라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

이 프로토콜은 라만 이미징 및 다 변수 분석을 사용하여 식물 세포 벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시합니다.

식물체 바이오 매스에 라만 이미징을 적용하는 것은 수용액에 대한 공간적 및 조성 정보를 제공 할 수 있기 때문에 증가하고 있습니다. 분석은 일반적으로 광범위한 샘플 준비가 필요하지 않습니다. 라벨을 붙이지 않고도 구조적 및 화학적 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 각 라만 이미지에는 수천 개의 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 이것은 숨겨진 정보를 추출 할 때 어려움을 낳습니다. 특히 비슷한 화학 구조를 가진 구성 요소의 경우. 이 연구는이 문제를 해결하기 위해 다변량 분석을 도입합니다. 이 프로토콜은 식물 세포벽 내에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 비롯한 주성분을 시각화하는 일반적인 방법을 수립합니다. 이 프로토콜에서는 시료 준비, 스펙트럼 획득 및 데이터 처리 절차가 설명됩니다. 이는 시료 준비 및 데이터 분석시 운영자의 기술에 크게 의존합니다. 이 접근법을 사용함으로써 비전문 사용자가 라만 조사를 수행하여 high 품질 데이터 및 식물 세포벽 분석에 대한 의미있는 결과.

Plant biomass is the most abundant renewable resource on Earth; is mainly composed of lignin, cellulose, and hemicellulose; and is considered an attractive source of bioenergy and bio-based chemicals¹. Unfortunately, it can resist degradation and confer hydrolytic stability or structural robustness to the plant cell wall. Such resistance is attributable to the accessible surface area, biomass particle size, degree of polymerization, cellulose crystallinity, and protective lignin². A comprehensive understanding of the structural and chemical nature of the plant cell wall is thus significant from the viewpoint of plant biology and chemistry, as well as from that of commercial utilization. Commonly used wet chemistry analyses, such as chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy, only provide average compositional data of the measured sample. Furthermore, these methods are invasive and destroy the original structure of the plant tissue³.

The Raman imaging technique is a powerful tool for the nondestructive visualization of spatially resolved chemical information⁴. It uses a laser light to cause inelastic scattering with a photon and relies on changes in polarizability arising from the molecular vibrations. In this case, water causes weak Raman scattering, which makes this approach suitable for in situ investigations of biological samples⁵. The application of the Raman imaging technique to the plant cell wall can elucidate the structure and composition of plant cell walls in their native state, with the resolution on the scale of the single cell and even of the cell wall layers⁶. A typical Raman imaging analysis of a plant cell wall generally consists of three steps: 1) sample preparation, 2) spectral acquisition, and 3) data processing.

Although one of the major advantages of Raman imaging is the ability to achieve label-free and non-destructive spectra with minimal sample preparation, physical sample sectioning is still necessary to expose the surface of interest. This process should be performed carefully to obtain a flat surface, since the technique depends on maintaining optical focus⁷. Spectral acquisition requires a balance between image quality and extensive acquisition times⁸. Data processing aims to effectively extract the chemical information from the image data, especially for the components with similar chemical structures, such as cellulose and hemicellulose. Due to the strong spectral overlap, the exact spectra are difficult to discern. In this case, multivariate analysis is a straightforward approach to effectively uncover the hiding structural and chemical information⁹. This work presents a general protocol describing the use of Raman imaging to visualize the main components in plant cell walls, including lignin, cellulose, and hemicellulose.

1. 샘플 준비

1. 식물 샘플 ( 예 : 포플러 줄기)에서 작은 조직 블록 (약 3mm x 3mm x 5mm)을 자릅니다.
2. 조직을 끓는 탈 이온수에 30 분간 담근다. 즉시 실온 (RT)에서 30 분 동안 탈 이온수로 옮긴다. 티슈가 용기 바닥에 가라 앉을 때까지이 단계를 반복하여 조직의 공기가 제거되었고 조직이 부드럽게되었다는 것을 나타냅니다.
   참고 :이 단계 이전에 바닥에 가라 앉은 샘플의 경우 일반적으로이주기를 3-5 번 반복하십시오.
3. 순수한 PEG뿐만 아니라 탈 이온수에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 20, 50, 70, 90 % (v / v) 분취 량을 준비하고 65 ° C에서 용액을 유지하십시오.
4. 수분을 치환하고 PEG가 침투하도록 일련의 등급이 매겨진 PEG 조에 조직을 배양합니다.
   참고 : 일반적으로 분자량 2,000 (PEG2000) 인 PEG가 삽입에 사용됩니다.
   1. 조직을 g로 처리하십시오.(a) 1 시간 동안 20 % PEG, (b) 1.5 시간 동안 50 % PEG, (c) 2 시간 동안 70 % PEG, (d) 2 시간 동안 90 % PEG, 및 (e) 10 시간 동안 100 % PEG.
5. 카세트를 오븐에서 65 ° C로 예열하십시오. 블록이 들어있는 PEG를 카세트에 넣은 다음 예열 된 핀셋 또는 바늘을 사용하여 조직 블록을 원하는 위치에 놓습니다.
6. 천천히 카세트를 식히고 사용할 때까지 실온에 티슈를 보관하십시오.
7. 날카로운 면도날을 사용하여 작은 블록 (약 1cm x 1cm x 2cm)에 표적 조직이 들어있는 PEG 블록을 해부하고 그것을 마이크로톰에 올려 놓습니다.
8. PEG 블록 (일반적으로 3-10 μm)에서 얇은 절편을 잘라냅니다.
9. 시계에서 10 번 탈 이온수로 섹션을 씻어 조직에서 PEG를 제거합니다.
10. 추출물을 제거하기 위해 6 시간 동안 톨루엔 / 에탄올 (2 : 1, v / v)로 섹션을 담그십시오. 탈 이온수 65 mL, 아세트산 0.5 mL 및 나트륨 클로라이드 0.6 g을 혼합하여 반응 액을 조제한다.비커에 의식. 5 mL 바이알에 한 개의 섹션과 3 mL의 반응 액을 첨가한다. 유리 병의 상단에 나사를 조이십시오.
11. 유리 병을 75oC에서 2 시간 가열하여 조직의 리그닌을 제거한다. 시계 유리에있는 탈 이온수로 섹션을 10 번 헹굽니다.
12. 미처리 / 탈 리그닌 부분을 유리 현미경 슬라이드로 옮긴다. 브러시 또는 바늘을 사용하여 조심스럽게 섹션을 펼칩니다. 티슈 페이퍼로 여분의 탈 이온수를 제거하십시오.
13. 섹션을 D ₂ O에 담그십시오. 샘플을 유리 커버 슬립으로 덮으십시오. D ₂ O의 증발을 막기 위해 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오.

2. 스펙트럼 획득

1. 공 촛점 라만 현미경의 장비 운영 소프트웨어를 엽니 다. 레이저 (파장 = 532 nm)를 켜고 100 배 현미경 대물 렌즈를 사용하여 결정 실리콘 표면에 초점을 맞추고 보정 버튼을 클릭하여 장비를 보정합니다.
2. 계기 스위치광학 현미경 모드로 설정하고 현미경 램프를 켭니다. 커버 슬립이 목표를 향하도록 스테이지에 현미경 슬라이드를 장착하십시오.
3. 20X 현미경 대물 렌즈로 샘플을보고 관심 영역을 찾습니다. 커버 슬립에 침지 오일을 바르고 액침 현미경 대물 렌즈 (60X, 개구 수 NA = 1.35)로 전환합니다. 샘플 표면에 초점을 맞 춥니 다.
4. 장비를 라만 테스트 모드로 전환하고 현미경 램프를 끕니다.
5. 직사각형 도구를 사용하여 매핑 영역을 선택하십시오. 단계 크기를 변경하여 얻은 스펙트럼의 수를 결정합니다.
   주 : 스텝 크기 (일반적으로 대물 렌즈의 개구 수에 의해 계산 된 스폿 직경보다 큰, 이론적으로는 1.22λ / NA)보다 유의하십시오. 이 크기보다 작은 경우 오버 샘플링이 발생합니다.
6. 최적의 스펙트럼 파라미터를 설정하여 적절한 획득 시간 (일반적으로 8 시간 미만)에서 최적의 신호 대 잡음비 (SNR) 및 스펙트럼 품질을 얻고,샘플 적합성에 관한 정보. 일반적으로 레이저 (532 nm), 필터 (100 %), 구멍 (300), 슬릿 (100), 분광계 (1,840 cm ^-1 ), 홈 (1200 t), 대물 렌즈 60X 오일) 및 수집 시간 (2 초).
7. 데이터 처리 전에 스펙트럼 데이터를 저장하고 범용 형식 ( 예 : TXT 파일)으로 변환하십시오.

3. 데이터 분석

1. 스펙트럼 데이터 (TXT 파일)를 데이터 분석 소프트웨어 ( 예 : Matlab)에로드하십시오. 데이터 세트에 노이즈 감소 기술을 적용하여 SNR을 향상시킵니다 ( 예 : Savitzsky-Golay 알고리즘 또는 웨이블릿 알고리즘)
2. 미처리 샘플을 사용하여 리그닌과 다당류의 이미지를 생성하십시오. 리그닌 영상의 경우, 방향족 링 대칭 스트레칭 진동 때문에 1,600 cm ^-1 부근의 스펙트럼 피크를 고려하십시오. 다당류 이미징 (셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스 포함)의 경우 스펙트럼 피크 aCH와 CH ₂ 뻗기 때문에 2,889 cm ^-1 라운드.
3. delignified 샘플을 사용하여 셀룰로오스와 헤미 셀룰로스의 이미지를 생성합니다. 획득 된 스펙트럼에서 자기 모델링 곡선 분해능 (SMCR)을 수행하여 셀룰로오스와 헤미 셀룰로스의 스펙트럼을 구별하고 그 분포를 영상화하십시오.
4. 획득 한 데이터에 대해 주성분 분석 (PCA) 및 클러스터링 분석을 수행하여 다른 셀 벽 레이어의 라만 스펙트럼을 구별합니다.

그림 1 은 식물 세포벽의 라만 이미징을위한 전형적인 마이크로 라만 시스템의 개요를 나타냅니다. 예를 들어, 포플라 ( Populus nigra L.)의 원래 라만 스펙트럼은 상당한 기준선 드리프트와 스파이크를 가지고 있습니다 ( 그림 2a ). 라만 이미징 데이터 세트 (APRI)에 대한 자동 사전 처리 방법을 수행 한 후,이 두 스펙트럼 오염 물질이 성공적으로 제거됩니다 ( 그림 2b ). 포플러의 전형적인 라만 스펙트럼은 그림 3 에 표시되어 있으며 밴드 할당은 표 1 에 나와 있습니다. 리그닌의 라만 이미지는 방향족 고리 구조 ( 그림 4a )에 기인하는 1,550-1,650cm ^-1 의 스펙트럼 영역의 통합에 의해 생성됩니다. 그림 4d 는 다당류의 라만 이미지, which는 2,889 cm ^-1 의 피크를 통합함으로써 달성된다. 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 이미지화하기 위해, 탈 리그닌 된 샘플의 라만 이미징 데이터에 대해 SMCR이 수행된다. 해당 스펙트럼과 이미지는 그림 5 에 나와 있습니다. 그림 6 은 PCA 및 클러스터링 분석을 통해 얻은 결과를 보여줍니다.

그림 1 : 식물 세포 벽에 대한 라만 이미징의 도식. 단면 샘플 (예로서 포플라)은 광학 현미경을 전하 결합 소자 (CCD) 검출기로 라만 고분해 분광계에 연결하는 마이크로 라만 시스템에 의해 측정된다. 명 시야 이미지에서 식물 세포벽은 셀 코너 (CC), 복합 중간 라멜라 (CML) 및 보조 벽 (SW)으로 구성됩니다. 통상적으로, 단일 피크에 의해 라만 이미지가 생성된다통합 또는 강도. 원본 데이터에는 두 개의 스펙트럼 오염 물질 ( 즉, 기저선의 드리프트 및 우주 스파이크)이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : APRI에 의한 전처리 전 ( a ) 및 후 ( b ) 전처리 라만 스펙트럼. 2 개의 스펙트럼 오염 물질이 성공적으로 제거됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 포플라 셀 벽의 일반적인 라만 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 포플라 셀 벽 내의 리그닌 ( a )과 다당류 ( b )의 라만 이미지. 리그닌 이미지는 1,600 cm ^-1 부근의 피크를 통합하여 생성됩니다. 다당류 이미지는 약 2,889cm ^-1 의 피크를 통합하여 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 포플라 셀 벽 내의 셀룰로오스 ( a )와 헤미셀룰로오스 ( b )의 라만 이미지. SMCR은 탈 리그닌 된 샘플의 라만 이미징 데이터상에서 수행된다. 탈 리그닌 화는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스의 분광 특성의 노출에 기여한다. 셀룰로오스는 주로 SW에 집중되어 있으며, 헤미셀룰로오스의 분포는 포플라 세포벽 전체에 걸쳐 거의 균일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 : 포플러 셀 벽에서 다른 셀 벽 레이어를 자동으로 식별하기위한 PCA 및 클러스터링 분석 결과 P를 사용함으로써CA 및 클러스터링 분석을 통해 스펙트럼은 셀 내강, CC, CML 및 SW에 해당하는 네 부분으로 나뉩니다. 이들 층의 평균 스펙트럼을 이하에 나타낸다. 그 결과, 리그닌은 CML과 CC에 집중되는 반면, 다당류는 SW에 주로 집중되어 있음이 밝혀졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 : 라만 피크 위치 및 대역 할당

식물 세포 벽은 세포 모서리 (CC), 2 차벽 (S1, S2 및 S3 층을 갖는 SW) 및 복합 중간 엽 줄기 (CML, 중층 및 인접한 주 엽산)를 포함하는 여러 층으로 조직화 된 복합체이다. 벽), 이는 샘플 준비 동안 평평한 표면을 얻는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 나무보다 복잡한 구조를 가진 식물 샘플, 특히 잔디는 미세 절단을 위해 응고 될 필요가 있습니다. PEG는 물에 녹기 때문에 절단 및 라만 조사를위한 이상적인 하드 매트릭스입니다. 탈 이온수로 헹구면 쉽게 제거 할 수 있습니다. 임베딩에 사용 된 PEG는 1,000-20,000의 다양한 분자량을 가지고 있습니다. PEG의 분자량이 높을수록 침투력은 낮아진다. D ₂ O는 리그닌의 형광을 감소시키는 데 도움이되며 2,490 cm ^-1 에서 현저한 피크를 갖지만 형광 간섭을 제거하지는 못합니다. 두1) 표본 및 배경 형광뿐만 아니라 CCD의 열적 변동은 기준선 드리프트를 초래할 수 있고 2) 우주선은 민감한 감지기에 현저하게 영향을 미칠 수 있습니다. 스펙트럼은 좁은 대역폭 스파이크로 나타납니다. APRI 방법은 이러한 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. APRI에는 스펙트럼 특성 자체를 사용하여베이스 라인 드리프트 및 우주 스파이크를 제거하기 위해 반복적으로 재 보정 된 페널레이션 된 최소 제곱 (airPLS) 및 주성분 분석 (PCA)이 포함됩니다.

분포 이미지를 얻으려면 다 변수 방법으로 피크 강도 / 적분 및 전체 스펙트럼 선형 피팅을 선택해야합니다. 전자는 특정 라만 피크 ( 예 : 리그닌)가있는 구성 요소에 적합하지만 후자는 강한 스펙트럼 중첩이있는 구성 요소 ( 예 : 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스)에 적합합니다. 배포판리그닌 및 폴리 사카 라이드의 부 이온 이미지는 각각 1,600cm ^-1 및 2,889cm ^-1 의 특정 피크를 통합하여 사용할 수 있습니다 (그림 4). 그러나 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스의 이미지는 강한 스펙트럼 오버랩으로 인해 피크 통합으로 직접 생성하기가 어렵습니다. 다변량 분석은 회귀 된 정보 내용이 원래의 데이터가 제한된 수의 중요한 요인들로부터 재구성된다는 가설에 따라 분류 될 수 있습니다 ¹² . 따라서 스펙트럼을 구별하고 해당 라만 이미지를 생성하는 데 적용 할 수 있습니다. 식물 샘플의 경우 추출물과 리그닌의 존재는 셀룰로오스와 헤미 셀룰로오스의 스펙트럼을 재구성하는 능력을 저해합니다. 이미징 데이터의 SMCR 분석에 앞서 이러한 간섭을 제거 할 필요가 있습니다. SMCR은 Lawton과 Sylvester에 의해 순수한 구성 요소 f를 해결하기 위해 특별히 개발 된 다 변수 기술로 처음 소개되었습니다스펙트럼 라이브러리에 의존하지 않고 스펙트럼 세트를 사용하여 이미징 데이터를 분석합니다. 분광 분류는 식물 세포벽의 구조적 및 화학적 특성을 더 깊이 이해하기 위해 중요합니다. 여기에서 이미징 데이터는 주성분 분석 (PCA) 및 클러스터링 분석을 거쳐 다른 셀 벽 레이어 ¹⁴ 에서 라만 스펙트럼을 구별합니다.

그러나이 기술에는 두 가지 한계가 있습니다. 첫째, 라만 효과는 약하며, 일반적인 총 라만 산란 단면적은 분자 당 ~ 10 ^-29 cm ² 이므로 강한 형광에 취약합니다 ¹⁵ . 가능한 한 얇게 섹션을 준비하고 기준선 보정 알고리즘을 적용하여 결함을 개선 할 수 있지만 형광 신호를 제거하기는 어렵습니다. 둘째, 화학적 처리는 세포의 라만 이미지를 얻을 때 중요한 과정이다ulose 헤미셀룰로오스를 함유하고 있기 때문에 원래의 화학 물질을 바꿀 위험이 있습니다. 그러므로 셀 벽 구조가 처리되지 않은 것과 너무 다르게 보이지 않도록 가능한 추출액과 리그닌을 제거하는 것이 가장 좋습니다.

결론적으로이 프로토콜은 식물 세포벽 내에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스의 분포를 연구하는 데 적합합니다. 원하는 정보를 얻기 위해 라만 이미징을 사용하는 것은 시료 준비 및 데이터 분석시 운영자의 기술에 크게 의존합니다. 고품질의 라만 스펙트럼을 수집하려면 좋은 샘플 준비가 필수적입니다. 적절한 데이터 분석은 대규모 스펙트럼에 대한 통찰력을 제공하고 이미지에서 숨겨진 정보를 추출합니다. 근본적인 방법으로,이 프로토콜은 미시적 수준에서 화학적, 물리적 또는 생물학적 처리 중 주요 구성 요소의 동적 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

우리는 재정 지원을 위해 중국 과학 기술부 (2016YDF0600803)에 감사드립니다.