간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

인간의 뇌 퇴행성 질환 모델 성인 뇌에서 신경 회로들을 매핑하고, 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초 공부 초파리 사용에 관심이 증대되고있다. 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 전체 마운트 준비는 전체 뇌 기반 연구를위한 중요하지만, 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이후의 처리 단계를 용이하게하기 위해 본체의 나머지에 부착 된 그대로의 뇌를 유지하면서,이 프로토콜은, 이하 10 초에서 성인 플라이 머리 쉬운-내용 원스텝 절개 방법을 설명한다. 이 절차는 일반적으로 나중에 묘화 공정을 방해 할 수있는 뇌와 관련된 눈 기관 조직의 대부분을 제거하는 것을 돕고, 또한 해부 포셉의 품질에 덜 요구 놓는다. 또한, 우리는 (B)의 양쪽을 이미징 중요 커버 슬립에 장착 뇌 샘플의 편리 반전을 가능하게하는 간단한 방법을 설명비슷한 신호 강도 및 품질 비. 프로토콜의 예로서, 우리는 WT 성인 뇌에서 도파민 (DA) 신경 세포의 분석을 제시한다 ^{(1,118와트)} 날아간다. 절개 방법의 높은 효능은 초파리에서 대규모 성인 뇌 기반 연구에 특히 유용합니다.

일반적으로 과일 파리로 알려진 모델 생물 초파리는 긴 우아한 유전 도구, 짧은 생식 번 평가하고, 높은 분자 및 세포 경로를 보존하고있다. 초파리 성공적 기본 신호 경로 다세포 유기체의 패터닝 메커니즘뿐만 아니라, 신경 발달 기능의 기초가되는 메커니즘 질병 ^{1,2- 해부하는데} 이용되어왔다. 셀 라벨 및 이미징 기술의 최근 발전과 함께, 초파리의 ^뇌는 신경 회로의 미세 매핑 및 학습과 기억, 그리고 활동 일주기 ^1,3와 같은 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초를 해부 특히 강력한되고있다 ^4,5,6,7,8.

초파리 시스템의 하나의 특별한 장점은 일정한 화합물 또는 공 초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 전체 뇌 실장 준비 및 시험 수는 상대적으로 작은 크기이다. 티S 기능 따라서 전체 내에서 연구 된 환자의 전체적인 관점 그 정확한 형상을 모두 제공하는 전체 뇌 조직의 맥락에서, 세포 및 세포 내 수준의 신경 회로의 상세한 해부학 및 기능 분석 또는 단일 뉴런을 활성화 뇌. 그러나, 뇌의 미니어처 크기보다는 주어진 또한 효율적 성인 플라이에 보호 외골격 헤드 케이스로부터 온전한 ​​뇌 조직 해부의 기술적 과제를 제시한다. 다양한 효과적이고 상대적으로 단순한 박리 방법은 일반적주의 포함하고 단계적 헤드 케이스를 제거하고 눈을 포함한 관련 조직, 기관, 지방을 ^9,10. 이러한 미세 수술 절개 방법 적절한 뇌로부터의 상세히 설명되었지만 자주 쉽게 손상 될 수있는 미세 잘 정렬 된 팁 집게에 의존 해부 포셉의 품질에 다소 엄격한 요구를 배치합니다. 또한, 같은 해부 뇌는 종종 해부하다신체의 나머지 에드 뇌 쉽게 그들의 작은 크기 및 프로세싱 버퍼 투명성의 연속 염색 및 세척 과정 중에 손실 될 수있다. 여기, 우리는 몸통에 부착 된 해부 두뇌를 유지 성인의 뇌에 대한 비교적 간단하고 배우기 쉬운 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다. 해부 과정은 종종 쉽게 눈과기도로 뇌 관련 조직의 대부분을 멀리 지우고 좋은 품질의 해부 포셉에 대한 수요를 감소시킨다.

형광 화합물 현미경 또는 공 초점 현미경으로 뇌를 영상화 할 때 또한, 멀리 형광 광원으로부터 뇌의 측면은 종종 인해 전체 마운트 뇌의 두께로 약한 신호와 적은 선명한 이미지를 생성합니다. 여기서는 유사한 신호 intensi와 뇌의 양측의 편리한 촬상있게 뇌 샘플 쉽게 반전을 허용하는 간단한 장착 방법을 서술타이 및 품질.

개념 증명 성인의 뇌를 연구하는이 방법의 응용 프로그램에 대한, 우리는 또한 ¹¹¹⁸ 파리 w의 뇌에서 DA 뉴런의 존재를 조사; 종종 유전자 파리 많은 초파리 연구 야생형 제어를 생성하기위한 부모 선으로 사용되는 유전자형.

뇌 해부 및 면역 형광 염색에 사용 1. 솔루션

1. 성인 인공 뇌척수액에서 머리를 비행 해부 (ACSF) : 119 mM의 NaCl을, 26.2 _{밀리미터의 NaHCO3,} 2.5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 NaH ₂ PO _4, 1.3 밀리미터의 MgCl _2, 10 mM의 포도당. 사용하기 전에, 가스 5 % CO _{구십오분의이} 10 %의 O _2와 ACSF - 2.5 mM의 _CaCl2를 15 분, 스파이크. 0.22 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 용액 ACSF 멸균.
   참고 : 저장 ACSF를 4 ° C에서 세균 오염을 방지 할 수 있습니다. 해부 뇌의 최종 이미지 품질에 두 박리 용액의 효과의 상세한 비교가 수행되지 않은 비록 플라이 뇌 또한, 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 절개 될 수있다.
2. 일반적으로 분주 및 -20 ° C에 저장되어있는 정착액 솔루션으로 1X PBS에서 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용합니다.
   CautioN : PFA는 독성과 부식성 및 취급시주의해야한다.
3. 해부 뇌의 면역 염색하는 동안 뇌에서 마지막 세척 단계 후 PFA를 씻어 1X PBS를 사용합니다. 10 배 PBS 원액에서 1X PBS를 준비 (1.37 M의 NaCl, 27 mM의 KCl을, 100 밀리미터 나 ₂ HPO _4, 18 mM의 KH ₂ PO _4).
4. 해부 뇌의 면역 염색 동안 모든 후속 세척 단계 1X PBS (1X PBT)에서 0.3 % 트윈 20을 사용합니다.

성인 플라이 헤드 2. 미세 수술 해부

주 : 박리 과정이도 1에 도시되어있다.

1. CO _2와 함께 성인 파리를 마취. 5 초 - 집게를 사용하여 비행을 선택하고 짧게하면 3 70 % 에탄올에 침지하여 표피를 왁스 제거. 이 ACSF 또는 1X PBS의 해부 용액에 침지 할 때 기포가 비행 표피에 부착 없음을 보장합니다.
2. 아래손에 의해 차단되지 않습니다 각도에서 광원 현미경을 해부, 파리 (1.2X 배율)의 명확한 뷰를 달성하기 위해 대물 렌즈를 설정합니다. 동물을 고정하고도 1a에 도시 된 바와 같이, 그것의 복부가 위쪽으로 향하도록 추위 해부 솔루션으로 파리를 체험하기 위해 쓰지 않는 손으로 집게를 사용합니다.
3. 160에서 집게를 유지 - 파리의 복부에 작은 힘을 발휘하면서, 해부 접시에 대해 170 ° 각도 (그림 1A에서 화살표로 도시). 이 단계는 플라이 및 고정 (15)에 의해 후방으로 헤드를 이동하도록 강제 - 25 ° 위쪽 코를 확장하는 동안. 이 과정에서, 표피의 소프트 및 반투명 영역은 코 아래에 명백해질 것이다. 배율을 증가시키고이 지역에 초점면을 조정합니다.
   참고 : 너무 단단히 집게를 잡지 마십시오,하지만 충분히 아니라 그냥 회사 안정비행. 너무 많은 힘은 내부 장기 용액에 파열의 원인이됩니다.
4. 유지 손에서 압력이 해제 될 때 집게가 열려 봄 않도록, 포셉의 조언에 가벼운 저항하는 힘을 생성합니다 그것의 끝이 폐쇄되도록 해부 집게를 눌러 지배적 인 손을 사용합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 비행을 들고 집게에 수직으로 집게를 놓습니다.
   1. 피어스 그림 1B에서 빨간색 화살표로 도시 된 바와 같이 코 아래에있는 표피의 부드럽고 반투명 영역을 통해 해부 포셉의 폐쇄 팁. 너무 깊이는 뇌에 접촉하는 집게를 관통하지 않는 것이 중요합니다. 적절한 뇌는 볼 수있게한다. 비 우세 손으로 파리의 안정적인 권력을 유지한다.
5. 신속하지만 꾸준히, t 자신의 힘에 의해 해부 포셉의 팁을 해제하고 멀리 눈물이 릴리스에서 모멘텀에 의존그는 외골격 플라이 머리 주변. 볼이되어야 적절한 손상되지 않은 뇌 (즉시 그림 1C에서 바닥 forcep의 끝 위의 흰색 조직) (그림 1C에 도시 바깥쪽으로 빨간색 화살표로 도시)를 출시 forcep 팁의 모멘텀을 안내하는 가상 선을 따르십시오. 이 부드럽게 외골격을 제거하고 뇌에서 뇌 관련 눈과 기관의 가장 것입니다. 적절한 타이밍과 힘은 외골격은 연구자의 경험에 의존 할 것이다 열 적용했다.
   참고 :이 해부하는 동안 가장 중요한 단계입니다. 이는 노출 된 뇌 떠나는 것은 신체의 나머지에 부착 된 상태로 남아 외골격을 제거 개구 포셉 운동량으로부터 발생하는 자연의 힘에 의존하는 것이 중요하다.
6. 조심스럽게 백색 섬유 구조로 표시되는 기관으로 남은 액세서리 조직을 제거하는 지배적 인 손에 집게를 사용 remainiNG는 뇌에 연결합니다. 당기거나 적절한 뇌 손상되지 않도록주의하십시오.

뇌의 3 면역 형광 염색법

1. 60 분 - 40 4 % PFA의 약 1 mL에 관련 흉상과 함께 해부 뇌 샘플을 수정합니다.
   참고 :이 이후의 단계는 제대로 용액에 시료를 혼합하는 nutator에 샘플 튜브 또는 플레이트를 유지합니다.
2. 아래로 3 번 용액을 위로 피펫 팅에 의해 1X PBS 1 mL로 씻어. 떨어져 머리를 대기음하지 않도록주의하십시오.
3. 5 분마다 1 배 PBT와 5 회 반복한다. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오.
4. 4 ° C에서 / 적절한 희석 O에서 일차 항체와 N을 품어.
5. 다음 날, 차 항체를 제거하고 1X PBT와 샘플을 5 회 반복한다. 각 세척 사이에 1 배 PBT 용액에 10 분 - 5 샘플을 남겨주세요. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오.
6. 세척을 품어제안 된 희석 및 배양 시간에 적절한 보조 항체의 샘플.
7. 각 세척 사이에 10 분 배양과 1X PBT와 샘플을 여섯 번 씻으십시오.
   이 단계는 샘플에서 비특이적 결합 이차 항체의 제거를 위해 중요하다.
8. 30 분 동안 1X PBT 용액 1 ㎎ / ㎖ 4 ', 6'- diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 10,000 희석 1 부화. DAPI는 DNA의 AT 영역에 결합하고, 뇌의 전반적인 형태를 나타 내기 위해 사용될 수있는 DNA 염료이다.
9. 1X PBS로 3 회 씻어.
10. 전송 해부 접시에 샘플, 그리고 집게를 사용하여 절개 접시에 시체에서 머리를 분리합니다.
11. 염색 및 세척 단계 후, 둘 사이의 커버 슬립의 두뇌를 탑재하고 장착 슬라이드의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 뇌의 양쪽이 동일한 신호 강도로 이미징 될 수 있도록 이러한 방법으로, 뇌 샘플 용이 대칭 될 수있다.
    참고 : 대신 직접 장착 슬라이드의 커버 슬립의 뇌를 장착하여 자유롭게 샘플의 방향의 반전을 할 수 있습니다. 실장 공정은 아래에서 더 상세히 설명한다.
    1. 장착 슬라이드의 상단에 18 X 18mm의 coverslip에 배치합니다. 블레이드와 피펫 팁의 개구를 넓히고 18 X 18mm의 커버 슬립 상 1X PBS 용액에 뇌를 전송하도록 사용.
    2. 안티 - 페이드 장착 매체의 40 μL (0.2 % (99.5에서 w / v)의 n- 프로필 갈 레이트 - 다른 (20), 커버 슬립의 중간에 두뇌를 놓습니다 미세 피펫 팁과 뇌 주변의 액체를 제거하고 추가 뇌 % 이상 ACS 등급 글리세롤).
       주 : 배지 첨가 실장 양 검사 뇌의 수에 의존한다.
    3. 바깥쪽으로 점성 장착 매체 변위 동안 부드럽게 머리를 확산. 그것은에 닿을 때까지 제 일측에서 상기 슬라이드를 하강시킴으로써 뇌의 상단에 제 18 X 18mm의 커버 슬립을 배치장착 미끄러짐 표면은 천천히 기포와 뇌의 접촉을 최소화하기 위해 다른 쪽을 낮추는.
       주 : 장착 매체의 볼륨으로 두 커버 슬립 사이에 스페이서를 사용하고 뇌 두 커버 슬립을 분리하기에 충분한 공간을 제공해야 할 필요가 없다.
    4. 슬라이드가 정착하도록 허용합니다. 실험실 조직과 슬립의 측면에서 나오는 과도한 액체를 제거합니다.
    5. 운송시 장착 슬라이드를 탈락 탑재 된 두뇌와 커버 슬립을 방지하기 위해 장착 슬라이드로 된 커버를 부착하는 테이프의 작은 조각을 사용합니다.
       주 : 뇌에 장착 된 슬라이드를 즉시 묘화 또는 슬라이드를 밀봉하는 밀봉 제를 사용할 필요없이, 형광 신호의 현저한 손실없이 1 주 4 ℃에서 보존 될 수 사이. 스테인드 뇌 장기 보존 두 슬립의 측 w를 밀봉 할 수있다i 번째 네일 폴란드어 및 저장 -20 ° C의 냉동고, 스테인드 뇌가 시간이 지남에 따라 자신의 신호를 잃을 수도 있지만. 이 권장되지 않습니다.
12. 이미지에 머리를 적절한 화합물 형광 현미경 공 초점 현미경을 사용합니다.
    1. 우선, 목적에 가까운 뇌 측으로부터 화상을 취득하고 신중 중간에 끼워진 샘플을 갖도록 플립 커버 슬립. 이 단계는 같은 뇌의 다른 쪽의 화상을 취득 용이하게한다.
    2. (예를 똑바로 화합물 형광 현미경 및 이미지에 20 배 대물 렌즈 전체 뇌 (그림 2의 예) 및 한 쌍의 전방 내측 (PAM) 클러스터 지역에서 DA 뉴런과 뇌의 이미지 작은 지역에 40X 목표를 사용하여 그림 3).

상술 한 바와 같이 그림 1, 성인 뇌 해부를위한 주요 절차를 보여 2 및도 3은 3 일짜리 WT의 대표 이미지입니다. (유전자형가 : ^1,118 원) 성인 티로신 하이드 록에 대한 항체와 costained 된 머리를 비행 (TH를 그림 2에서 빨간색으로 색깔과 그림 3) 흰색, 마커는 일반적으로 모든 분화 된 신경 세포의 모든 세포 핵 및 Elav 단백질에 대한 항체, 마커에 라벨을 붙이기 위해 DNA 염색 DAPI 이외에, DA 뉴런 ^{(11) 레이블을} 사용 파리에서 함께 뇌의 전체 구조를 공개하는 (녹색 색).

1 200 희석 및 랫트 항 - Elav 항체 :도 2 및도 3에 일차 항체를 들어, 우리는 (1)에서 토끼 항 TH 항체를 사용하여 100 희석, WHICH는 비특이적 결합을 차단하는, 5 % 정상 염소 혈청, 1X PBT 제조 하였다. 1X PBT 500 희석 이차 항체, 우리는 1 알렉사 형석 488 결합 염소 - 항 - 생쥐 항체 AlexaFluor596 결합 염소 항 - 토끼 항체를 사용 하였다.

뇌 영상에, 우리는 뇌의 관심 영역의 전체 깊이를 커버 뇌 조각 Z 스택 이미지를 획득하는 함수 apotome 갖춘 직립 화합물을 형광 현미경을 사용 하였다. 예를 들어, 전체 뇌 DA 신경의 일반적인 분포의 명확한 시각화를 얻기 위해 우리는 별도로 화상 같은 뇌의 전방 및 후방 측면 (도 2) 20 배 대물 렌즈를 사용했다. 25 μm의 총 - 뇌의 각면의 깊이는 모든 DA 신경을 포함 할 수있는 약 20 군데. 확실하게 작은 셀 크기와 약한 TH의시를 가지고있는 PAM 클러스터 지역에서 DA 뉴런을 시각화하고 정량화하기gnals (아래 참조), 우리는 40X 대물 렌즈를 사용했다. PAM에 클러스터 영역 (도 3C)의 3D 재구성 최적의 이미지 품질을 확보 각 묘화 슬라이스와 1 ㎛, - 또한, 상용 소프트웨어에서 Z 계 수집 기능에서, 우리는 0.5의 단면 두께를 선택했다. 10 μm의 총 - 모든 DA 신경 커버 뇌 PAM 클러스터의 두께는 약 8이다. 우리의 경험에서, apotome 기능이 크게 이러한 뇌 전체 또는 PAM 클러스터 영역으로 높은 배경, 두꺼운 샘플을 이미징의 노이즈 신호를 줄일 수 있습니다.

도 2F-J가 뇌의 양쪽 사이에서 신호 강도의 비슷한 수준을 표시 뇌 샘플을 보유하고있는 커버 슬립을 틀지 후 동일한 뇌의 후방보기를 표시하는 반면,도 2A-E는 뇌의 앞쪽보기를 표시 모든 세 군데 채널. 검찰의 neur기능은 초기 지정 ¹¹ 다음 다른 클러스터로 그룹화 된 우리는 PPM1, 최고 ppm2, 뇌의 전방 측 PPM3 클러스터 및 후방 측면을 짝 이름 (PPL을 포함하는 후방 내측 (PPM) 쌍으로 이름을 사용하여 여기에 있지만, 흰색 쇼 전방 및 고배율에서 같은 뇌의 후방 뷰도 2E 및 2J.도 2E 및 2J에 도시 된 바와 같이) DA의 다른 클러스터를 공개, 뇌의 후방 측으로부터 PPL1 및 PPL2 클러스터를 커버하는 뇌의 양쪽 뉴런. 백색 라인은 뇌 (도 2e)뿐만 아니라 PPL 뇌 (도 2J)의 후방 측의 PPM 클러스터의 전방 측에 띄는 PAM 페어링 전방 측면 (PAL) 클러스터를 강조 점선.

도 3a 및도 3b A를 w ¹¹¹⁸ 파리에서 DA 클러스터의 일부에 대한 정량 결과의 요약 재. 우리는 DA 뉴런은 조각으로 슬라이스 또한 3D에서 부정확 한 계산을 최소화해야 이미지를 재구성었다. 우리는 3 일 된 w ¹¹¹⁸ 파리는 전체 뇌 당 PPM 클러스터에서 27 DA 뉴런의 평균을 것으로 추정, 반구 당 PPL 클러스터의 16 DA 뉴런, 반구 당 PAL 클러스터 (그림 3A)에서 5 DA 뉴런, 그리고 PAM 클러스터 (그림 3B) 각각 97 DA 뉴런. 그림 3C는이 지역의 모든 DA 뉴런을 포함 고배율 이미지의 조각에서 투영 된 PAL 및 PAM 클러스터에서 DA 뉴런의 대표 3D 재구성이다. 이는 예컨대 PAL 다른 클러스터에 비해 PAM 클러스터 DA 신경 비교적 작은 셀 크기 및 약한 TH 염색 신호를 가지고 있다는 것이 명백하다.

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그림 1 :. 성인 초파리 뇌의 해부 프로토콜의 그래픽 그림 (A) 파리는 위쪽 복부 측면에 배치하고, 비 지배적 인 손을 사용하여 흉부에 의해 유지된다. 힘은 부드럽게 아래 흰색 투명 영역을 노출, 플라이 헤드와 코의 약간 바깥쪽으로 확장의 역 경사를 유도하기 위해 집게에 (빨간색 화살표)을 적용 하였다. 지배적 인 손에서 (B) 집게는 얕은 절개 (빨간색 화살표)를 창조하는 코 아래에 투명 영역에 삽입됩니다. 우리가 사용하는 집게는 아주 좋은 팁 끝을 필요는 없습니다. 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이 (C) 집게는, 자신의 힘을 통해 떨어져 올 수 있습니다. 포셉을 열어 생성 된 모멘텀이 상대적으로 깨끗한 초파리 뇌를 노출, 눈과 외골격을 제거합니다. 기관의 대부분은 그 과정에서 제거된다. ( 뇌를 둘러싼 D) 초과 액세서리 조직은 신중하게 적절한 뇌의 전체 노출 멀리립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 :. DA 뉴런의 (a 20X 목적으로 취득) 성인 남성 초파리 B의 비 안티 - 티로신 하이드 록 (TH) 항체와 함께 공개이 그림은 해부 성인 뇌의 대표 이미지를 포함,의 뇌 영역의 Z - 스택 이미지를 사용하여 재구성 화합물 형광 현미경으로 얻은 관심. (AE) 전방 및 (FJ) 같은 성인 뇌의 후방보기; (A & F) 세포 핵은 DAPI 염색 (흰색)와 w (C & H) 신경 세포에 의해 촬영되었다감수 팬 신경 마커 방지 Elav 항체 (녹색)에 의해 표시; (B & G) DA 뉴런은 안티 TH 항체 (적색)에 의해 공개됩니다. (D & I) DAPI, TH 및 Elav 처리를위한 이미지 오버레이. (E & J) 흰색에 도시 DA 뉴런과 뇌 영역의 확대도. 점선은 뇌의 뒤쪽에서 뇌와 PPL 및 PPM 클러스터의 전방에서 PAL 및 PAM 클러스터를 강조 표시합니다. 스케일 바는 모든 패널에 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

(A 40X 목적으로 취득) ¹¹¹⁸ 파리 w 남성 성인의 두뇌 그림 3. 정량 DA 뉴런의. (A & B) DA (n)의 정량안티 TH 염색에 의해 밝혀 ¹¹¹⁸ 파리 w 3 일 남성의 eurons. 데이터 아웃 라이어로서 최소 및 최대 값을 나타내는 박스 휘스커 플롯에 의해 표현된다; 뿐만 아니라 첫 번째 (Q1)로, 두 번째 (Q2)와 세 번째 (Q3)는 분위수. 제 분위수는 평균값으로 표현된다. (A) PPM {(N = 28) 최소 : 21 Q1 : 24, 평균 : 27, Q2 : 30, 최대 : 32}, PPL {(N = 26) 최소 : 10, Q1 : 12, 평균 : 16 Q2 : 18, 최대 : 25}, 및 PAL {(N = 24), 최소 : 2, Q1 : 4, 평균 : 5, Q2 : 5, 최대 : 10} 클러스터; (B) PAM 클러스터 {(N = 20) 최소 : 86, Q1 : 94, 평균 : 97, Q2 : 97, 최대 : 99}. 3 일에 ¹¹¹⁸ 파리 w 남성의 PAM 및 PAL 클러스터에서 DA 뉴런을 보여주는 (C) 대표 투사 이미지입니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

인간의 뇌 질환, 신경 회로, 및 높은 뇌 기능을 연구하기 위해 성인 초파리 뇌 사용에 대한 관심이 증가, 대형 - 특히 중요 전체 마운트 분석을위한 완전한 비행 뇌를 얻었다 간단하고 빠른 방법을 개발하는 것이 필요하다 뇌 기반의 화면을 확장 할 수 있습니다. 우리의 방법은 간단하고 배우기 쉬운 플라이 머리를 해부하는 방법을 (자주 경험 미만 10 초에) 잘 보존 된 형태와 크게 관련 조직의 해제가 제공합니다. 해부 뇌 여전히 플라이 본체의 나머지에 부착 될 때, 그들은 일반적으로 신속하게 샘플 튜브의 바닥에 가라 세탁 염색 단계에서 인식하고 수집하기 쉽다. 이것은 상당히 작은 물리적 크기의 뇌 샘플을 처리에서 눈에 띄는 문제가 될 수있는 샘플 손실을 최소화 할 수 있습니다. 이 문제는 대규모 연구에 특히 중요 할 수있다. 뇌 용이 본체로부터 분리 될 수있다장착 전에 염색 공정의 종료 후.

절개 동안, 올바르게 플라이를 위치 즉시 헤드로부터 외골격을 제거 할 때 적절한 각도를 유지하고, 부드럽게 각 단계를 수행하기에 적절한 힘을 발휘하는 것이 중요하다. 집게는 플라이 (도 1b)의 잘린 것을 방지하기 위해 서로에 대해 수직으로 배치되는 것이된다. 도 2에 대표적인 사진에 도시 된 바와 같이,이 프로토콜을 이용하여 제조 된 뇌는 만족스러운 결과를 생성한다. 이 예에서 우리는 성인 뇌의 PAM 클러스터의 DA 뉴런에 초점을 맞추었다. 평균에서 초파리 뇌는 특유의 투영 패턴과 기능 출력 ^{11, 12와} 뇌의 다른 지역에서 서로 다른 클러스터에 배포됩니다 protocerebrum 당 약 280 DA 뉴런의 객실을 선택할 수 있습니다. 성인 초파리 뇌, includi을에서 DA 뉴런의 이전 특성을NG는 파킨 돌연변이과 인간 질병 유전자의 모델을 비행, 크게 PAL에 초점을 맞추고있다, 비교적 큰 셀 크기와 TH, 라벨 DA 뉴런 ^13-18에 사용되는 표준 메이커의 눈에 띄는 표현이 PPL 및 PPM 클러스터.

그러나, 플라이 뇌 DA 신경 세포의 대부분이 클러스터 당 약 100 DA 신경 더불어 PAM 클러스터에서 발견된다. 다른 DA 클러스터의 셀에 비해, PAM 클러스터 DA 신경 일반적 티로신 수산화 효소 발현 및 작은 셀 크기의 더 작은 레벨을 나타낸다. 공 촛점 이미지없이 우리 해부 및 염색 프로토콜로부터 제조 된 샘플에서, PAM 클러스터의 DA 신경 명확하게 가시화 될 수 있고, 화합물을 형광 현미경을 사용하여 고품질의 이미지화. 그 많은 감안할 때, 서로 다른 유전 적 배경의 PAM 클러스터의 DA 뉴런의 정량은보다 안정적이고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 제안 그 PAM의 CLUS에서 DA 뉴런터가 DA 생물학을 공부하고 파킨슨 병과 같은 DA-관련 질환을 모델링하기위한 또 다른 유용한 시스템을 나타냅니다.

우리의 경험에서, 우리는 크게 특히 전체 성인 플라이 뇌 상당한 두께의 샘플을 검사에서 배경 신호를 줄일 수 있습니다 사용되는 현미경에서 apotome 기능. 공 초점 레이저 주사 현미경 자세히 높은 배율 나은 품질 이미지를 생산할 수 있지만, 종종 시간 소모적이고 비용이 많이 든다. 이는 분명 3D 재구성 및 컨벌루션 분석 Z 스택 부의 시리즈 요구 성인 뇌으로 두꺼운 많은 샘플을 이미징 특히 그러하다. 이러한 관점에서, apotome 기능이 충분한 품질의 이미지를 생성하기 위해 신속하고 비용 효율적인 대안을 나타낸다 (예를 들어,도 2 및도 3의 이미지).

뇌의 연구에서는 모두 화상 SI에서 세포 종종 필요같은 뇌의 데. 예를 들면, DA 신경은 뇌의 앞쪽과 뒤쪽 양쪽에서 클러스터에 존재한다. 뇌 슬라이드 상에 장착 한 후에 촬상 그러나 인해 두께로 떨어진 광원으로부터의 측면 (즉, 장착 슬라이드 대향면)은 일반적으로 정규 화합물 및 공 촛점을 사용하여 약한 신호 적은 선명한 화상을 일으킨다 현미경. 두 커버 슬라이드 사이에 시료를 장착함으로써, 상기 장착 슬라이드 유사한 신호 세기와 같은 뇌의 양쪽의 후속 영상에 샘플 편리 반전 할 수있다.이 그림의 양쪽에서 촬상 DA 뉴런의 예 상대적으로 비교 신호 강도 및 이미지 품질을 보여 주었다이 방법을 사용하여 머리를 비행.

성인 비행 뇌를 해부에 대한 몇 가지 쉬운 다음과 접근 방법이 잘되어 ^{9, 10을} 설명하고있다. 우리의 접근 방식은 모피 할 수있는 다른 방법을 제공합니다THER 성인의 해부 및 염색 과정이 뇌를 조종 단순화합니다. 더 큰 규모의 연구가 전체 뇌 신경 회로뿐만 아니라, 분자 및 세포 성분을 매핑하도록 수행되고, 자동 해부 및 촬상 방법은 높은 처리량 유전자 의약품 스크린을 실현 성인 초파리 뇌에서 개발 될 수 있음을 예견 이 고전적인 유전자 모델에서 생체있다.

The authors have nothing to disclose.

우리는 프로젝트에 자신의 엄청난 지원 씨 ENES 메 흐멧, 미스 키아라 엔드 레데, 미스 필로드 리 게스, 크리스 곽, 그리고 양 다나 Ghafir을 인정합니다.