 닐 링 온도 조정 후 PCR을 반복.
8. 돌연변이 뇌관에 의해 템플릿의 증폭의 확인, 치료 DpnI 제한 효소 소화 methylated 템플릿 DNA PCR 반응 혼합물의 나머지 ~ 25 μ. DpnI를 사용 하 여 25 μ PCR 반응 혼합물 및 1 × DpnI 반응 버퍼의 마지막 농도 0.5 µ L (10 단위)에서. 2.5 h 37 ° c.에 대 한 품 어
9. 열 100 µ L 소화 혼합물의 5 ~ 10 μ 충격 1.75 mL microcentrifuge 튜브에 유능한 DH5α Esherichia 대장균 세포 추가 템플릿 소화, 다음. 60 분에 대 한 얼음에 세포 DNA 혼합물을 품 어
10. 열 충격 45 42 ° C에서 microcentrifuge 튜브에 세포 DNA 혼합물 건조 열 블록에 s. 3 분 동안 얼음에 혼합물, 잠복기 후 실내 온도 Luria Bertani 국물 (파운드)의 900 μ 셀 추가 하 고 총 세포 현 탁 액 살 균 14 mL 라운드-하단 튜브로 전송.
11. 190 rpm에서 일정 한 동요와 90 분 동안 37 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어.
12. 이후, 세포 현 탁 액 1.75 mL microcentrifuge 튜브 및 실 온에서 5 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기로 다시 전송.
13. 원심, 후는 상쾌한의 900 μ를 제거 하 고 부드러운 pipetting 파운드의 나머지 100 μ에 의해 세균성 세포 resuspend
14. 전송 식 벡터 (즉 60 μ g/mLKanamycin)에 대 한 선택은 항생제를 포함 하는 파운드-한 천 격판덮개에 결과 집중된 세포 현 탁 액. Aseptically 한 천 격판덮개에 균등 하 게 정지를 확산 하 고 37 ~ 16 h에 대 한 품 어 ° c.
15. 다음 날, antiobiotic 선택 압력 (예: 60 μ g/mL 대)를 포함 하는 액체 LB의 5 mL에 접시에서 단일 식민지를 예방. 성장 37에 지속적인 동요를 37 ° C에서 하룻밤 액체 문화 ° c.
16. 격리 및 ⁴⁵의 알칼리 성 세포의 용 해 절차 따라 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 대장균 세포에서 전파 된 플라스 미드 정화.
17. 관심의 돌연변이 존재 하 고 적절 한 독서 프레임 ⁴⁶ 플라스 미드 생어 DNA 연속 확인.

2. ¹⁵ BL21 ΔE3 대장균에 N 표시 된 단백질 식 통일.

참고: 다른 재조합 단백질 필요 다른 식을 조건. 다음은 인간 STIM1 EFSAM 단백질의 표현에 대 한 최적화 절차.

1. BL21 ΔE3 codon (+) 열 충격 유능한 세포에 Cys 변이 (즉: 애완 동물-28a-EFSAM)을 품고 식 벡터를 변환 하 고 1.9-1.14 단계에 설명 된 대로 항생제 선택의 압력을 포함 하는 파운드-한 접시에 접시)와 다음 수정: 직접 원심 분리에 의해 microcentrifuge 튜브에 세포를 집중 하지 않아도 파운드-한 접시에 ~ 1000 μ 총 세포 현 탁 액에서 약 150 μ 수 접시.
2. 다음 날, aseptically 200 mL 삼각 플라스 크를 포함 하는 적절 한 항생제 (예: 60 μ g/mL 대 애완 동물-28a-EFSAM에 대 한) 보충 파운드의 20 mL에 단일 식민지 전송. 이 액체 시 동기 문화 하룻밤 (즉 ~ 16 h) 37 ° C에서 일정 한 동요에 성장 ~ 190 rpm.
3. M9 준비 단계 2.2로 같은 날 ¹⁵ 압력가 마로 소독 하 여 N 표시 된 단백질 표정 매체 1 L m 9의 4 L 삼각 플라스 크에 소금 (42 m m 나 ₂ HPO ₄, 22 mM KH ₂ 포 ₄, 8.6 m m NaCl, pH 7.4)를 버퍼. 일단, 20% (w/v) D-포도 당, 1 M CaCl ₂, 1 M 티 아민, 1 M MgSO ₄, 1 mg/mL biotin, 0.2 g/mL ¹⁵ N-NH ₄ Cl의 혼합물 1 L 살 균 M9 소금 솔루션으로 0.2 μ m의 무 균 주사기 필터를 통해 필터링 되도록는 이러한 구성의 최종 농도 0.2% (w/v) D-포도 당, 100 μ M CaCl ₂, 50 μ M 티 아민, 1mm MgSO ₄, 1 μ g/mL biotin과 1 mg/mL ¹⁵ N-NH ₄ cl.
4. 다음 날, aseptically 50 mL 살 균 원뿔 튜브와 작은 셀을 15 분 동안 2400 × g에서 원심 분리기로 20 mL 하룻밤 액체 시 동기 문화를 전송.
5. 파운드 매체 decanting, 후 resuspend M9 최소 매체의 10 mL에 결과 셀 펠 릿 및 항생제 (예: 60 μ g/mL 대)와 M9 최소 매체의 1 L에 resuspended 펠 릿 혼합 전송.
6. 성장 포함 하는 37 ° C에서 600 nm (OD600)에 도달에서 광학 밀도까지 떨고 ~ 190 rpm 상수 세균 스타터 문화 M9 최소 매체의 1 L ~0.6-0.8.
7. Specfified OD600 범위에 도달 하면 추가 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside 단백질 표정 유도 (IPTG)의 200 μ M.
8. IPTG 추가 후 ~ 190 rpm ~ 16 h (즉, 하룻밤)에 대 한 지속적인 동요와 주위 온도에 단백질 식 세포를 배양 하는 것을 계속.
9. 다음 날, 수확 ~ 10000 × g, 30 분에 4 ° C에서 원심 분리 하 여 박테리아
10. LB를 가만히 따르다와 50 mL 원뿔 튜브로 셀 펠 릿을 전송. 정화까지-80 ° C에서 펠 릿 저장.

3. 대장균에서 재조합 형 단백질의 정화.

참고: 다른 재조합 단백질 별개 정화 절차 필요. 다음은 6 & # 215에 대 한 프로토콜; 애완 동물-28a 구문에서 표현 된 포함 시체에서 그의 태그 EFSAM 정화.

1. 수동으로 6 M guanidine-HCl, 20 mM Tris HCl (pH 8)에 냉동된 세균성 세포 pellet 균질 및 5mm β-mercaptoethanol 동력된 10 mL 전송 피 펫을 사용 하 여. Guanidine-HCl이이 단계에 대 한 젖은 셀 펠 릿의 5 mL 당 약 40 mL를 추가.
2. 다음는 90 분 부 화 교 잡 오븐에 일정 회전 주위 온도에 원심 ~ 15000 × g, 수용 성 단백질에서 불용 성 세포 파편 (즉 펠 릿)을 40 분 동안 8 ° C에 혼합물 혼합 (즉, 표면에 뜨는).
3. 50% (v/v) Ni ^{2 +}의 추가 750 µ L-nitrilotriacetic 산 agarose 구슬 슬러리는 명확히 lysate와 교 잡 오븐에 반전으로 실 온에서 또 다른 90 분 동안 품 어.
4. 이후, 6 × 태그 그의 단백질을 중력 흐름 단백질 정화 열에서 agarose 구슬 수집 하 여 Ni ^{2 +}에 바인딩된 캡처합니다. Lysate 3.5 단계로 이동 하기 전에 완전히 열을 통해 흐름을 허용.
5. 수집된 구슬 6 M 요소, 20 mM Tris HCl pH 8과 5 m m β-mercaptoethanol의 10 mL로 세 번 세척. 전체 10 mL 각 후속 10 mL 이전 열 통과 확인 워시
6. 6 M 요소, 20 mM Tris HCl pH 8를 사용 하 여 2 mL 분수의 시리즈에 있는 단백질을 elute 300mm 이미, 그리고 5mm β-mercaptoethanol 분수 사이 90 s 보육 시간. 전체 2 mL 각 후속 차입 단계 전에 열 통과 확인 하십시오.
7. 가이 단계에서 관심사의 단백질은 Coomassie 파란 얼룩이 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) ⁴⁷ Laemmli 방법을 사용 하 여 의해 eluted 분수에 확인. 둘 다 표준 분자량 마커 밴드에 대 한 단백질 크기, 양 및 순수성을 비교 하 여 평가 및 보다 적게 보다는 예상된 분자량 보다 큰 관심사의 단백질의.
8. 컷오프 3500 다 분자 무게와 투 석 막에 eluted 단백질 분수 수영장 및 4 ° C에서 1 L refolding 버퍼 (트리 스, 300 m m NaCl, 1 mM DTT, 5mm CaCl ₂, pH 8 m 20 m)에서 품 어 하룻밤 동안 버퍼는 자석과 의해 자극 되는 c 활동가.
9. ~ 16 h refolding 시간 후 ~ 1 투 석 가방에 직접 단백질의 밀리 그램 당 트 롬 빈의 U를 추가 하 고 추가 ~ 24 h. 4 ° C에서 품 어
10. 는 Coomassie 파란 얼룩이 ~ 15 μ 단백질 aliquots 트 롬 빈과 보육 전후 투 석 가방에서 가져온 polyacrylamide 젤 (SDS 페이지)를 사용 하 여 변성 시키기에 electrophoresed는의 지에 의해 그의 태그 분열 6 ×의 범위를 확인 Laemmli ⁴⁷의 방법입니다. 마이그레이션에 ~ 2 kDa 변화 그의 태그 쪼개진된 6 ×의 분자량에 해당 관찰, 3.11; 단계로 계속 경우 일부 소화 되지 않은 단백질 남아 있다 Coomassie 파란 얼룩에 의해 감지 되, 투 석 가방에 직접 단백질의 밀리 그램 당 트 롬 빈의 ~0.2 U를 추가 하 고 추가 ~ 24 h. 4 ° C에서 품 어
11. 더 사용 크기 또는 이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정화. EFSAM의 음이온 교환 크로마토그래피, 투 석 가방과 집중에서 단백질 솔루션 제거 ~는 10000 Da 분자량 컷오프로 한 원심 집중 장치를 사용 하 여 사진. 그 후, 다시 희석 솔루션 ~ 20-fold NaCl 무료 버퍼 (20 mM Tris, 5mm CaCl ₂, 1mm DTT, pH 8)에.
12. Prepacked 음이온 교환 열 단계 3.11에서에서 설명한 NaCl 무료 버퍼의 10 열 볼륨을 equilibrate. Equilibrate 로드 luer 잠금 주사기 dropwise 방식과 열 종료 솔루션의 꾸준한 흐름을 일으키는 원인이 되는 피하 주사기 압력 열을 통해 솔루션을 추진 하 여 아무 공기 방울을 포함 하는 버퍼를 사용 하 여. (예: 4 급 암모늄 기능 그룹으로 가교 된 agarose) 강한 음이온 교환기를 사용 하 여.
13. NaCl 무료 (단계 3.11) 버퍼 열에 희석 단계 3.12에서에서 설명한 단백질 솔루션 로드.
14. 그라데이션에 단백질을 elute [즉, 0-60% (v/v)] NaCl 증가의 버퍼 (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5mm CaCl ₂, 1mm DTT, pH 8) 2-펌프 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템을 사용 하 여. FPLC 시스템 ~1-1.5 mL 분수를 수집 하 고 모니터링 UV 280 nm 흡 광도 사용 하 여 단백질 차입 프로필을 설정 하 고 흐름 속도 0.5 mL/분
15. 차입 봉우리와 분수 뿐만 아니라 단백질 순도 Coomassie 파란 얼룩이 SDS 페이지 젤 Laemmli ⁴⁷의 방법을 사용 하 여 관심사의 단백질에 포함 된 식별.
16. 풀 분수 보여주는 > 95% (즉 분수 Coomassie 파란 얼룩이 젤에만 단일 단백질 밴드를 표시로 찍은) 투 석 가방 및 투 석 단계 3.8에서에서 설명한 대로 의해 관심의 실험적인 버퍼 교환으로.

4. 투 석 하 여 단백질을 포도 당-5-MTS 화학 부착.

1. 준비 55 m m a N-(β-D-glucopyranosyl)-N의 재고 솔루션 '-[2-methanethiosulfonyl) 에틸] 10 mg의 100% (v/v) DMSO의 500 μ에 화합물을 용 해 하 여 우 레 아 (포도 당-5-MTS). 사용 하지 않는 포도 당-5-MTS-20에서 DMSO에서 solubilized 저장 ° c.
2. 준비 수정 1 리터에 ~ 60 μ M 단백질의 dialyzing 1.5 mL 수정에 대 한 단백질 견본 버퍼 20mm MOPS, 150 mM NaCl, 5mm CaCl ₂와 0.1 m m TCEP, pH 8.3의 구성. 사용 하는 투 석 막 분자량 컷오프는 수정 되 고 단백질의 크기 보다 작은 (예: 17500 ~ 다 EFSAM에 대 한 3500 다 구분 사용).
3. 후 24 h 4 ° C에서 microcentrifuge 튜브로 투 석 가방에서 샘플을 전송. 2mm의 최종 농도 DMSO solubilized 포도 당-5-MTS 추가.
4. 주위 온도에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어. 1 시간 잠복기 동안 혼합 솔루션 튜브의 부드러운 드려서 10 분 마다
5. 이후에, 다시 4.2 또는 원심 한 단계에서 설명한 대로 4 ° C에서 투 석 하 여 아무 환 원제를 포함 하는 최종 실험 버퍼에 단백질 교환. 적용 절차에 대 한 집중 ~1.5 mL 단백질 샘플을 < 0.5 mL 이후에 실험 버퍼와 같은 집중에 희석. 반복이 농도 희석 단계 2 추가 번 총 exchange는 최소 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. EFSAM, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5mm CaCl ₂, 실험적인 버퍼 pH 7.5 사용.
6. 투 석 또는 한 exchange 25 m m 염화 중 탄산염 또는 25 mM 암모늄 아세테이트로 각각 4.2와 4.5, 단계에서 설명한 대로 의해 분무 이온화 질량 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다. 투를 사용 하 여, 모든 잔여 NaCl와 CaCl ₂ 소금 제거를 적어도 세 번을 교환 확인.
7. 정확한 질량을 결정 (예: ± 1 다) 분무 이온화를 사용 하 여 관심사의 단백질의 대량 분석 ^{48 , 49}. Methanethiosulfonate 화학 281.3 다 단백질에 추가를 통해 Cys thiol 각 공유 포도 당 뿐만 아니라 기대 질량 (360.4 다 포도 당 5 MTS에 대 한 추가 및 공유 하는 동안 그룹 ₂ 떠나 그래서 채널 ₃ 79.1 다 빼기 첨부 파일).

5. Modif 솔루션 NMR 평가ication 효율성과 구조 섭.

이 방법의 첫 번째 단계 하려면 포도 당-5-MTS. EFSAM를 사용 하 여 수정할 수 있는 Cys의 잔류물을 후보 glycosylation 잔류물의 mutagenesis 아무 특별 한 고려 사항 이전에 만들어질 필요가 없는 생 Cys 잔류물에는 mutagenesis입니다. 그러나, 네이티브 Cys 잔류물 설명된 화학을 수행 하기 전에 수정 불가능 잔류물을 변경 해야 합니다. 최소한 기본 구조 효과, 우리 관심사의 단백질의 글로벌 시퀀스 정렬 수행 제안 하 고 가장 자주 생 Cys에서 position(s) 발견 다른 잔류물 확인. 다른 유기 체에서 자연스럽 게 발생 하는 이러한 다른 잔류물에 Cys 돌연변이 단백질 구조에 최소 영향을 할 수 있습니다. 생 Cys의 잔류물이 엄격 하 게 보존 하는 경우는 가장 구조적으로 유사한 Cys Ser을 변경 하는 것이 좋습니다. 그림 1 에서는 일반적인 PCR mutagenesis 젤 unamplified 템플릿 애완 동물-28a DNA는 PCR를 위해 사용 되었다의 제어 금액 보다 몇 높은 강도 보여 주는 증폭 된 DNA 샘플을 PCR 반응의 성공 평가. 다음 단계는 서식 파일 DNA 소화 및 플라스 미드 수리에 대 한 대장균 으로 변환 포함 됩니다. 액체 문화, 플라스 미드 분리 및 연속 mutation(s)의 확인에 플라스 미드 전파, 후 돌연변이 벡터 단백질 식에 사용할 수 있습니다. 그림 2A 는 NaCl 농도 증가 상대적인 음이온 교환 열에서 EFSAM의 전형적인 차입 프로필을 보여 줍니다. 그림 2B Coomassie 파란 얼룩이 SDS 페이지 젤에 EFSAM의 순수성을 보여줍니다.

순수 단백질, 취득 후 일련의 투 석 단계 무료 thiol와 MTS 반응을 통해 포도 당 moiety를 연결 하는 데 사용 됩니다. 그림 3A 작은 단백질 볼륨의 전형적인 설정의 이미지는 투 석 막으로 막 클립 봉인 관심의 버퍼를 포함 하는 큰 1 리터 비 커에 포함 된 보여줍니다. 질량 분석에 의해 수정 성공의 초기 검사를 수행할 수 있습니다. 그림 3B 단일 Cys thiol에 EFSAM의 대표 분무 질량 스펙트럼을 보여준다. 특정 단백질에 대 한 프로토콜의 설립, 다음 수정 효율성 및 구조적 섭 평가 될 수 있다 단일에서 균일 ¹⁵N 표시 된 샘플. ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼 전과 원제 DTT (그림 4A)의 추가 후에 취득 된다. 아 미드 피크 농도 프로토콜 단계 5.8 (그림 4B)에서 설명한 대로 수정 및 감소 된 스펙트럼의 비교를 통해 수정 효율의 계산을 만들 수 있습니다. 마지막으로 때 화학 변화 과제는 단백질 구조 변경과 상관에서 상세한 단계 5.9 (그림 4C)로 계산할 수 있다 Csp에 대 한 알려져 있다.

그림 1: DNA agarose 젤 돌연변이 뇌관 서식 파일 벡터의 증폭 검사를 보여주는.
이미지 표시 1.0% (w/v) agarose 젤 DNA 마커 (M), 벡터 제어 (VC) 및 템플릿 PCR 증폭 (PCR). DNA는 0.5 x TAE 버퍼에서 45 분 120 V에서 전기 이동 법으로 분리 되었다. 총 0.5 ng VC의 로드, 서식 파일의 금액에 해당 PCR 레인에 로드. 젤은 UV 빛에서 시각화 이전 20 분 ethidium 평범한 사람 (~0.5 μ g/mL)을 사용 하 여 스테인드 (302 nm). 젤 (검은 화살표) 벡터의 예상된 크기에 가까운 증폭 된 DNA의 높은 수준을 보여 줍니다. 두 번째 밴드는 1, 000와 1500 bp 마커 밴드 사이의 가능성이 실행 PCR 레인에서 비 특히 증폭 된 PCR 제품을 나타냅니다. 증폭 된 DNA의 강도 성공적인 것으로 간주 될 VC 강도 수준 보다 높은 해야 합니다. 다른 여러 가지 DNA 염료 ethidium 평범한 사람 (예를 들어 참조 ⁵⁷) 얼룩에 더 적은 변이 원 성, 안전 대신 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 전형적인 컬럼에 정화 고 순도 STIM1 EF-샘에 대 한 확인.
(A) 음이온 교환 크로마토그래피 차입 프로필 STIM1 EF-샘의. 수동 바인딩 후 기본 pH와 주사기, 낮은 NaCl 농도에서 음이온 교환 열 (Q FF)에 EF-샘과 AKTA FPLC (GE 헬스케어) NaCl 그라데이션으로 단백질을 elute 데 사용 됩니다. 차입 AKTA UV 280 nm 신호를 사용 하 여 1 M NaCl의 0-60% (v/v) 기온 변화도에 의해 모니터링 됩니다. (B) Coomassie 파란 얼룩이 SDS 페이지 젤 (A)에서 차입 분수의. 변성 단백질 젤 EF-샘 두 주요 봉우리 ~ 250 m m와 ~ 450 m m NaCl elutes 보여준다. 정화 프로토콜 수익률 > 95% 순수 EF-어떤 오염 물질의 부족에 의해 입증으로 샘 밴드 Coomassie 파란 얼룩이 젤에 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 투 석 설치 및 단백질 glycosylation 생체 외에서 의 확인.
(A) 전형적인 투 석 설치 생체 외에서 포도 당을 부착 Cys thiol MTS 반응성을 통해 사용 합니다. 화면은 투 석 배관에 대 한 버퍼에 포함 된 단백질의 ~1.5 mL ~ 1 L 실험 버퍼의. 버퍼 전체 교환 되도록 흔들 지속적으로 중요 하다. 이미지는 microcentrifuge 튜브를 투 석 백의 침 몰을 방지 하기 위해 회전 저 어 바에 의해 손상 초과 투 석 튜브까지 보여줍니다. (B) 분무 이온화 질량 스펙트럼 수정된 Asn171Cys EF-샘 단백질의. 질량 분석은 수정 절차 성공 여부를 평가 하기 위해 편리 하 고 정확한 방법입니다. 전형적인 질량 크로마 이론 및 측정 된 질량의 수정 되지 않은 및 수정 Asn171Cys EF-샘 표시와 함께 표시 됩니다. 대부분 샘플의 질량 ~1.3 예상된 이론 질량의 포도 당 활용 Asn171Cys EF-샘의 다 내 고분자에 해당. (B 에 데이터) 합니다 고 ⁴²에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 단일 NMR 샘플에서 수정 효율성 및 구조적 섭의 솔루션 NMR 평가.
(A) ¹ H¹⁵N HSQC 스펙트럼 오버레이 (레드 crosspeaks) 전에 Asn131Cys EFSAM 포도 당 활용의 전후 (블랙 crosspeaks) 15mm DTT의 추가. 오버레이 명확 하 게 몇 가지 잔류물 관련 아 미드 화학 변화 변화 단백질 및 구조 섭의 두 수정 나타내는 보여줍니다. 빨간색 상자는 Asn131Cys 아 미드의 위치를 보여줍니다. (B) Asn131Cys 아 미드를 포함 하는 ¹H-¹⁵N HSQC 영역의 Zoomed 보기. 수정 된 스펙트럼 (I_M)에 Asn131Cys 아 미드 피크의 강도 (I_R) 감소 (수정된) 스펙트럼의 강도 의해 효율 (그림 참조)의 계산에 대 한 나누어져 있습니다. 여러 영향된 잔류물의 평균 효율의 계산 오류 견적을 포함 하 여, 효율성의 더 나은 견적을 제공 합니다. 평균 효율 Asn131Cys EFSAM 5 잔류물 (즉, 129-133)에 따라 표시 됩니다. (C) 정규화 화학 변화 섭 Asn131Cys EFSAM 단백질을 포도 당 활용으로 인 한. HSQC 실험 세트 수집 하기 전에 단일 샘플에서 환 원제로 보충 뿐만 아니라 피크 강도 분석 [ (B)에 표시 된]에 의해 수정 효율의 편리한 예상 제공 하지만 대 한 데이터도 제공 합니다. 구조 변경 관련 수정 된 평가. 포도 당 활용 하면 위치 131; 근처 지역화 최대 섭 그러나,이 분석이 보여준다 섭을이 분석 값을 나타내는 시퀀스 근접에 전적으로 기반으로 예상 되지 않습니다. (C) 데이터 합니다 있으며 ⁴²에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1입니다. 애완 동물-28a STIM1 EFSAM 내의 Cys mutagenesis에 Asn 예 oligonucleotide (뇌관) 시퀀스를 생성합니다.

단백질 glycosylation 설탕 covalently 주로 아미노산 사이드 체인 관계를 통해 polypeptides에 연결 된 포스트 번역 상 수정입니다. 많은 포유류 단백질의 50%는 당화 ⁵⁴, 당화 단백질 수 이후에 있는 다양 한 바이오 바인딩 선호도 변경에서 효과, 단백질 폴딩, 채널 활동을 변경, 대상에 영향을 미치는 저하 및 셀룰러 (³³에서 검토 한 결과) 몇 가지 이름을, 인신 매매에 대 한 분자. 포유류의 생리학에서 glycosylation의 중요 한 역할 구축 포유류 glycan 구조 ³³의 전체 다양성을 진화 하는 단백질의 몇몇 수백에 의해 분명 하다. 변경 N-및 O-glycosylation 패턴 연관 수많은 질병 전립선 (증가 감소), 유 방 (증가 감소)를 포함 하 여 간 (증가), 난소 (증가), 췌 장 (증가) 그리고 위 암 (증가) ⁵⁵. 또한, 타우, huntingtin, glycosylation α-synuclein 발견 되었습니다. 규제 Alzheimer, 헌팅턴의와 파 킨 슨 병의 질병 ⁵⁶와 관련 된 이러한 단백질의 독성 그리고 glycosylation의 선 천 성 장애의 그룹 되었습니다. 효소를 중재 glycosylation ⁵⁴에 상속 결함이 발생 확인. 따라서, glycosylation의 정확한 생물, 생화학 및 구조 효과 이해 대단히 단백질 규제 및 건강과 질병에서 함수에 대 한 우리의 이해에 영향을 줄 가능성이 있다.

Glycan 구조 포유류 glycome에서의 다양성으로 이어질 10 설탕 빌딩 블록 포함 fucose, 갈 락 토스, 포도 당, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucuronic 산, iduronic 산만 노 오 스, sialic 산 및 xylose ³³. Oglycosylation Nacetylgalacotose, N-acetylglucosamine, xylose, fucose의 어떤에서 발생할 수 있습니다 동안 Nglycosylation 변함없이 링크 하지는 N-acetylglucosamine 설탕 단백질에 직접, 포도 당 또는 갈 락 토스는 polypeptide에 연결 covalently. 이러한 설탕 단백질 표면에 인접 한 생물 및 구조 특성에 미치는 영향을 이해 하기 시작, 우리가 설명 여기 설탕 Cys의 잔류물 단백질으로 설계 하는 thiols 통해 사이트에 선택적으로 연결할 접근 시퀀스입니다. 여기, 당화 Cys로 대체 하 고 체 외에 는 간단한 화학 방법을 통해 수정 endogenously는 잔류물. 이러한 방식으로, 단일 및 다중 glycosylation 사이트 애타게 폴딩 및 안정성 뿐만 아니라 전체 구조에 누적 수정 및 각 특정 사이트의 기여와 단백질의 기능을 부과 수 있습니다.

최근,이 접근을 개별적으로 그리고 누적 평가는 Asn131 및 Asn171 N-glycosylation 사이트 ⁴²의 역할 EFSAM와 함께 사용 성공적으로 되었습니다. Cys 돌연변이 포도의 공유 첨부 파일을 Asn131 또는 Asn171 사이트에 감소 Ca^{2 +} 바인딩 선호도 공개 하 고 안정성을 억제. 때 두 사이트 동시에 포도 당 첨부 파일, 바인딩 선호도 감소와 수정 및 안정성으로 이끌어 potentiated 했다 oligomerization 성향 시험관을 향상. 구조적으로, 여기에 설명 된 방법은 Asn131 또는 Asn171 수정 상호 SAM 도메인, EF 손 쌍에 인접 한에 있는 코어 α8 나선 교란 보여주었다. 이 구조 분석 단백질의 표면에 포도 당 수정 과정 안에서 수렴 하 고 potentiated 구조 변화를 리드 하는 어떻게 expounds-궁극적으로 단백질 destabilizes 그리고 SOCE ⁴²향상 손: 샘 인터페이스.

더 이상 탄수화물 응급실에 연결할 어떻게 EFSAM의 표면 가까이 단 당 류 효과 폴딩, 안정성 및 구조,이 절차에 도움이 헛간 빛 수 쉽게이 사이트 선택 방법의 응용 프로그램을 수정 하는 동안 골 및 오후 지역화 (즉, glycosylation의 상태 다른 성숙), 거기에 제공 되는 thiols와 같은 MTS. MTS 바람직 thiol 수정 이기 때문에 되돌릴 수 사용 하 여 연결할 수 있는 기능 그룹에 포함 된 이러한 탄수화물에 대 한 신뢰할 수 있는 소스는 원제와 참조 스펙트럼 쉽게 취득 될 수 있다. 이 방법은 또한 다른 닢 moieties 지질 같은 단백질에 연결할 적용할 수 있습니다. 동시에 고려 한다이 방법 몇 가지 제한이 있습니다. 먼저, 메서드 glycosylation 사이트 구조, 안정성 및 접는 포도 당 수정의 부재에도 영향을 미칠 수 있는 Cys의 돌연변이에 의존 합니다. 마찬가지로, 단백질에서 네이티브 Cys의 잔류물도 포도 당화가 아닌 사이트에서 첨부 파일을 방지 하기 위해 변경 해야 합니다. 또한, 종종 Cys의 잔류물의 추가 더 도전 정화를 만드는 Cys 가교 및 misfolding, 박테리아에 포함 체 형성을 촉진 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 사이트 선택 Cys 가교 방법은 여기에 설명 된 특정 glycosylation 사이트의 높은 수준의 요구 하는 실험에서의 구조적, 생화학 및 생물 효과 애타게 제어 수단을 제공 합니다. 균질 단백질입니다. 효과의 구조에 기본이 아닌 Cys 잔류물, 안정성과 접는 수 수 단순히 ascertained 수정 비교 하 여에 야생-타입의 부재에 단백질 특성 ⁴². 기능 데이터 표현 (예: Asn-하-Ala) 단백질의 돌연변이 체 버전 수정 차단 하는 진 핵 세포에서 얻은 함께 찍은, 현재 기술된 접근 단백질의 구조적 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 것입니다. 포스트 번역 상 수정에 의해 규정입니다.

이 연구는 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 (P.B.S.에 05239), 캐나다 재단에 의해 지원 되었다 혁신/온타리오 연구 기금 (P.B.S.), 전립선 암 싸 워 재단-Telus 타고 아빠 (P.B.S.) 하 고 온타리오에 대 한 (Y.J.C. N.S.)를 대학원 장학입니다.