Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

Des analyses biochimiques et structurales des protéines glycosylées exigent des quantités relativement importantes des échantillons homogènes. Nous présentons ici une méthode chimique efficace pour in site glycosylation des protéines recombinantes purifiée à partir de bactéries en ciblant les réactifs Cys thiols.

Stromale interaction molécule-1 (STIM1) est un type-j’ai une protéine transmembranaire située sur le réticulum endoplasmique (re) et la membrane plasmique (PM). STIM1 ER-résident réglemente l’activité des canaux PM Orai1 dans un processus connu comme stocker entrée de commande de calcium (Ca^{2 +}) qui est le principal Ca^{2 +} signalisation processus qui entraîne la réponse immunitaire. STIM1 subit post-traductionnelles N- glycosylation sur deux sites de crash luminales au sein du Ca^{2 +} détection domaine de la molécule. Toutefois, la biochimiques, biophysiques, et effets biologiques structure des N- glycosylées STIM1 ont été mal compris jusqu'à ce que récemment en raison de l’incapacité d’obtenir facilement des niveaux élevés de homogène N- glycosylées protéine. Nous décrivons ici la mise en œuvre d’une approche in vitro chimique qui s’attache à moitiés de glucose aux sites de protéine spécifique applicables à la compréhension des effets sous-jacents de N- glycosylation sur le mécanisme et la structure des protéines. En utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire de solution, nous évaluons les deux l’efficacité de la modification, ainsi que les conséquences structurelles de l’attachement de glucose avec un seul échantillon. Cette approche peut facilement être adaptée pour étudier les protéines glycosylées myriad trouvées dans la nature.

Stocker les exploités de calcium (Ca^{2 +}) entrée (SOCE) est la principale voie par laquelle les cellules immunitaires prennent Ca^{2 +} de l’espace extracellulaire dans le cytosol. Dans les lymphocytes T, lymphocytes T récepteurs situés sur la membrane plasmique (PM) lient antigènes qui activent la protéine-tyrosine kinases (évaluées à ^1,2,3). Une cascade de phosphorylation entraîne l’activation de la phospholipase-γ (PLCγ) qui intervient par la suite dans l’hydrolyse de la membrane phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP₂) en diacylglycérol et inositol 1,4,5-trisphosphate (IP₃ ). IP₃ est un petit Messager diffusible qui se lie aux IP₃ récepteurs (IP₃R) sur le réticulum endoplasmique (re) ainsi ouvrir ce canal récepteur et permis Ca^{2 +} s’écouler dans le gradient de concentration de l’ER Lumen dans le cytosol (évaluée à ⁴). Signalisation des protéines G couplées et récepteurs à tyrosine kinase dans une variété d’autre cellules excitables et non-excitables types plomb pour la même production d’IP₃ et l’activation des IP₃Rs de récepteur.

En raison de la Ca^{2 +} stockage capacité finie de l’urgence, l’IP₃-communiqué de la médiation et augmentation résultante cytosolique Ca^{2 +} est seulement transitoire ; Toutefois, cette diminution de l’ER luminale Ca^{2 +} effets profondément stromales interaction molécule-1 (STIM1), un type-je transmembranaires (TM) protéines surtout présents sur la membrane de ER ^5,6,7. STIM1 contient un lumen orienté Ca^{2 +} détection domaine composé d’une paire de main EF et du α-motif (EFSAM). Coiled-coil de cytosolique axé sur trois domaines sont séparés des EFSAM par le seul domaine de TM (évaluée à ⁸). Sur ER luminale Ca^{2 +} l’appauvrissement, EFSAM subit une oligomérisation couplés déstabilisation ^7,9 , qui provoque des réarrangements structuraux de la TM et domaines coiled-coil ¹⁰. Ces changements structurels aboutissent à un piégeage de STIM1 ER-PM jonctions ^11,12,13,14 , grâce à des interactions avec les PM phosphoinositides ^{15, 16} et Orai1 sous-unités ^17,18. Orai1 protéines sont les sous-unités de PM qui assemblent pour former Ca^{2 +} canaux ^19,20,21,22. Les interactions de STIM1-Orai1 au niveau des jonctions ER-PM facilitent une Ca^{2 +} déblocage activé Ca^{2 +} (CRAC) canal conformation ouverte qui permet le mouvement de Ca^{2 +} dans le cytosol de la concentration élevée de la espace extracellulaire. Dans les cellules immunitaires, les soutenue cytosolique Ca^{2 +} élévations via les canaux CRAC induisent la Ca^{2 +}- calmoduline/calcineurine dépendante déphosphorylation du facteur nucléaire des lymphocytes T activés qui par la suite entre le noyau et commence la régulation transcriptionnelle des gènes favorisant l’activation de lymphocytes T ^1,3. Le processus d’activation canal CRAC par STIM1 ^23,24 via induite par l’agoniste ER luminale Ca^{2 +} l’appauvrissement et la résultante soutenue cytosolique Ca^{2 +} élévation est collectivement appelé SOCE ²⁵. Le rôle vital de SOCE en lymphocytes T est évident par les études qui ont démontré que des mutations héréditaires dans les STIM1 et les Orai1 peuvent causer des déficit immunitaire combiné sévère syndromes ^{3,19,26, 27}. EFSAM initie SOCE après détection ER-luminale Ca^{2 +} épuisement par la perte de Ca^{2 +} coordination à la main EF canonique, conduisant finalement à la déstabilisation couplés auto-association ^{7, 28,},²⁹.

La glycosylation est la covalente et la transformation des structures oligosaccharide, également connu sous le nom de glycanes, à travers différentes étapes biosynthétiques de l’ER et Golgi (évaluée à ^30,32,,³³). Il existe deux types prédominants de glycosylation chez les eucaryotes : N-liés et O-liée, selon les acides aminés spécifiques et l’atome de la liaison de raccordement. Dans la N- glycosylation, glycanes sont attachés à l’amide de chaîne latérale de l’Asn, et dans la plupart des cas, l’étape d’initiation se produit dans la salle d’urgence comme le polypeptide chaîne se déplace dans le lumen ³⁴. La première étape de la N- glycosylation est le transfert d’une structure de base de quatorze-sucre composé de glucose (Glc), mannose (Man) et N- acétylglucosamine (GlcNAc) (c.-à-d. Glc₃Man₉GlcNAc₂) de l’ER membrane lipidique par un oligosaccharyltransferase ^35,36. Des mesures supplémentaires, telles que le clivage ou le transfert des résidus de glucose, sont catalysées aux urgences par des glycosyltransférases et glycosidases spécifiques. Certaines protéines qui quittent la salle d’urgence et passer dans l’appareil de Golgi peuvent être encore transformés ³⁷. O- glycosylation se réfère à l’ajout des glycanes, habituellement au groupe hydroxyle côté chaîne de résidus Ser ou Thr, et cette modification a été apportée tout à fait dans l’appareil de Golgi ^33,34. Il y a plusieurs structures de O- glycanes qui peuvent être constitués de N- acétylglucosamine, fucose, galactose et l’acide sialique avec chaque monosaccharide ajouté séquentiellement ³³.

Alors qu’aucune séquence spécifique n’a été identifié comme condition sine qua non pour de nombreux types de O- glycosylation, une séquence consensus commun a été associée avec le N-liée modification : Asn-X-Ser/Thr/Cys, où X peut être n’importe quel acide aminé sauf Pro ³³. STIM1 EFSAM contient deux de ces sites de glycosylation - consensus N: Asn131-Trp132-Thr133 et Asn171-Thr172-Thr173. En effet, des études antérieures ont montré que EFSAM peut être N- glycosylées en cellules mammifères Asn131 et Asn171 ^38,39,40,41. Toutefois, des études antérieures des conséquences de la N- glycosylation sur SOCE ont été incongrues, suggérant supprimée, potentialise ou pas d’effet de cette modification post-traductionnelle SOCE activation ^38,= « xref » > 39^,40,41. Ainsi, la recherche sur les conséquences structurels, biochimiques et biophysiques sous-jacents de EFSAM N- glycosylation est essentielle pour comprendre les effets régulateurs de cette modification. En raison de l’exigence pour les niveaux élevés de protéines homogènes dans ces expériences in vitro , a appliqué une approche sélective des site pour attacher par covalence moitiés de glucose à EFSAM. Fait intéressant, Asn131 et Asn171 de glycosylation causé des changements structurels qui convergent dans le cœur EFSAM et d’améliorer les propriétés biophysiques qui favorisent la médiation STIM1 SOCE ⁴².

La fixation chimique du glycosyl groupes thiols Cys a été bien établie par un ouvrage qui tout d’abord démontré l’utilité de cette approche sans enzymes pour comprendre les effets propres au site de glycosylation sur protéine fonction ^{43 , 44}. plus récemment et en ce qui concerne les STIM1, les résidus Asn131 et Asn171 ont été mutés à Cys et glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] a été utilisé de façon covalente lier glucose à thiols libres ⁴². Nous décrivons ici, cette approche qui non seulement utilise mutagénèse d’incorporer les résidus Cys spécifiques de site pour modification, mais s’applique également à spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) solution pour évaluer rapidement l’efficacité modification tant structurels perturbations suite à la glycosylation. Notamment, cette méthodologie générale est facilement adaptable pour étudier les effets de l' O- ou N- glycosylation d’une inoculation produit protéique.

1. réaction en chaîne par polymérase (PCR)-médiée par mutagénèse dirigée pour l’incorporation de Cys dans un vecteur d’expression bactérienne pET-28 a.

1. Déterminer la concentration du vecteur animal-28 a (c'est-à-dire ADN bicaténaire) en utilisant un coefficient d’extinction ultraviolet (UV) de 0,020 (μg/mL) cm ^-1 à 260 nm.
2. Synthétiser une paire d’amorces mutagéniques complémentaires pour chaque mutation Cys telle j’ai) il y a un minimum de 15 nucléotides complémentaires pour le modèle avant l’incompatibilité de la première base et 15 nucléotides complémentaires pour le modèle après le incompatibilité de base finale, ii) longueur totale apprêt n’excède pas 45 nucléotides et iii) une guanine ou cytosine est situé à la position du premier et le dernier nucléotide de chaque amorce (tableau 1). Assurer la synthèse de l’apprêt est effectuée en utilisant une purification d’échelle et la cartouche de 0,025 μmol.
3. à l’aide d’une haute fidélité ADN polymérase, mis en place deux 20 µL PCR réaction des mélanges : celui contenant l’amorce vers l’avant et le second contenant l’amorce de marche arrière. Préparer chaque mélange pour contenir la concentration finale de 1 x PCR tampon avec 1,5 mM MgCl ₂, dNTPs mM 0,2, 0,5 μM primer, 0,4 μL DMSO, modèle de ng/μL 1.25 0,02 U/μl haute fidélité ADN polymérase ADN.
4. Cycle thermiquement les mélanges distincts à l’aide d’un protocole de trois étapes : 98 ° C pendant 30 s (dénaturation), 53-56 ° C pendant 30 s (recuit), 72 ° C 30 s kilobase(kb) ^-1 (extension) du modèle de l’ADN. Répéter le programme de température pour 5 cycles et ajouter une étape d’extension finale 72 ° C pendant 7,5 min.
5. Après l’initiale PCR avec des amorces et inverses dans des tubes distincts, combiner les produits dans un tube unique (c'est-à-dire 40 μL de total) et continuer la réaction PCR pendant une 20 cycles supplémentaires en utilisant les mêmes paramètres de cyclisme comme indiqué au point 1.4.
6. Electrophorese 15 μl du mélange réactionnel PCR sur un gel d’agarose de 1 % (p/v) de gel à l’aide de 0,5 x Tris, l’acide acétique, acide acétique éthylène diamine tétra (EDTA) tampon (TAE). En tant que contrôles, electrophorese une quantité équivalente d’ADN qui n’a pas été amplifiés par PCR et une portion de l’échelle d’ADN de référence qui contient des bandes de marquage fois supérieur et inférieur à la taille prévue du produit PCR.
7. Après électrophorèse à 120 V pendant 40 min, submerger le gel dans l’eau contenant 0,5 bromure d’éthidium μg/mL et agiter pendant 30 min à température ambiante. Confirmer le modèle pleine longueur a été amplifié par les amorces mutagéniques comme une augmentation dans l’intensité de fluorescence de bromure d’éthidium relative de la bande amplifiée par rapport à la bande de modèle de contrôle sous la lumière ultraviolette (302 nm).
   1. Si aucune amplification n’est apparente, répéter la PCR après avoir réglé la température de recuit entre la plage de température de 53-56 ° C par incréments de 0,5 ° C.
8. Lors de la confirmation de l’amplification du modèle par les amorces mutagènes, traiter le μL de ~ 25 restant du mélange réactionnel PCR avec l’enzyme de restriction DpnI pour digérer le modèle méthylé ADN. Utilisez DpnI à 0,5 µL (10 unités) par 25 μL PCR réaction mélange et une concentration finale de 1 × DpnI tampon de réaction. Incuber pendant 2,5 heures à 37 ° C.
9. Après la digestion de modèle, ajoutez environ 5-10 μL du mélange digéré à 100 µL de chaleur choc compétente DH5α Escherichia coli cellules dans un tube de microcentrifuge de 1,75 mL. Incuber le mélange cellulaire-ADN sur la glace pour 60 min.
10. Choc thermique le mélange de l’ADN cellulaire dans le tube de microcentrifuge à 42 ° C pendant 45 s sur un bloc de chaleur sèche. Après incubation le mélange sur la glace pendant 3 min, ajouter 900 μL de bouillon de la température de la pièce Luria-Bertani (LB) dans les cellules et transférer la suspension totale de cellules dans un tube à fond rond stérile de 14 mL.
11. Incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 90 min avec une agitation constante à 190 tr/min.
12. Par la suite, transfert de la suspension de cellules dans un tube de microcentrifuge de 1,75 mL et centrifuger à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
13. Après la centrifugation, supprimer 900 μl du liquide surnageant et remettre en suspension les cellules bactériennes par pipetage doux dans le reste de 100 μL de lb
14. Transférer la suspension concentrée des cellules résultantes sur un LB-gélose contenant antibiotique qui est sélectif pour le vecteur d’expression (c'est-à-dire 60 μg/mLKanamycin). Étendre la suspension uniformément sur la gélose de façon aseptique et incuber pendant environ 16 heures à 37 ° C.
15. Le lendemain, ensemencer une seule colonie de la plaque dans 5 mL de liquide LB contenant la pression de sélection des antibiotiques (c.-à-d. 60 μg/mL kanamycine). Cultiver la culture liquide pendant une nuit à 37 ° C sous agitation constante à 37 ° C.
16. Isoler et purifier le plasmide propagé par les cellules d’e. coli à l’aide d’un kit disponible dans le commerce basé sur la procédure de lysis alkalin ⁴⁵.
17. Confirmer la mutation d’intérêt est présent et dans le cadre de lecture adéquat par séquençage de l’ADN Sanger du plasmide ⁴⁶.

2. Uniforme de ¹⁵ expression de la protéine N-étiquetés dans BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Remarque : différentes protéines recombinantes exigent des conditions d’expression différente. Voici la procédure optimisée pour l’expression de la protéine humaine de STIM1 EFSAM.

1. Transformer le vecteur d’expression contenant les mutations Cys (c.-à-d. pET-28 a-EFSAM) en cellules compétentes ΔE3 choc codon (+) BL21 thermiques et plaque d’identification sur LB-géloses contenant la pression de sélection antibiotique comme décrit aux étapes 1,9-1.14) avec la après modifications : plaque directement une partie aliquote de 150 μL de la suspension cellulaire totale de ~ 1 000 μL sur la gélose LB sans la nécessité de concentrer les cellules dans un tube de microcentrifuge par centrifugation.
2. Le lendemain, transvaser aseptiquement une seule colonie dans un erlenmeyer contenant 20 mL de LB additionné de l’antibiotique approprié (c.-à-d. 60 de kanamycine μg/mL pour animal de compagnie-28 a-EFSAM) de 200 mL. Se développer cette culture starter liquide pendant la nuit (soit environ 16 h) à 37 ° C sous agitation constante à ~ 190 tr/min.
3. Le même jour que l’étape 2.2, préparer M9 moyenne pour ¹⁵ expression de la protéine N-étiqueté à l’autoclave 1 L de M9 tampon sels (42 mM Na ₂ HPO ₄, 22 mM KH ₂ PO ₄, 8,6 mM NaCl, pH 7,4) dans une fiole d’Erlenmeyer de 4 L. Une fois refroidi, filtrer un mélange de 20 % (p/v) de D-glucose, 1 M CaCl ₂, thiamine 1 M, 1 M MgSO ₄, biotine 1 mg/mL et 0,2 g/mL ¹⁵ N-NH ₄ Cl à travers un filtre de seringue stérile 0,2 μm dans la solution saline du M9 stérile 1 L pour que la la concentration finale de ces composants est de 0,2 % (p/v) de D-glucose, 100 μM CaCl ₂, 50 thiamine μM, 1 mM MgSO ₄, 1 biotine μg/mL et 1 mg/mL ¹⁵ N-NH ₄ CL.
4. Le lendemain, transférer stérilement la culture 20 mL de liquide démarreur pendant la nuit dans un tube conique stérile de 50 mL et centrifuger à 2 400 × g pendant 15 min pour les cellules de granuler.
5. Après décantation le milieu LB, resuspendre le culot cellulaire résultant dans 10 mL de milieu minimal M9 et transvaser le mélange de l’extrait concentré dans 1 L de milieu minimal M9 avec antibiotique (c.-à-d. 60 kanamycine de μg/mL).
6. Croître le 1 L de milieu minimal M9 contenant la culture bactérienne démarreur à 37 ° C et constante ~ 190 tr/mn, secouant jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (DO600) atteint ~0.6-0,8.
7. Lorsque la gamme de specfified DO600 est atteinte, ajouter 200 μM d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pour induire l’expression de la protéine.
8. Après l’addition de l’IPTG, continuer en incubant les cellules pour l’expression de la protéine à température ambiante en agitant constamment à ~ 190 tr/min pendant environ 16 h (c'est-à-dire la nuit).
9. Le lendemain, récolter les bactéries par centrifugation à ~ 10 000 × g, 4 ° C pendant 30 min.
10. Décanter la LB et transférer le culot cellulaire dans un tube conique de 50 mL. Stocker les granulés à-80 ° C jusqu'à purification.

3. Purification de protéine recombinante d’e. coli.

Remarque : différentes protéines recombinantes nécessitent des procédures de purification distinct. Voici le protocole pour 6 & #215; Purification de EFSAM son étiquette de corps d’inclusion exprimée à partir de la construction de l’animal de compagnie-28 a.

1. Homogénéiser manuellement le culot bactérien congelés en guanidine-HCl 6 M, 20 mM Tris-HCl (pH 8) et β-mercaptoéthanol de 5 mM à l’aide d’une pipette de transfert motorisé 10 mL. Ajouter environ 40 mL de guanidine-HCl par 5 mL de pellet hydro-électriques pour cette étape.
Incubation
2. suivant un 90 min à température ambiante avec une rotation constante dans un four à hybridation, centrifuger le mélange à ~ 15 000 × g, 8 ° C pendant 40 min séparer les débris cellulaires insolubles (c.-à-d. pellet) de la protéine soluble mélange (c.-à-d. surnageant).
3. Ajouter 750 µL de 50 % (v/v) Ni ^{2 +}-agarose acide nitrilotriacétique lisier à la clarification de lysat de billes et incuber pendant 90 min à température ambiante avec inversion dans un four à hybridation.
4. Capture par la suite, la protéine de His-tag 6 × liée à la Ni ^{2 +} en recueillant les perles d’agarose dans une colonne de purification de protéine de flux gravité. Permettre le lysat de circuler à travers la colonne complètement avant de passer à l’étape 3.5.
5. Laver les perles collectées trois fois avec 10 mL d’urée 6 M, 20 mM Tris-HCl pH 8 et 5 mM β-mercaptoéthanol. S’assurer que l’ensemble 10 mL traverse la colonne avant chaque 10 mL suivante Wash.
6. Éluer les protéines dans une série de fractions de 2 mL à l’aide de 6 M urée, 20 mM Tris-HCl pH 8, imidazole de 300 mM et 5 mM β-mercaptoéthanol avec un temps d’incubation s 90 entre les fractions. S’assurer que l’ensemble 2 mL traverse la colonne avant chaque étape ultérieure élution.
7. à ce stade, s’assurer de la protéine d’intérêt dans les fractions éluées par Coomassie teinté bleu sodium dodécyl sulfate sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant la méthode de Laemmli ⁴⁷. Évaluer la taille de la protéine, la quantité et la pureté par comparaison contre des bandes de marqueur de poids moléculaire standard qui sont à la fois inférieur à et supérieur au poids moléculaire attendu de la protéine d’intérêt.
8. Centraliser les fractions éluées protéines dans une membrane de dialyse dont le poids moléculaire Da 3 500 coupure et incuber dans un tampon de repliement 1 L (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 millimètre DTT, 5 mM CaCl ₂, pH 8) à 4 ° C durant la nuit tandis que la mémoire tampon est actuellement agité par un magneti agitateur c.
9. Après environ 16 h de temps de repliement, ajouter 1 ~ U de la thrombine par mg de protéine directement dans le sac de dialyse et incuber à 4 ° C pour une supplémentaire ~ 24 h.
10. Vérifier l’étendue de la 6 × son clivage tag par coloration au bleu de Coomassie de ~ 15 μL protéine prélèvements du sac de dialyse avant et après incubation avec la thrombine qui sont plusieurs à des gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) à l’aide de dénaturation la méthode de Laemmli ⁴⁷. Si un décalage de 2 ~ kDa dans la migration est observé correspondant au poids moléculaire du × 6 clivées sa balise, passez à l’étape 3.11 ; Si une fraction des restes non digérés de protéine qui est détectable par coloration au bleu de Coomassie, versez ~0.2 U de la thrombine par mg de protéine directement dans le sac de dialyse et incuber à 4 ° C pendant une h ~ 24 supplémentaires
11. Chromatographie utilisation exclusion ou échange d’ions pour purifier davantage la protéine. Pour chromatographie échangeuse d’anion de EFSAM, retirer la solution protéique du sac de dialyse et concentré de ~ 10 fois en utilisant un concentrateur centrifuge de l’ultrafiltration avec 10 000, un poids moléculaire de Da coupure. Par la suite, re-diluer la solution ~ 20 fois dans un tampon sans NaCl (20 mM Tris, 5 mM CaCl ₂, 1 mM DTT, pH 8).
12. Équilibrer une colonne échangeuse d’anion préemballés avec 10 volumes de colonne du tampon sans NaCl décrit à l’étape 3.11. Equilibrer utilisant le tampon chargé dans une seringue luer lock ne contenant aucune bulle d’air en appuyant sur la solution à travers la colonne de manière goutte à goutte et en évitant les pressions seringue qui provoquent un flux constant de solution de sortie de la colonne. Utiliser un échangeur d’anions forts (par exemple d’agarose réticulé avec groupes fonctionnels d’ammonium quaternaire).
13. Charger la solution protéique diluée dans le tampon sans NaCl (étape 3.11) sur la colonne comme indiqué au point 3.12.
14. Éluer les protéines dans un dégradé [c'est-à-dire 0 - 60 % (v/v)] de NaCl de plus en plus de la mémoire tampon (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl ₂, 1 mM DTT, pH 8) à l’aide d’un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide de deux pompes. Régler le système FPLC pour collecter des fractions de mL ~1-1.5 et surveiller le profil d’élution de protéine à l’aide d’absorbance de UV 280 nm et un débit de 0,5 mL/min.
15. Identifier les pics d’élution et fractions contenant la protéine d’intérêt ainsi que les gels de pureté de la protéine par teinté bleu de Coomassie SDS-PAGE à l’aide de la méthode de Laemmli ⁴⁷.
16. Fractions de piscine montrant > 95 % (soit pris sous forme de fractions qui ne montrent qu’une seule bande protéique sur la coloration des gels de bleu de Coomassie) dans un sac de dialyse et de la conversion en tampon expérimentale d’intérêt par la dialyse comme indiqué au point 3.8.

4. Fixation chimique du glucose-5-MTS à la protéine par dialyse.

1. Prepare un 55 mM de N-(β-D-glucopyranosyl)-N '-[2-methanethiosulfonyl) éthyl] urée (glucose-5-MTS) dissoudre 10 mg du composé dans 500 μl de 100 % (v/v) de DMSO. Stocker le glucose-5-MTS inutilisés solubilisées dans le DMSO à -20 ° C.
2. Préparer l’échantillon de protéine pour modification par dialyse 1,5 mL de ~ 60 μM protéine dans 1 L de modification tampon composé de 20 mM MOPS, NaCl 150 mM, 5 mM CaCl ₂ et 0,1 mM TCEP, pH 8,3. Utiliser un seuil de poids moléculaire de membrane de dialyse qui est plus petit que la taille de la protéine en cours de modification (par exemple utiliser une fréquence de coupure 3 500 Da pour le ~ 17 500 Da EFSAM).
3. Après 24 h à 4 ° C, transférer l’échantillon dans le sac de dialyse dans un tube de microcentrifuge. Ajouter le DMSO solubilisée glucose-5-MTS à une concentration finale de 2 mM.
4. Incuber l’échantillon dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante. Au cours de la période d’incubation de 1 h, mélanger la solution par le tapement doux du tube chaque 10 min.
5. Re-échanger par la suite, la protéine dans le dernier tampon expérimentaux ne contenant aucun agent réducteur en dialyse à 4 ° C, tel que décrit à l’étape 4.2 ou par ultrafiltration centrifuge. Pour la procédure de l’ultrafiltration, concentrer l’échantillon de protéine ~1.5 mL à < 0,5 mL et diluer par la suite dans le concentrateur même avec le tampon expérimental. Répétez cette étape de dilution concentration deux fois supplémentaires afin que l’échange total est d’au moins 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. Pour EFSAM, utiliser 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl ₂, pH 7.5 comme tampon expérimentale.
6. Préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation par dialyse ou ultrafiltration exchange comme décrit aux points 4.2 et 4.5, respectivement, en 25 mM d’ammonium bicarbonate ou acétate d’ammonium 25 mM. Si à l’aide de dialyse, assurez-vous que vous l’échanger au moins trois fois pour enlever les sels résiduels de ₂ NaCl et ACIC.
7. Déterminer la masse exacte (i.e. ± 1 Da) de la protéine d’intérêt à l’aide d’ionisation par électronébulisation mass spectrometry ^{48 , 49}. Attendre chaque addition covalente de glucose à un thiol Cys, par l’intermédiaire de produit chimique méthanethiosulfonate pour ajouter 281,3 Da à la protéine de masse (c'est-à-dire ajouter 360.4 Da pour le glucose-5-MTS et soustraire 79,1 Da pour le CH ₃ donc ₂ laissant groupe pendant covalente pièce jointe).

5. Évaluation de la solution NMR de modifdes perturbations structurelles et efficacité ication.

1. S’assurer que la concentration de la mis à jour le protéine est > 100 μM après la fixation du glucose et l’échange tampon final. Pour EFSAM, estimer la concentration de protéines à l’aide d’un coefficient d’extinction UV à 280 nm de 1,54 (mg mL ^{– 1}) cm ^{– 1}.
2. Supplément la solution protéique avec 60 μM d’acide 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) pour le calage et l’impulsion d’étalonnage et de 10 % (v/v) D ₂ O le verrou de signal. Pour utilisation de signal-bruit élevé de 600 échantillons μL dans des tubes de même fréquence 5 mm NMR, inséré dans un spectromètre de 600 MHz minimum, équipé d’une sonde à triple résonance HCN cryogénique.
3. Recueillir les spectres de HSQC N standard ¹ H - ¹⁵ comme précédemment détaillées ^{50 , 51} à température, ¹ H et largeurs de balayage ¹⁵ N, transitoire et est incrémenté paramètres appropriés pour l’échantillon particulier. Pour les spectres EFSAM, utilisation de 20 ° C, 256 ¹ H transitoires, 64 incréments de dimension ¹⁵ N et ¹ H et ¹⁵ N sweep largeurs fixés respectivement à 8 000 et 1 800 Hz.
4. Suite à l’acquisition de la gamme de protéines glycosylées, ajouter le dithiothréitol (DTT) à l’échantillon de NMR provenant d’un stock de 1 M à une concentration finale de 15 mM. La TNT supprime la portion de glucose de la protéine par réduction de l’accessoire induite par le disulfure.
5. Acquérir un deuxième ¹ H - ¹⁵ N HSQC dans ces conditions réduit/non modifié, offrant un éventail de référence afin d’évaluer les perturbations structurelles et de l’efficacité de modification provoquées par l’attachement de glucose.
6. Traiter les données de la RMN à l’aide de NMRPipe tel qu’indiqué précédemment ⁵². S’assurer que le traitement minimalement comprend conversion de données, progressive, solvant suppression, transformation de Fourier et initiale visualisation des spectres.
7. Evaluer l’efficacité modification en mesurant les intensités maximales amide et les valeurs des déplacements chimiques dans les spectres réduites et modifiés en utilisant le plugin NEASY sur CARA ⁵³. S’assurer pour évaluer l’intensité du pic de l’amide de Cys tant dans le glucose attaché et réduit les spectres. Si l’amide Cys ne peut pas être fiable situé dans les deux spectres, utiliser les intensités des résidus adjacents à la Cys comme une lecture.
8. Calculer le rendement comme l’intensité de l’amide du spectre Cys modifiés divisée par l’intensité de l’amide de la Cys-réduit (c'est-à-dire traités DTT) spectrum, multiplié par 100 :
   , où j’ai _M est l’intensité de l’amide dans le spectre de Cys modifiés et j’ai _R est l’intensité de l’amide dans le spectre de Cys-réduit. Vous pouvez également évaluer l’efficacité moyenne sur plusieurs sommets amide :
   , où efficacité _i est le rendement déterminé séparément calculé pour chacun résidus, i et n est le nombre total des résidus utilisés dans le calcul de.
9. Calcul des perturbations de déplacement chimique (CSP) de la différence de déplacement chimique entre les deux spectres observés dans les ¹⁵ N et ¹ H dimensions de chaque pic et normalisation pour la plus grande et ¹⁵ N déplacement chimique utilisée par les suivant l’équation :
   , où ΔH est le changement de ppm dans la dimension de proton et ΔN est le changement de ppm dans la dimension de l’azote.

La première étape de cette approche nécessite la mutagénèse des résidus de glycosylation candidat aux résidus Cys qui peuvent être modifiables à l’aide de la EFSAM de glucose-5-MTS. n’a aucun résidu Cys endogènes, donc aucune des considérations particulières ne doivent être apportées avant la mutagenèse. Toutefois, les résidus Cys natives doivent être mutés aux résidus non modifiable avant d’effectuer la chimie décrite. Pour au minimum réaliser la structure native, nous vous suggérons d’effectuer un alignement de séquences global de la protéine d’intérêt et déterminer quels autres résidus sont trouvés plus fréquemment à la Cys endogène s. Mutation Cys à ces autres résidus qui se produisent naturellement chez d’autres organismes peut-être avoir le moins d’impact sur la structure des protéines. Si le résidu Cys endogène est strictement conservé, nous suggérons la mutation à Ser qui est le plus structurellement similaire à Cys. La figure 1 montre un gel typique de mutagenèse PCR évaluer le succès de la réaction PCR, avec l’échantillon d’ADN amplifié démontrant plusieurs intensité plus élevée qu’une somme de contrôle de l’ADN de pET-28 a modèle non amplifiée qui servait pour l’ACP. Les prochaines étapes comprennent la digestion de l’ADN modèle et transformation en e. coli pour réparation de plasmide. Après la propagation de plasmide dans le milieu de culture liquide, l’isolement de plasmide et confirmation de la mutation(s) par séquençage, le vecteur muté peut être utilisé pour l’expression de la protéine. Figure 2 a montre un profil d’élution typique de EFSAM de la colonne échangeuse d’anions par rapport à l’augmentation des concentrations de NaCl. Figure 2 b montre la pureté des EFSAM sur des gels de SDS-PAGE teinté bleu de Coomassie.

Après l’acquisition de protéine pure, une série d’étapes de dialyse est utilisée pour fixer la portion de glucose par l’intermédiaire de la réaction de MTS avec le thiol libre. Figure 3 a montre une image de l’installation par défaut d’un volume de petite protéine scellé dans la dialyse membrane par membrane clips et contenues dans un grand bécher 1 L contenant le tampon d’intérêt. Une première vérification du succès de la modification peut être effectuée par spectrométrie de masse. Figure 3 b montre un spectre de masse electrospray représentatif de EFSAM modifié à un seul thiol Cys. Après la mise en place du protocole pour une protéine spécifique, perturbations structurelles et de l’efficacité de modification peuvent être évaluées à partir d’une seule uniformément ¹⁵N-étiqueté échantillon. ¹H -¹⁵N-HSQC spectre est acquis avant et après l’ajout de l’agent réducteur DTT (Figure 4 a). Les calculs de l’efficacité de la modification est possible via une comparaison de l’intensité de crête amide dans les spectres réduites et modifiés comme indiqué à l’étape de protocole 5.8 (Figure 4 b). Enfin, lorsque les attributions de déplacements chimiques sont connues pour une protéine, l’OPCS qui en corrélation avec les changements structurels peut être calculée comme détaillé dans étape 5,9 (Figure 4).

Figure 1 : Gel d’agarose ADN montrant cocher amplification de template vecteur avec des amorces mutagènes.
L’image montre un gel d’agarose de 1,0 % (p/v) avec marqueur d’ADN (M), lutte antivectorielle (VC) et modèle amplifié par PCR (PCR). L’ADN a été séparé par électrophorèse à 120 V pendant 45 min dans un tampon 0,5 x TAE. Un total de 0,5 ng de VC a été chargé, équivalent au montant de modèle chargé dans la voie de la PCR. Le gel était Taché à l’aide de bromure d’éthidium (~0.5 μg/mL) pendant 20 min avant visualisation sous lumière UV (302 nm). Le gel présente un haut niveau de l’ADN amplifié à proximité de la taille attendue du vecteur (flèche noire). La deuxième bande dans la voie de la PCR en cours d’exécution entre les bandes du marqueur à bp 1 000 et 1 500 probables représente un produit PCR non spécifiquement amplifié. Le niveau d’intensité d’amplification de l’ADN doit être plus élevé que le niveau d’intensité de VC pour être considéré comme un succès. Plusieurs autres colorants d’ADN utilisable comme des alternatives moins mutagènes et plus sécuritaires à la coloration au bromure d’éthidium (voir, par exemple, ⁵⁷). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vérifient la pureté et purification chromatographique typique pour STIM1 EF-SAM.
(A) Anion exchange chromatography profil d’élution du STIM1 EF-SAM. Après la liaison manuelle EF-SAM à la colonne d’échangeurs anionique (Q FF) à pH basique et la faible concentration de NaCl avec une seringue et AKTA FPLC (GE Healthcare) sont utilisé pour Éluer la protéine avec un gradient de NaCl. L’élution est surveillée par le AKTA utilisant le signal de UV 280 nm sur un 0-60 % (v/v) gradient de 1 M NaCl. (B) Coomassie teinté bleu-gel de SDS PAGE des fractions d’élution de (A). Le gel dénaturation de la protéine révèle que EF-SAM élué dans deux pics majeurs à ~ 250 mM et 450 ~ mM NaCl. Le protocole de purification donne > 95 % pur EF-SAM comme en témoigne l’absence de tout contaminant bande apparaissant dans le gel teinté bleu de Coomassie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Installation de dialyse et confirmation de la glycosylation des protéines in vitro .
(A) installation de dialyse typique utilisée dans vitro fixées du glucose sur le thiol Cys via la réactivité MTS. L’image montre ~1.5 mL de protéine contenue dans le tube à dialyse tamponnée contre ~ 1 L de tampon expérimentale. Il est important que la mémoire tampon est constamment agité pour assurer un échange complet. L’image montre un tube de microcentrifuge découpé sur le tube à dialyse excès pour éviter le naufrage de la valise de dialyse et endommager par la barre rotative de remuer. (B) Electrospray Ionisation spectre de masse de la protéine modifiée de Asn171Cys EF-SAM. Spectrométrie de masse est une approche pratique et précise pour déterminer si la procédure de modification a été un succès. Un chromatogramme typique de masse apparaît avec les masses mesurées et théoriques du non modifié et mis à jour le Asn171Cys EF-SAM a indiqué. La majorité de l’échantillon masse correspond à une macromolécule qui se trouve dans ~1.3 Da de la masse théorique attendue du glucose conjugué Asn171Cys EF-SAM. Les données (B) est reloti et modifié par rapport à ⁴². S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Évaluation de Solution NMR de perturbations structurelles et de l’efficacité de modification d’un seul échantillon de NMR.
(A) ¹ H -¹⁵N-HSQC spectrale superposition de glucose conjugué Asn131Cys EFSAM avant (signaux rouges) et après (signaux noir) l’ajout de 15 mM TNT. La superposition montre clairement plusieurs changements de déplacements chimiques des résidus spécifiques amide indicatif de deux modification des perturbations structurelles et de protéines. La zone rouge indique l’emplacement de l’amide Asn131Cys. (B) Zoomed sur la région de¹⁵N-HSQC ¹H - contenant l’amide Asn131Cys. L’intensité du pic Asn131Cys amide dans le spectre mis à jour le (je_M) est divisée par l’intensité du spectre (non modifiées) réduite (_r) pour le calcul du rendement (illustré). Un calcul de l’efficacité moyenne de plusieurs résidus significationou fournit une meilleure estimation de l’efficacité, y compris une estimation de l’erreur. L’efficacité moyenne apparaît pour Asn131Cys EFSAM, basé sur 5 résidus (c.-à-d. 129 à 133). (C) après normalisation des perturbations déplacement chimique provoquées par la conjugaison de glucose à la protéine de Asn131Cys EFSAM. La série d’expériences HSQC recueillies sur un seul échantillon avant et après que complétant avec agent réducteur non seulement fournit une estimation pratique de l’efficacité de la modification par analyse d’intensité crête [indiqué au point B], mais également fournit des données pour évaluation des changements structuraux associés à la modification. Conjugaison de glucose provoque des perturbations plus importantes localisées près de la position 131 ; Cependant, cette analyse révèle des perturbations qui sont inattendues uniquement basé sur la proximité de séquence, indiquant la valeur dans cette analyse. Les données en (C) sont reloties et modifiées par rapport à ⁴². S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le tableau 1. Construisent des séquences d’oligonucléotides (amorce) exemple d’Asn à Cys mutagenèse au sein de l’animal de compagnie-28 a STIM1 EFSAM.

Glycosylation des protéines est une modification post-traductionnelle où les sucres sont covalente aux polypeptides principalement par le biais de liens avec des chaînes latérales d’acides aminés. Jusqu'à 50 % de protéines de mammifères sont glycosylés ⁵⁴, où les protéines glycosylées peuvent avoir par la suite une gamme variée d’effets de dérégler l’affinité de liaison biomoléculaire, influençant la protéine pliage, altérant l’activité du canal, ciblage molécules de dégradation et cellulaires traite, pour n’en nommer quelques uns (revus en³³). Le rôle important de la glycosylation dans physiologie mammifères est évident par plusieurs centaines de protéines évolués pour construire toute la gamme des mammifères glycane structures ³³. Altéré N- et O- glycosylation patrons ont été associées maladie de nombreux États y compris la prostate (augmentation et diminution), de la poitrine (augmentation et diminution), foie (augmenté), ovarienne (augmentée), pancréatique (augmenté) et les cancers gastriques (augmentée) ⁵⁵. En outre, glycosylation de Tau, la huntingtine, synucléine α a été trouvé pour réglementer la toxicité de ces protéines associé avec l’Alzheimer, de Huntington et la maladie de Parkinson maladies ⁵⁶, et un groupe d’affections congénitales de la glycosylation ont été identifié résultant de défauts héréditaires en enzymes qui médient glycosylation ⁵⁴. Ainsi, la compréhension des effets précis de biophysiques, biochimiques et structurales de glycosylation a le potentiel d’influencer considérablement notre compréhension de la régulation de la protéine et fonction dans la santé et la maladie.

Les blocs de construction de dix sucre qui conduisent à la diversité des structures glycane trouvé dans la glycome chez les mammifères incluent fucose, galactose, glucose, N- acétylgalactosamine, N- acétylglucosamine, acide glucuronique, acide iduronique, mannose, l’acide sialique et xylose ³³. Alors que la N- glycosylation relie invariablement un N- acétylglucosamine sucre directement à la protéine, O- glycosylation peut résulter d’un des N- acetylgalacotose, N- acétylglucosamine, xylose, fucose, glucose ou du galactose lié par covalence au polypeptide. Pour commencer à comprendre comment ces sucres immédiatement adjacentes à la surface des protéines affectent les propriétés biophysiques et structurelles, nous décrivons ci-après une approche pour fixer sélectivement site sucres aux résidus Cys via les thiols integrees dans la protéine séquence. Ici, les résidus qui sont endogène glycosylées sont remplacés par Cys et modifié in vitro par une simple approche chimique. De cette manière, les sites de glycosylation uniques et multiples peuvent être évalués afin de cerner la contribution de chaque site spécifique ainsi que les modifications cumulées pour le pliage et stabilité ainsi que l’ensemble structure et fonction de la protéine.

Récemment, cette approche a été utilisée avec succès avec EFSAM pour individuellement ou cumulativement, évaluer le rôle de la Asn131 et Asn171 N- glycosylation sites ⁴². Mutation à Cys et covalente du glucose sur les sites Asn131 ou Asn171 a révélé une diminution Ca^{2 +} affinité et réprimées stabilité. Quand les deux sites ont été modifiés en même temps avec la fixation du glucose, la diminution de l’affinité et stabilité sont potentialisées menant à amélioré oligomérisation propension in vitro. Structurellement, l’approche décrite aux présentes a montré que les modifications de Asn131 ou Asn171 perturbent mutuellement l’hélice de α8 noyau situé sur le domaine SAM, juste à côté de la paire de main EF. Cette analyse structurale expose comment des modifications de glucose sur la surface de la protéine entraînent un changement structurel convergent et potentialisé dans l’EF-interface main : SAM qui finalement déstabilise la protéine et améliore la SOCE ⁴².

Tandis que l’application de cette approche sélective des site a contribué à faire la lumière sur comment un monosaccharide près de la surface de EFSAM effets de pliage, stabilité et structure, cette procédure peut facilement être adapté pour fixer des hydrates de carbone plus spécifiques à ER, Golgi et PM localisation (i.e. glycosylation États de maturité différents), il a fourni est une source fiable pour ces hydrates de carbone contenant des groupes fonctionnels qui peuvent relier à thiols tels que MTS. MTS est préférable, étant donné que la modification de thiol est réversible en utilisant un agent réducteur et un spectre de référence peuvent être facilement acquises. Cette approche peut également être adaptée pour poster un lien autres moitiés post-traductionnelle de la protéine comme les lipides. Dans le même temps, il y a plusieurs limites de cette approche qui devrait être considéré. Tout d’abord, la méthode s’appuie sur la mutation des sites de glycosylation de Cys qui peut affecter la structure, la stabilité et le pliage même en l’absence de toute modification de glucose. De même, les résidus Cys natives dans la protéine doivent également être mutés pour éviter la saisie de glucose dans les sites non-glycosylée. En outre, l’ajout de résidus Cys souvent favorise la formation de corps d’inclusion dans les bactéries en raison de la réticulation Cys et mauvais repliement, rendant la purification plus difficile. Néanmoins, cette approche sélective-site de Cys-réticulation décrite ci-après fournit un moyen contrôlé pour taquiner les effets structurels, biochimiques et biophysiques des sites de glycosylation spécifiques dans des expériences qui exigent des niveaux élevés de protéine homogène. Les effets des résidus de Cys non indigènes sur la structure, stabilité et pliage peuvent être simplement établies en l’absence de toute modification par rapport au type sauvage protéine attribue ⁴². Conjugués à des données fonctionnelles obtenues dans les cellules eucaryotes qui expriment la modification-blocage des versions mutantes de la protéine (p. ex. Asn-à-Ala), l’approche décrite actuellement donnera des nouvelles connaissances sur les mécanismes structurels de protéine règlement des modifications post-traductionnelles.

Cette recherche a été financée par les Sciences naturelles et l’ingénierie Conseil de recherches du Canada (05239 à PBS), la Fondation canadienne pour l’Innovation de l’Ontario Research Fund (à PBS), la Prostate Cancer Foundation Fight - Telus Ride for Dad (à PBS) et de l’Ontario Bourses d’études supérieures (à Y.J.C. et n.-é).