Method Article
ذبابة الفاكهة الدماغ الكبار هو نظام القيم لدراسة الدوائر العصبية، وظائف الدماغ العليا، واضطرابات معقدة. وسيلة فعالة لتشريح أنسجة المخ كله من الرأس ذبابة صغيرة وتسهيل الدراسات القائمة على الدماغ. نحن هنا وصف، بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة من أدمغة البالغين مع التشكل الحفاظ عليها جيدا.
هناك اهتمام متزايد في استخدام ذبابة الفاكهة لنموذج الدماغ من الأمراض التنكسية الإنسان، خريطة circuitries العصبية في أدمغة البالغين، ودراسة الأسس الجزيئية والخلوية من وظائف المخ العليا. وإعداد كامل جبل أدمغة البالغين مع التشكل المحفوظة جيدا أمر بالغ الأهمية لمثل هذه الدراسات القائمة على الدماغ كله، ولكن يمكن أن يكون تحديا وتستغرق وقتا طويلا من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول نهج تشريح خطوة واحدة سهلة لتعلم، من رأس الذبابة في أقل من 10 ثانية، مع الحفاظ على الدماغ سليمة تعلق على بقية الجسم لتسهيل خطوات المعالجة اللاحقة. الإجراء يساعد على إزالة معظم أنسجة العين والقصبة الهوائية التي ترتبط عادة مع الدماغ التي يمكن أن تتداخل مع خطوة التصوير في وقت لاحق، ويضع أيضا أقل من الطلب على نوعية ملقط تشريح. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طريقة بسيطة التي تسمح التقليب مريحة للعينات الدماغ التي شنت على ساترة، وهو أمر مهم لتصوير جانبي بالأمطار مع كثافة إشارة مماثلة والجودة. وكمثال على ذلك البروتوكول، نقدم تحليلا لالدوبامين (DA) الخلايا العصبية في أدمغة البالغين من WT (ث 1118) الذباب. فعالية عالية في طريقة تشريح يجعلها مفيدة بشكل خاص للدراسات تستند الدماغ الكبار على نطاق واسع في ذبابة الفاكهة.
الكائن الحي نموذج ذبابة الفاكهة، والمعروف باسم ذبابة الفاكهة، منذ فترة طويلة قيمتها لأدوات الوراثية الأنيقة، وأحيانا الإنجابية قصيرة، وحفظها للغاية المسارات الجزيئية والخلوية. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة بنجاح لتشريح مسارات أساسية الإشارات، وآليات الزخرفة من الكائنات متعددة الخلايا، وكذلك الآليات الكامنة وراء تطوير الخلايا العصبية، وظائف، وأمراض 1،2. مع التطورات الحديثة في تقنيات وضع العلامات الخلية والتصوير، وأصبح الدماغ ذبابة الفاكهة قوية خاصة في رسم الخرائط على ما يرام من الدوائر العصبية وفي تشريح الأساس الجزيئي والخلوي وظائف الدماغ العليا، مثل التعلم والذاكرة، وإيقاع الساعة البيولوجية 1،3، 4،5،6،7،8.
ميزة واحدة معينة من نظام ذبابة الفاكهة هو حجمها الصغير نسبيا، مما يسمح كله جبل إعداد وفحص الدماغ باستخدام مركب العادية أو المجهر متحد البؤر. ثيتمكن الصورة ميزة تحليلات مفصلة التشريحية والوظيفية للدوائر العصبية، أو حتى الخلايا العصبية واحدة، عند مستويات الخلوية والتحت خلوية، في سياق أنسجة المخ بأكملها، وبالتالي تقديم كل نظرة شمولية لدرس الموضوع وهندسته بدقة داخل كله الدماغ. ومع ذلك، وبالنظر إلى حجم مصغر بدلا من الدماغ، ويعرض أيضا تحديا تقنيا في تشريح بكفاءة على أنسجة المخ سليمة من اقية حالة رئيس الهيكل الخارجي في ذبابة الكبار. وقد وصفت مختلف وسائل فعالة وبسيطة نسبيا تشريح في التفاصيل، التي عادة ما تنطوي على الحذر وخطوة حكيمة شطب القضية الرأس والأنسجة المرتبطة بما في ذلك العينين والقصبة الهوائية، والدهون من الدماغ السليم 9 و 10. هذه الأساليب تشريح المجهرية في كثير من الأحيان تفرض ضغوطا صارمة بدلا من ذلك على نوعية ملقط تشريح، والاعتماد على ملقط مع غرامة نصائح متماشية بشكل جيد يمكن أن تتلف بسهولة. وعلاوة على ذلك، كما أدمغة تشريح غالبا ما تكون separatإد من بقية الجسم، والعقل يمكن أن تضيع بسهولة خلال عمليات تلطيخ والغسيل لاحقة بسبب أحجامها الصغيرة وشفافيتها في المخزن المؤقت المعالجة. هنا، نحن تصف بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة نسبيا وسهلة لتعلم، لأدمغة البالغين التي تحافظ على العقول تشريح تعلق على الجذع. عملية تشريح في كثير من الأحيان مسح بسهولة بعيدا معظم الأنسجة المرتبطة الدماغ مثل العين والقصبة الهوائية ويقلل من الطلب على ملقط تشريح ذات نوعية جيدة.
بالإضافة إلى ذلك، عندما تصوير الدماغ تحت المجهر المركب الفلورسنت أو المجهر متحد البؤر، إلى جانب الدماغ الذي هو بعيدا عن مصدر ضوء الفلورسنت غالبا ما تنتج إشارة أضعف والصور أقل وضوحا بسبب سماكة الدماغ كله جبل. هنا، ونحن أيضا تصف طريقة تركيب بسيط يسمح التقليب السهل من العينات الدماغ، مما يتيح سهولة التصوير من كلا الجانبين من المخ مع intensi إشارة مماثلةتاي والجودة.
ونتيجة لإثبات صحة مفهوم لتطبيق هذا الأسلوب لدراسة الدماغ الكبار، درسنا كذلك وجود الخلايا العصبية DA في أدمغة ث 1118 الذباب. النمط الجيني التي كثيرا ما تستخدم كخط الوالدين لتوليد الذباب المعدلة وراثيا والسيطرة wildtype في العديد من الدراسات ذبابة الفاكهة.
1. الحلول المستخدمة لالدماغ تشريح وتلطيخ مناعي
2. المجهرية تشريح رؤساء الكبار يطير
ملاحظة: يتم توضيح إجراء تشريح في الشكل 1.
3. مناعي يلطخ من العقل
ويوضح الشكل (1) والإجراءات الرئيسية لتشريح الدماغ الكبار، على النحو المبين أعلاه أرقام 2 و 3 هي صور تمثيلية من العمر 3-يوم-WT. (الوراثي: ث 1118) الكبار يطير العقول، التي costained مع الأجسام المضادة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH والملون باللون الأحمر في الشكل 2 والأبيض في الشكل 3)، علامة تستخدم عادة لتسمية الخلايا العصبية DA 11، بالإضافة إلى صبغ الحمض النووي دابي وصف كل نواة الخلية والأجسام المضادة ضد بروتين Elav، علامة لجميع الخلايا العصبية متباينة في الطاير (ملونة باللون الأخضر)، والتي كشفت معا الهيكل العام للدماغ.
لالأجسام المضادة الأولية في الشكلين 2 و 3، وكنا أرنب الأجسام المضادة لمكافحة TH في 1: 200 التخفيف والفئران مكافحة Elav الأجسام المضادة في التخفيف 1: 100، مبادرة الخوذ البيضاءأعدت الفصل في 1X PBT مع 5٪ مصل الماعز العادي لمنع ملزمة انوعي. عن الأجسام المضادة الثانوية، كنا اليكسا فلور 488 مترافق الأجسام المضادة الماعز مكافحة الفئران والماعز AlexaFluor596 مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في التخفيف 1: 500 في 1X PBT.
لصورة العقول، واستخدمنا المجهر المركب الفلورسنت تستقيم مجهزة وظيفة apotome للحصول على الصور Z-كومة من شرائح الدماغ التي تغطي عمق كاملة من منطقة الفائدة في الدماغ. على سبيل المثال، للحصول على تصور واضح لتوزيع العام من الخلايا العصبية DA في الدماغ كله، استخدمنا 20X عدسة موضوعية لحدة الصورة الأمامية والخلفية الجانبين من نفس الدماغ (الشكل 2). عمق كل جانب من الدماغ تصوير يمكن أن تغطي جميع الخلايا العصبية دا هو حوالي 20-25 ميكرومتر في المجموع. لتصور بشكل صحيح وتحديد الخلايا العصبية DA في المنطقة كتلة حزب الأصالة والمعاصرة، والتي لديها أحجام الخلية أصغر وأضعف الاشتراكية THgnals (أنظر أدناه)، استخدمنا 40X عدسة الهدف. بالإضافة إلى ذلك، في وظيفة اكتساب Z-سلسلة من البرامج التجارية، اخترنا سمك مقطع من 0،5-1 ميكرون بين كل شريحة تصويرها، والذي يكفل جودة الصورة المثلى في إعادة الإعمار 3D من المنطقة كتلة حزب الأصالة والمعاصرة (الشكل 3C). سمك كتلة حزب الأصالة والمعاصرة في الدماغ والتي تغطي جميع الخلايا العصبية DA حوالي 8-10 ميكرون في المجموع. في تجربتنا، يمكن الدالة apotome تقلل إلى حد كبير إشارة الضوضاء في التصوير عينات سميكة مع خلفية عالية، مثل الدماغ كله أو المنطقة كتلة حزب الأصالة والمعاصرة.
الأرقام 2A-E إظهار العرض الأمامي من الدماغ، في حين أن الأرقام 2F-J إظهار العرض الخلفي من نفس الدماغ بعد التقليب لل coverslips التي تحمل عينات الدماغ، الذي عرض على مستوى مماثل من شدة إشارة بين الجانبين من الدماغ ل جميع القنوات تصوير ثلاثة. وneur DAوقد جمعت الإضافات إلى مجموعات مختلفة التالية أوائل تعيين 11، على الرغم من هنا نستخدم اسم المقترنة الخلفي الإنسي (PPM) لتشمل PPM1، PPM2، ومجموعات PPM3 في الجانب الأمامي من الدماغ، واسم المقترنة الخلفي الجانبي (PPL ) لتغطية مجموعات PPL1 وPPL2 من الجانب الخلفي من الدماغ، كما هو مبين في الشكلين 2E و2J. 2E أرقام و2J في أبيض عرض الأمامي والآراء الخلفية من نفس الدماغ في عالية التكبير، وكشف عن مجموعات مختلفة من DA الخلايا العصبية على جانبي الدماغ. تحطمت الأبيض خطوط الضوء على حزب الأصالة والمعاصرة بارز ومجموعات تقرن الأمامي الجانبي (PAL) في الجانب الأمامي من الدماغ (الشكل 2E) وكذلك PPL ومجموعات PPM في الجانب الخلفي من الدماغ (الشكل 2J).
أرقام 3A و 3B ل إعادة ملخصات لنتائج القياس الكمي لبعض الكتل DA في ث 1118 الذباب. أحصينا الخلايا العصبية DA شريحة من قبل شريحة وأيضا من 3D بناء صور، والتي ينبغي تقليل عد غير دقيق. ونحن نقدر أن عمرها 3 أيام ث 1118 الذباب لديها في المتوسط 27 الخلايا العصبية DA عموما في الكتلة جزء في المليون في الدماغ، 16 الخلايا العصبية DA في الكتلة PPL في نصف الكرة الأرضية، 5 الخلايا العصبية DA في المجموعة PAL في نصف الكرة الأرضية (الشكل 3A)، و97 الخلايا العصبية DA في كل مجموعة من مجموعات حزب الأصالة والمعاصرة (الشكل 3B). الشكل 3C هو إعادة الإعمار 3D تمثيلية من الخلايا العصبية DA في المجموعات PAL وحزب الأصالة والمعاصرة، المتوقع من شرائح من الصور عالية التكبير التي تغطي جميع الخلايا العصبية DA في هذه المنطقة. ومن الواضح أنه بالمقارنة مع المجموعات الأخرى مثل PAL، الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة وأحجام الخلايا الصغيرة نسبيا وضعف إشارات تلطيخ TH.
"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
الشكل 1: رسم بياني لبروتوكول تشريح لالكبار ذبابة الفاكهة الدماغ يتم وضع (A) الذباب مع الجانب البطني صعودا، والتي تحتفظ بها الصدر باستخدام اليد غير المسيطرة. والقوة المطبقة بلطف (الأسهم الحمراء) إلى ملقط للحث على آماله المتخلفة من رئيس الطيران والإرشاد الخارجي طفيف للخرطوم، وتعريض المنطقة أبيض شفاف أدناه. تندس (ب) الملقط من ناحية المهيمنة في المنطقة شفافة تحت خرطوم، وخلق شق الضحلة (السهم الأحمر). لاحظ أن ملقط نستخدمها لا تملك نهايات طرف الجميلة جدا. ويسمح (C) الملقط لتفكك من خلال القوة الخاصة به، كما يتبين من السهام الحمراء. الزخم الذي تولد عن طريق فتح ملقط يزيل العين والهيكل الخارجي، وفضح لذبابة الفاكهة الدماغ نظيفة نسبيا. تتم إزالة معظم القصبة الهوائية في هذه العملية. ( وقلص D) الزائدة الأنسجة ملحق المحيطة بالمخ بعناية بعيدا عن التعرض الكامل من الدماغ السليم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كشف DA الخلايا العصبية مع مكافحة هيدروكسيلاز التيروزين (TH) الأجسام المضادة في الكبار ذكر ذبابة الفاكهة B المطر (المكتسبة مع الهدف 20X) ويشمل هذا الرقم صور تمثيلية من أدمغة البالغين تشريح، أعيد بناؤها باستخدام الصور مكدسة Z في المنطقة دماغ الفائدة التي تم الحصول عليها مع المجهر الفلورسنت مركب. (AE) الأمامية و(FJ) وجهات النظر الخلفي من نفس الدماغ الكبار. (A & F) تم تصوير نواة خلية من تلطيخ دابي (أبيض) والخلايا العصبية (C & H) ثيحرث وصفت من قبل الأجسام المضادة علامة عموم العصبية مكافحة Elav (الأخضر)؛ وكشف الخلايا العصبية (B & G) DA بواسطة أضداد TH (الحمراء). (D & I) تراكب الصور لدابي، TH والعلاج Elav. (E & J) نظرا الموسع للمناطق الدماغ مع الخلايا العصبية دا هو مبين في الأبيض. الخطوط المتقطعة تبرز PAL وحزب الأصالة والمعاصرة مجموعات في الجزء الأمامي من الدماغ ومجموعات PPL وجزء في المليون في الخلفية من الدماغ. ويمثل الشريط على نطاق و50 ميكرون في كل من لوحات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الكمي لDA الخلايا العصبية في أدمغة الذكور البالغين ث 1118 الذباب (المكتسبة مع الهدف 40X). (A & B) الكمي لدا نeurons من يوم 3 ذكور ث 1118 الذباب، التي كشفت عنها تلطيخ مكافحة TH. يتم تمثيل البيانات عن طريق الخط الطولي المؤامرات مربع تبين الحدين الأدنى والأقصى حيث القيم المتطرفة. وكذلك أول (Q1)، الثاني (Q2) والثالث (Q3) الربعية. ويمثل الربع الثاني حيث بلغت قيمة المتوسط. (A) جزء في المليون {(ن = 28) الحد الأدنى: 21، Q1: 24، متوسط: 27، Q2: 30، الحد الأقصى: 32}، PPL {(ن = 26) الحد الأدنى: 10، Q1: 12، متوسط: 16، Q2: 18، الحد الأقصى: 25}، وبال {(ن = 24)، الحد الأدنى: 2، Q1: 4، متوسط: 5، Q2: 5، الحد الأقصى: 10} مجموعات؛ الكتلة (ب) PAM {(ن = 20) الحد الأدنى: 86، Q1: 94، متوسط: 97، Q2: 97، الحد الأقصى: 99}. (C) صورة الإسقاط تمثيلية تظهر الخلايا العصبية DA في حزب الأصالة والمعاصرة وPAL مجموعات من الذكور ث 1118 الذباب في 3 د. يمثل مقياس شريط 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مع اهتمام متزايد في استخدام الكبار ذبابة الفاكهة الدماغ لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان الدماغ، الدوائر العصبية، وظائف المخ العليا، فمن الضروري لتطوير أساليب بسيطة وسريعة للحصول على العقول ذبابة سليمة لتحليل كامل جبل، وهو أمر مهم خصوصا للواسع حجم شاشات القائم على الدماغ. يوفر طريقة لدينا بسيطة وسهلة لتعلم نهج لتشريح من رأس الذبابة (غالبا في أقل من 10 ثانية مع الخبرة) مع التشكل المحفوظة جيدا أن أخلى إلى حد كبير من الأنسجة المرتبطة بها. كما لا تزال تعلق أدمغة تشريح لبقية الهيئات الطيران، وعادة ما تنزل الى قاع الأنبوب عينة بسرعة ويسهل التعرف عليها وجمع أثناء الغسل وتلطيخ الخطوات. هذا يقلل بشكل ملحوظ فقدان العينة التي يمكن أن تكون قضية بارزة في تجهيز العينات الدماغ من الأحجام الجسدية صغيرة. يمكن أن تكون هذه القضية أهمية خاصة للدراسات واسعة النطاق. الدماغ يمكن فصله بسهولة من الجسمبعد الانتهاء من عملية التلوين، قبل تصاعد.
أثناء تشريح، فمن المهم أن موقف الطاير بشكل صحيح، والحفاظ على الزوايا المناسبة عند إزالة الهيكل الخارجي من رأس ذبابة، وبلطف ممارسة القوة المناسبة في تنفيذ كل خطوة. فمن المستحسن أن ملقط توضع بشكل عمودي مع بعضها البعض من أجل منع قطع الرأس من ذبابة (الشكل 1B). كما هو مبين في الصور ممثل في الشكل 2، والعقول إعدادها باستخدام هذا البروتوكول تسفر عن نتائج مرضية. في هذا المثال، ركزنا على الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة من أدمغة البالغين. والدماغ ذبابة الفاكهة في المتوسط لديها ما مجموعه نحو 280 الخلايا العصبية DA في protocerebrum، والتي يتم توزيعها في مجموعات متميزة في مناطق مختلفة من الدماغ مع أنماط العرض المميزة والمخرجات الوظيفية 11 و 12. التوصيف السابق من الخلايا العصبية DA في العقول ذبابة الفاكهة الكبار، includiنانوغرام يطير نماذج من جينات الأمراض البشرية مثل المسوخ باركين، وركزت بشكل كبير على بال، PPL، وPPM الكتل التي لديها أحجام خلية كبيرة نسبيا والتعبير بارز من TH، صانع القياسية المستخدمة لوصفها الخلايا العصبية DA 13-18.
ومع ذلك، تم العثور على معظم الخلايا العصبية DA في الدماغ ذبابة في مجموعات حزب الأصالة والمعاصرة، مع حوالي 100 الخلايا العصبية DA لكل كتلة. مقارنة مع الخلايا في مجموعات DA أخرى، الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة تظهر عادة على مستوى أصغر التعبير هيدروكسيلاز التيروزين وأحجام خلايا صغيرة. في عينات أعد من وجهة نظرنا بروتوكول تشريح وتلطيخ، والخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة يمكن تصور واضح وتصوير في ذات جودة عالية باستخدام مجهر فلوري مركب، دون التصوير متحد البؤر. نظرا عدد سكانها الكبير، وتحديد حجم الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة من خلفيات وراثية مختلفة قد تؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. نقترح أن الخلايا العصبية DA في clus حزب الأصالة والمعاصرةثالثا تمثل نظام آخر مفيد لدراسة البيولوجيا DA ونمذجة الاضطرابات المرتبطة DA، مثل مرض الشلل الرعاش.
في تجربتنا، وظيفة apotome من المجهر كنا يمكن أن تقلل بشكل كبير من إشارة الخلفية، خصوصا في فحص عينات مع سمك كبير، مثل كله الذبابة الدماغ. على الرغم من أن المجهر متحد البؤر يمكن أن تنتج صورا مع مزيد من التفاصيل، تضخم أعلى وجودة أفضل، وغالبا ما تستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وهذا ينطبق بشكل خاص على تصوير عدد كبير من العينات سميكة مثل أدمغة البالغين التي تتطلب سلسلة من القسم Z المكدس واضح لإعادة الإعمار 3D والتحليل deconvolution. في هذا المنظور، وتمثل وظيفة apotome بديل سريع وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج صور ذات نوعية كافية (على سبيل المثال، الصور في الشكلين 2 و 3).
في دراسات الدماغ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لخلايا صورة على حد سواء الاشتراكيةقصر من نفس الدماغ. على سبيل المثال، الخلايا العصبية DA موجودة في مجموعات من كل من الأمامي والخلفي الجانبين من الدماغ. ولكن نظرا لسمكها، بعد أن يتم تركيب الدماغ على الشريحة، وعلى الجانب بعيدا عن مصدر الضوء (أي الجانب التي تواجه شريحة متزايدة) وعادة ما يثير الإشارات الضعيفة والصور أقل وضوحا عند تصويرها باستخدام مركبات منتظم ومتحد البؤر المجهر. بواسطة تركيب العينات في بين اثنين من الشرائح غطاء، لأنها تتيح التقليب مريحة من العينات على الشريحة التي شنت والتصوير لاحق من كلا الجانبين من نفس الدماغ مع شدة إشارة مماثلة الشكل 2 مثال على التصوير الخلايا العصبية DA من جانبي يطير العقول باستخدام هذه الطريقة، التي أظهرت كثافة إشارات مماثلة نسبيا وجودة التصوير.
وكانت عدة طرق سهلة المتابعة للتشريح الكبار يطير العقول لطيف وصفها 9 و 10. يوفر نهجنا طريقة بديلة يمكن أن الفراءذر تبسيط عمليات تشريح وتلطيخ الكبار تطير العقول. مع المزيد من الدراسات على نطاق واسع يجري لرسم المخ بأكملها الدوائر العصبية وكذلك مكوناته الجزيئية والخلوية، فمن المتوقع أن تشريح والتصوير النهج الآلي يمكن تطويرها للكبار العقول ذبابة الفاكهة لتحقيق شاشات الوراثية والمخدرات عالية الإنتاجية في الجسم الحي في هذا النموذج الجيني الكلاسيكية.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف السيد أنيس محمد، السيدة كيارا اندرادي، السيدة بيلار رودريجيز، كريس كوك، والسيدة دانا سورة غافر للحصول على الدعم الهائل لهذا المشروع.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved