In Situ Liver Perfusionによるマウスのインスリンクリアランスの評価

肝臓のインスリンクリアランスは、グルコースの恒常性を調節するために重要です。この記事では、マウスの肝臓インスリンクリアランス率を in situ で直接評価するためのユーザーフレンドリーな肝灌流手順について説明します。

肝臓のインスリンクリアランスは、グルコースの恒常性を維持するために不可欠であり、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病などの代謝障害と密接に関連しています。インスリンクリアランスの正確な測定は、これらの疾患の根本的なメカニズムを理解するために不可欠です。このプロトコルは、マウスにおける簡単でユーザーフレンドリーな肝灌流手順を示しており、特に肝臓のインスリンクリアランス率を直接評価するように設計されています。この方法では、門脈と下大静脈上を精密にカニューレ挿入し、生理学的条件を模倣した in situ 灌流システムを作成します。このプロトコルは、外科的準備から灌流システムのセットアップ、サンプルの収集と分析まで、手順のすべての段階を通じて研究者をガイドします。詳細な手順と、代表的な結果、手順を最適化するための重要なヒントが提供されています。書かれたプロトコルにはビデオチュートリアルが付属しており、視覚的に詳細な指示とイラストが提供されており、肝臓のインスリン代謝とクリアランスの背後にある分子メカニズムを探求する科学者にとってアクセス可能で包括的なリファレンスとなっています。

インスリンの発見は、前世紀のマイルストーンの1つになりました。代謝組織におけるインスリンの合成、分泌、およびその生理学的機能の調節については、多くのことが知られています。しかし、インスリンの分解とその調節メカニズムにはあまり注目されていません。インスリン代謝は、ベータ細胞機能、インスリン抵抗性(IR)または感受性、およびインスリンクリアランスとの間の相互作用として理解できます。インスリン分泌と並んで、肝臓のインスリンクリアランスは、末梢標的組織に到達するために必要なインスリンの恒常性レベルを維持し、適切なインスリン作用を促進する上で重要な役割を果たします¹。複数の研究により、インスリンクリアランスの障害が、メタボリックシンドロームにおける高インスリン血症の病因、および2型糖尿病^2,3、非アルコール性脂肪性肝炎⁴、多嚢胞性卵巣症候群⁵などの他の状態における重要な因子として特定されています。したがって、クリアランスの低下に続発する高インスリン血症は、代謝性疾患の病因に関与している可能性があります。インスリンクリアランスを改善する戦略は、これらの個人における高インスリン血症の好ましくない影響を逆転させる可能性があります。

インスリンには独特の分布パターンがあります。循環血漿インスリンのレベルは、インスリン分泌と除去との間の平衡に依存する。膵臓はインスリンを脈動性で門脈に分泌し、肝細胞に向けます。インスリン分泌に遭遇する最初の臓器として、肝臓は最初の通過中にインスリンの大部分を分解し、総インスリンの60%〜70%を占めます⁶。残りのインスリンは、肝静脈を通って肝臓を出て体循環に入り、そこで末梢組織(主に筋肉、脂肪組織、腎臓)によって部分的に利用され、肝臓動脈⁷を2回目に通過する際に肝臓によってさらに抽出されます。

インスリンクリアランスの正確な測定は非常に重要です。ヒトの研究では、門脈や肝静脈から血液サンプルを取得することが困難であるため、肝臓のインスリンクリアランスを直接測定することは困難です。直接法と間接法の両方を使用して、ヒトおよび動物モデルにおけるインスリンクリアランスを推定します。インスリンクリアランスを間接的に測定するために、約3つの戦略が採用されています。臨床診療で最も頻繁に利用される評価には、C-ペプチド/インスリンモル比⁸に基づく方法が含まれます。このアプローチは、両方のペプチドの等モル分泌と肝臓によるC−ペプチド抽出の不在に基づいている⁹。方法の2番目のグループは、ホルモンの循環への既知かつ特定の入力後のインスリンの血漿崩壊曲線の数学的分析に依存します^2,10,11。第3の方法は、一定の速度でインスリンを注入すると、血液中のホルモンのレベルが安定し、除去率が投与速度¹²と一致するという事実に基づいている。これらの間接的な方法は、主に体内の全体的なインスリンクリアランスを反映しています。肝臓がインスリンクリアランスの主要な部位であり、このプロセスで重要な役割を果たしていることを考えると、肝臓のインスリンクリアランスを直接評価することが不可欠です。

以前の研究では、健康な犬の肝臓インスリン抽出を直接測定しています^13,14。研究では、単離された灌流ラット肝臓モデルを使用して、肝臓からのインスリン抽出も評価しています^15,16。遺伝子組み換え株は高い利用可能性があるため、マウスは分子経路を調査するための貴重なモデルとして機能します。いくつかの研究¹⁷では、マウスモデルで肝臓のインスリンクリアランスを直接評価するために肝臓灌流を利用しています。これらの研究では、ヒトインスリンを含む灌流液を門脈に注入し、下大静脈から採取します。肝臓に吸収されるインスリンの割合は、そのクリアランスを示します。肝臓灌流技術は、温かく、酸素化され、栄養が豊富な灌流液を肝臓血管系を通じて循環させることにより、肝臓を生理学的に近い条件下で維持します。しかし、この手法を進歩させ、普及させるための実践的なガイダンスや重要なヒントは不十分です。

したがって、肝臓のインスリンクリアランスはますます注目されていますが、障害におけるその役割、およびその分子メカニズムは不明のままです¹⁸。そのため、科学研究の分野では高度な技術が大いに必要とされています。このプロトコルは、肝臓のインスリンクリアランスを評価するためのマウスの詳細な修正された肝臓灌流手順を確立します。さらに、この方法は、初回通過効果、薬物輸送プロセス、およびその他のさまざまな側面を含む、肝臓に対する薬物の影響を研究するためにも使用できます。

このプロトコルは、南京医科大学動物管理および使用委員会(IACUC-2105018)によって承認され、施設動物管理および使用委員会のガイドラインに従っています。すべてのC57BL/6Nマウスは、餌と水を自由に利用できる12時間の明暗サイクルで維持されました。生後6週齢のマウスを、Chowダイエット(CD)グループと高脂肪ダイエット(HFD)グループに無作為に分けました。HFDグループには60%の高脂肪食が与えられ、生後10週までこの食事療法を続けました。平均体重はHFD群が28.55g±1.2g、対照群が0.48g±24.3gでした。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 事前準備

1. オートクレーブによる手術器具および消耗品の必要な滅菌を行います。
2. 手術器具、6-0シルク縫合糸、滅菌小型綿アプリケーター、塩化ナトリウム注射剤(500mL)、綿棒、スポンジを手術台に適切に置きます。
3. 最終濃度200 IU / mLのヘパリン食塩水30 mLを調製します。.
4. 内径0.31mm、外径0.64mmの2本のシリコンチューブを用意します。1つは門脈カテーテルとして使用するための長さ4cm、もう1つは下大静脈カテーテルとして使用するための長さ10cmです。
5. 5.0 mmol/Lグルコースと0.25% BSAを含むKrebs-Henseleit(KRBH)灌流バッファーを調製します。
6. 5.0 mmol/Lグルコース、0.25%BSA、および4.0 ng/mLヒトインスリンを含むKrebs-Henseleit(KRBH)灌流緩衝液を調製します。
7. 肝臓灌流システムを設定します。 図1 は、肝臓灌流システムの主な構成要素を示しています。

2. 外科的カテーテル法

1. 以下の手順に従って、麻酔薬混合物を準備します。
   1. ゾレチル50(250 mg / 5 mL)を0.9%塩化ナトリウム溶液で10回希釈します。.
   2. 塩酸キシラジン(200 mg / 2 mL)を0.9%塩化ナトリウム溶液で10回希釈します。.
   3. 0.5%ゾレチル50溶液と1%塩酸キシラジン溶液を1:1の比率で混合します。
2. マウスに麻酔をかけます。
   1. マウスの体重を確認して記録します。5 mL / kg体重(2.5 mg / mLゾレチル50、5 mg / mL塩酸キシラジン)の用量で腹腔内注射 を介して 麻酔混合物を投与します。.麻酔の開始は通常、注射後5〜10分以内に発生し、立ち直反射の喪失と外部刺激に対する反応の低下によって示されます。
   2. マウスを手術台に移します。手足を粘着テープで固定します。2.5 U/gのヘパリンを腹腔内に投与して、ヘパリン化を達成します。
   3. 電気シェーバーを使用して腹部の皮膚の毛皮を切り取り、ポビドンヨード溶液でその部分を消毒します。
3. 門脈カテーテル法を行います。
   1. 下腹部から剣状突起に向かって、腹部中央のラインに沿って縦方向に4cmの切開を行います。内臓を傷つけないように、腹膜をハサミで慎重に切ります。マウス腹部リトラクターを挿入して術野を露出させます。
   2. 腸を右に動かすと、門脈、右腎臓、下大静脈が現れます(図2A)。動脈鉗子を使用して、腎臓の上端にある大静脈を固定します。
   3. 門脈を分離し(図2A)、遠位端を6-0シルク縫合糸で結紮します。露出した血管の近位端に別の縫合糸を緩く結びます。
   4. 結紮された端部付近をスプリングハサミで切開し、カテーテルを挿入します。切開部を通してカテーテルを門脈分岐部のレベルまで進めます。
   5. 両方の結紮糸をカテーテルの周りに固定し、カテーテルの自由端をサンプリングシリンジに接続して適切なサンプリングを確認します。ヘパリン化生理食塩水で洗い流し、カテーテルをクランプします(図2C)。
   6. 牽引装置を取り外し、腸をリセットします。生理食塩水に浸した滅菌ガーゼまたは綿で手術部位を覆います。
4. 下大静脈上カテーテル法を行います。
   1. 剣状突起から胸骨に沿って切開を行い、胸骨を露出させます。
   2. 胸骨を垂直に切り開き、肋骨の縁に沿って横隔膜を切開して胸腔を露出させます。
   3. 下大静脈上を露出させて分離します(図2B)。遠位端を6-0シルク縫合糸で慎重に結紮します。血管の近位端に別の縫合糸を緩く結びます。
   4. 結紮した端のすぐ下をスプリングハサミで切開し、10cmのカテーテルを挿入します。カテーテルの先端が肝臓に近づくまでカテーテルを進め、両方の結紮糸をしっかりと結びます。適切なサンプリングを確認し、cl カテーテルの自由端(図2D)。
   5. 生理食塩水で手術部位をすすぎます。生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで表面を覆います。

3.肝臓灌流

1. 動物の世話と使用に関する施設のガイドラインに従って、麻酔薬と開胸術の過剰投与を使用してマウスを安楽死させ、すべての手順が苦痛を最小限に抑える方法で行われるようにします。
2. 図 1 に示すように、酸素供給器、温度調節装置、輸液ポンプ、輸液チューブを含む肝臓灌流システムを設定します。
3. 酸素供給器に95%の酸素と5%の二酸化炭素の連続ガス流を供給します。
4. ウォーターバスをオンにし、オルガンチャンバーを37°Cに予温します。
5. インスリンの有無にかかわらず、KRBH灌流バッファーを調製します。37°Cのウォーターバスでインキュベートした灌流バッファーでチューブシステムをプライミングします。
   注:KRBHはBSAとグルコースを含んでいません。ヒトインスリンを含まないKRBH灌流緩衝液には5.0 mmol / Lグルコースと0.25%BSAが含まれていますが、ヒトインスリンを含むKRBH灌流緩衝液には5.0 mmol / Lグルコース、0.25%BSA、および4.0 ng / mLのヒトインスリンが含まれています。
6. マウスを環境温度が約37°Cに保たれた容器に入れます。 体温を37°Cに保つために、ウォーミングパッドを使用してください。
7. 門脈カテーテルを通してKRBHバッファーを注入します。.ミニポンプ で 注入速度を0.2mL/minに設定します。
8. 肝臓が数秒以内に青白くなるのを観察し、灌流バッファーが肝臓を流れていることを示しています。肝臓に残っている血液細胞をさらに洗い流すには、4分と8分の時点で注入を1分間一時停止し、灌流の開始からタイミングを開始します。
9. KRBH緩衝液で肝臓を合計10分間灌流します(2回の1分間の一時停止を除く)、平衡化期間を表します。下大静脈カテーテルから基礎サンプルを採取します。
10. インスリンが豊富な同じ溶液(4.0 ng / mLヒトインスリン)で肝臓をさらに30分間灌流します。.
11. 下大静脈チューブからすべてのサンプルを2分ごとに収集します。
12. 灌流後の肝臓の重量を記録します。さまざまなローブから肝臓サンプルを採取し、すぐに液体窒素で凍結し、-80°Cに移して保存します。
13. 収集したすべての灌流サンプルを~1,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。 上清を採取し、-80°Cに移して保存します。
    注:灌流サンプル中のインスリン濃度は、ヒトインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを使用して測定されます。
14. 処置後、すべての生物学的廃棄物が安全規制に従って処分されていることを確認してください。

4. データ分析

1. 時間の経過に伴うインスリン濃度の出力を示すXYグラフでデータを表示します。
2. 次の式を使用して、平均肝インスリンクリアランス率(HICR_AVE)を計算します。
   HICR_平均= (1−C_f / C_i)×100%
   ここで、C_i = 輸液バッファーの初期インスリン濃度、C_f = 下大静脈上からの最後の 10 分間の最終平均インスリン濃度。

このプロトコルは、肝臓のインスリンクリアランスを直接計算するための肝臓注入の手順を概説しています。このモデルは信頼性が高く、再現性があります。実験から得られた結果の例を 図 3 に示します。10分間の平衡化期間の後、4.0 ng/mLのヒトインスリンを添加したKRBHバッファーを門脈から30分間灌流しました。下肝上大静脈のカテーテルから灌流液を2分間隔で採取し、灌流液中のヒトインスリン濃度を測定した。結果は、SEM±平均として本明細書に示される。対照食(CD)を投与されたマウスと高脂肪食(HFD)を投与されたマウスを比較した肝臓灌流実験の例を 図3に示します。肝インスリンクリアランス率(HICR_AVE)は、CD群で55.57%±4.43%、HFD群で25.37%±6.83%でした(図3B)。結果は、高脂肪摂食がインスリンクリアランスの障害につながることを示しています。

灌流後、ヘマトキシリンとエオシン(HE)の染色と全スライドスキャンのために肝臓サンプルを採取しました。正常なマウスから、十分に灌流された肝臓、灌流が不十分な肝臓、および対照の肝臓サンプルを採取しました。より良い灌流条件下では、肝臓組織の構造は正常であり、肝索は放射状にきれいに配置され、肝細胞は無傷の形状であり、細胞質は均一に染色され、核は明確で丸く、正常な肝臓のそれとほとんど区別がつかないほどでした(図4A、B)。灌流が不十分な場合、肝細胞は浮腫性で著しく緩んでおり、中心静脈の周りの点状壊死、細胞質の液胞変性、核のピクノーシス、および血管剥離が見られました(図4C)。灌流液中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)のレベルをベースライン時および灌流後に測定し、肝細胞機能を評価しました。その結果、ALTレベルとASTレベルに有意差はなかった(図4D)。

図1:灌流システムのコンポーネント。 灌流システムは、輸液ポンプ、温度制御ユニット、酸素供給器などの主要コンポーネントで構成されています。可変温度装置は灌流液を37°Cに維持し、膜型人工肺はポリプロピレン中空糸を使用して効果的なガス交換を行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:解剖学的位置とカテーテル法。 (A,B)門脈と下大静脈の解剖学的位置を示しています。(C)門脈カテーテルは、左右の肝枝への分岐部のすぐ下に配置され、肝内下大静脈に血管クランプが適用されます。(D)カテーテルを上肝下大静脈に挿入し、肝臓の上縁近くに配置します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:肝臓灌流実験結果。対照食(CD)を摂取したマウスと高脂肪食(HFD)を摂取したマウスを比較した肝臓灌流実験の結果。(A)CDマウス(青、n = 7)とHFDマウス(赤、n = 5)の肝臓灌流中のインスリン濃度。(B)平均肝インスリンクリアランス率(HICR_AVE)。±統計的有意性は、対応のない t 検定を使用して分析した CD マウスの *p < 0.05、**p < 0.01 として示されます。この結果は、高脂肪の摂食がインスリンクリアランスの障害につながることを示唆しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:灌流が肝臓の組織学と機能に及ぼす影響(A)マウスの正常な肝臓の形態(コントロール)。(B)強化された灌流条件下での肝臓の形態。(C)最適でない灌流条件下での肝臓の形態。赤い矢印は血管の剥離を示し、黒い矢印は空胞化を示し、緑の矢印は核のピクノーシスを強調しています。倍率:40倍 (D)灌流中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)のレベル、ベースライン時および灌流後に測定。対応のあるt検定法が分析に採用されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコルの重要なステップ
上記の外科的処置は、肝臓に病変を生じさせないように、穏やかな注意を払って行う必要があります。さらに、肝静脈血管壁の脆弱な構造により、カニューレ挿入中に注意して取り扱わないと、穿刺やその後の出血に対して脆弱になります。このプロトコルでは、血管への損傷を最小限に抑えるために、より柔らかいシリコンチューブが使用されています。カテーテル挿入は、挿管の成功率を高め、処置の期間を最小限に抑えるために頻繁に練習する必要がある経験豊富な外科医によって行われることをお勧めします。

手術野は、肝細胞の生存率を維持するために、時々温かい生理食塩水で灌漑する必要があります。灌流中、手術領域は滅菌ガーゼまたは綿で保護する必要があります。この方法により、肝細胞の機能を損なう可能性のある空気への長時間の曝露を防ぐことができます。

課題と解決策
カテーテルの先端は、門脈が左右の肝門脈に分岐する点の直前に配置することが重要です。カテーテルを深く挿入しすぎると、肝葉間に不均一な灌流が生じることがあります。さらに、気泡は肝臓に空気塞栓症を誘発する可能性があるため、注入プロセス中に慎重に回避する必要があります。これは、肝細胞に到達する体液の灌流に大きな影響を与え、その後インスリンクリアランスに影響を与える可能性があります。

KHバッファー注入の最初の10分間は平衡期間を構成し、その間、灌流を毎回1〜2回2分間中断して、残留血球を肝臓の正弦波にできるだけ洗い流すことができます。15分間の連続灌流後に採取した標本に血液が観察された場合、これは肝臓の下大静脈の血管鉗子が適切に配置されていないことを示している可能性があり、チェックする必要があります¹⁹。注入を一時停止すると、肝正弦波に血液細胞が残っているため、注入を再開したときに採取した検体に赤血球が現れることがあります。赤血球は、インスリン測定の前に遠心分離 によって 分離する必要があります。これらの細胞内にインスリン分解酵素が存在すると、インスリンレベルに影響を与える可能性があるためです。

外科的カテーテル法の期間、肝虚血再灌流時間、および灌流中に門脈に入るガスの量はすべて、肝細胞の機能、したがって肝臓によるインスリンクリアランスの速度に影響を与える可能性があります。肝機能障害の程度は、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、アルカリホスファターゼ(ALP)の含有量を測定するだけでなく、H&E染色によってもモニターできます。研究によると、手術が成功した後、肝臓は少なくとも3時間¹⁹の間機能し、反応し続けます。

マウス肝臓灌流の重要性と潜在的な応用
マウスは、ヒトとの遺伝的類似性、短い生殖周期、および高度な遺伝子工学ツールの利用可能性のために、理想的な研究対象である²⁰。マウスモデルでは、インスリンクリアランスはいくつかの方法を使用して評価できます。腹腔内ブドウ糖負荷試験 (IPGTT) では、肝臓のインスリンクリアランスは、C-ペプチドとインスリン²¹ の曲線下面積 (AUC) (台形法で計算) の比率として測定されます。正常血糖-高インスリン血症クランプの間、外因性インスリン注入速度と結果として生じる定常状態の血漿インスリン濃度との間の比は、間接的にインスリンクリアランスを推定する方法として使用できる²²。ただし、これらの方法はすべて間接的に肝臓のインスリンクリアランスを評価します。

一部の研究者は、細胞ベースのアッセイを使用してインスリンの分解を評価することもあります。マウスのHepG2細胞または初代肝細胞を培養プレートに播種し、適量濃度のヒトインスリンを添加します。培地のサンプルを特定の間隔で収集して、ヒトインスリン濃度を測定し、その経時的な分解を評価する¹⁷。このプロトコルでは、マウスにおけるユーザーフレンドリーな in situ 肝灌流手順が、肝臓のインスリンクリアランス率を直接評価するための説明されています。単離された肝細胞を用いたin vitro研究と比較して、肝灌流には、肝臓の構造、帯状分裂、極性、および血管の完全性を維持するという利点があります。

マウス肝臓灌流システムは、肝臓のインスリン代謝の動態と分子メカニズムを調査するための貴重なツールです。さらに、このプロトコルは、誘発前の疾患モデルだけでなく、急性負荷刺激試験にも広く使用できる可能性があります。ただし、この手法は 、その場で実行する必要があるという点で制限があります。このプロトコルには、損傷を最小限に抑え、肝臓の解剖学的完全性を可能な限り維持する修正された外科的カテーテル法が含まれます。この技術を最大限に活用して、特にインスリン抵抗性に関連する代謝性疾患におけるインスリンクリアランスのメカニズムを解明するためには、さらなる努力が必要です。

利益相反は宣言されていません。

この研究は、中国国家自然科学基金会(82200948、82270921、82170882)の支援を受けました。