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ここでは、マウスにラウンド精子細胞注入法(ROSI)を行う方法を紹介します。これは、臨床応用が期待され、胚発生のメカニズムを調べるための有用性を持つ技術です。
一倍体の遺伝的内容を特徴とする丸い精子細胞は、成熟した精子の前駆細胞を表しています。円形精子細胞注射(ROSI)の革新的な技術により、卵子をうまく受精させ、生存可能な胎児に成長させることができます。1995年に達成された画期的なマイルストーンとして、ROSI技術によって最初のマウス胎児が誕生しました。それ以来、ROSIは、胚発生を支配する複雑なメカニズムを解明するための極めて重要なツールとして浮上し、マウス生成の加速や遺伝子改変マウスの作製など、さまざまなアプリケーションで大きな可能性を秘めています。1996年、ROSI技術を通じて最初のヒト胎児が誕生し、大きな節目を迎えました。しかし、この方法の臨床応用では、成功と失敗の変動パターンが示されています。今日まで、ROSIテクノロジーは、主に出生効率が低く、胎児の安全性の検証が不十分であるため、臨床診療で広く適用されていません。この記事では、マウスでROSIを実行する正確な方法の包括的な説明を提供し、基礎研究とその潜在的な臨床応用に新たな光を当てることを目的としています。
精子形成の最終段階は、丸い精子細胞が、明確な頭、首、および細長い尾の構造を特徴とする完全に発達した精子に変換することを含みます1。この形質転換は、核内のクロマチンの凝縮、ヒストンのプロタミンによる置換、アクロソーム形成、ミトコンドリア鞘の発達、中心小体の移動と損失、尾部構造の形成、細胞残基の除去など、細胞形態の大幅な変化を包含しています2。
1992年、ICSI(Sci)技術により、ヒト初の胎児の誕生に成功しました3。それ以来、研究者たちは、成熟した精子と同じ一倍体の遺伝的組成を共有する円形の精子細胞を利用して、卵子を受精させ、生存可能な妊娠を維持する可能性を探求してきました2,4。その後、1996年に、丸型精子細胞注入(ROSI)技術によって妊娠した最初のヒト胎児が出産されました5,6。マウスのICSIとROSIを含む研究は、マウスの卵子膜が注射プロセス中に損傷を受けやすいため、ヒトの研究よりも遅れていたことは注目に値します。この問題は、ピエゾ膜破砕装置の導入により解決に成功しました。その結果、1995年にROSI技術によって考案された最初のマウスが誕生しました。さらに、他のさまざまな動物におけるROSIの研究も進行中です7,8。
現在、ROSIの研究は、臨床応用、メカニズムの解明、開発効率を高めるための戦略、およびROSI技術の広範な応用を中心に研究されています。臨床応用の文脈では、1996年にROSIを通じて最初のROSIヒト胎児が誕生したにもかかわらず、進歩は一連の成功と失敗によって特徴づけられてきた9,10,11,12。これまで、ROSI技術は、その効率の低さや、ROSI技術を通じて考案された胎児の安全性に関するさらなる検証が必要であることが主な理由として、広範な臨床実装には至っていません。不完全な統計によると、世界的には、ROSIが妊娠したヒトの胎児は200人未満しか分娩されていません。ROSI技術の可能性を理解する転機となったのは、2015年に田中らがROSI技術を通じて14人の胎児が誕生したことを報告し、その臨床応用と実現可能性に新たな自信を植え付けたことでした13,14。ROSI技術は、特に非閉塞性無精子症患者における生殖生物学の課題に対処するために大きな期待を寄せています。その臨床応用に加えて、ROSIは、胚発生の複雑なメカニズムを研究するための貴重なツールとして機能します15,16,17。
完全な胚発生を達成する際のROSIの低効率に寄与する根本的な要因を調査するために、数多くの動物実験が行われてきました。これらの要因には、補助卵子活性化(AOA)法の選択とそのタイミング、ゲノム安定性の異常、特にエピジェネティックな修飾の異常が含まれます。丸い精子細胞は未熟な生殖細胞であり、さまざまな生理学的側面で成熟した精子とは大きく異なることを認識することが重要です。今回、坂本瑞樹たちの研究グループは、丸型精子細胞に由来するH3K27me3が、ROSI胚18の遺伝子発現障害につながる、アクセスしにくいクロマチンと関連していることを明らかにした。Jing Wangたちの研究グループは、これに関連して、前核期のROSI胚のリプログラミング欠損が、主にマイナーな接合子ゲノム活性化に関与する遺伝子のコホートの誤発現と関連していた19。また、選択的ユークロマティックヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ2阻害剤であるA366を導入すると、全体の発生速度が約2倍向上する可能性があることもわかりました。
マウスは、胚発生を研究するための最も貴重なモデル動物の1つとして立っています。この記事では、マウスでROSIを実行する方法について詳しく説明します。この包括的なプロトコルには、適切なマウスの選択、詳細な排卵誘発手順、AOA技術、注射技術、および代理マウスの準備が含まれます。さらに、出生効率に対する 2 つの注射レジメンの影響の比較分析を提示します: AOA とそれに続く ROSI (A-ROSI; 最初のレジメン) と ROSI とそれに続く AOA (ROSI-A; 2 番目のレジメン)。私たちは、研究者がマウスROSI実験をより精度よく行うことを奨励し、彼らの臨床応用と胚発生メカニズムの基礎研究をより強力にサポートすることを目指しています。
本実験で使用したB6D2F1(C57BL/6 x DBA/2)、C57BL/6、ICRマウスは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd.(中国・北京市)から購入しました。すべての動物治療は、吉林大学第一病院実験動物倫理委員会が承認した実験手順と基準を遵守していました(承認番号:20200435)。
1. 関連試薬の調製
2. 卵子の調製
3.丸い精子細胞と精子の調製
4. ラウンド精子細胞注射(ROSI)
5. ICSI(顕微授精)
6. 卵子活性化補助(AOA)
7. 胚移植
8. 統計分析
まず、AOAが胚の発生能力に及ぼす影響を調べることから研究を開始しました。実験計画の概略図を 図1Aに示します。精子注入の前に、卵母細胞はAOA(A-ICSI)または未治療(ICSI)のいずれかを受けました。胚発生に関する詳細なデータを 表1に示します。その結果、A-ICSI群とICSI群の間で、卵割率、胚盤胞率、出生率に有意差は認められなかった(P > 0.05; 図1B)。これらの知見は、10 mM SrCl2 を20分間使用したAOAが胚の発生能に影響を与えなかったことを示している。
以前に報告されたのは、FACSによって選択されたROSI胚の発生効率または顕微鏡下での直接目視検査によって選択されたROSI胚の発生効率に識別可能な違いはなかった22。私たちの実験では、FACS技術を用いてRSを同定しました(図2A、B)。顕微鏡下では、マウスの丸い精子細胞の直径は約10μmで、中央に突起状の核小体構造を示しました(図2C)。FACSによる選択は、顕微鏡下での直接目視検査よりも正確であると仮定しています。さらに、文献は、形態学的な違いを通じてRSを直接調査することを支持しています。ROSI胚は、ラウンド精子細胞注入前に卵子をAOAにさらすA-ROSIグループと、ラウンド精細胞注入後に卵子をAOAにさらすROSI-Aグループという2つの異なる方法を使用して作製しました。実験計画の概略図を 図1Cに示します。特に、A-ROSI、ROSI-A、およびICSIグループ間で、切断率と胚盤胞率に有意差は見られませんでした(P > 0.05; 図1D)。A-ROSI、ROSI-A、およびICSI群の胚盤胞率は、活性化群の胚盤胞率よりも有意に高かった(P < 0.05; 図1D)。しかし、ROSI群の出生率は、卵子が注射前または注射後に活性化されたかどうかに関係なく、ICSI群の出生率よりも低かった(P < 0.05; 図1D)。重要なことに、A-ROSIグループの出生率はROSI-Aグループの出生率よりもわずかに高かった(図1D)。胚発生データの詳細については、 表1に示します。
図1:ROSI胚は、ICSI胚と比較して発生効率が低下した (A)ICSI胚発生に対する活性化の影響を評価する実験プロトコルの概略図。青 = 卵子は活性化されていません。黄色 = 卵子が活性化されました。(B)A-ICSIおよびICSIに由来する胚の発生効率。(C)異なる種類の胚を生成するための実験プロトコルの概略図。(D)A-ROSI、ROSI-A、A、およびICSIに由来する胚の発生効率。**、 P < 0.01。略語:A =活性化E =胚の日;ROSI=円形精子細胞注射;ICSI=細胞質内精子注入。エラーバーは標準偏差を示します。レートの比較は、カイ2乗検定を使用して行われます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:丸型精子細胞は、フローサイトメトリーソーティングにより選択されました。 (A)ラウンド精子細胞の選択には、フローサイトメトリーソーティングダイアグラムを使用しました。(B)丸い精子細胞の選択を示す代表的な画像。スケールバー:10μm。略語:FSC =前方散乱;SSC = 側方散乱;355は励起波長です。460/50と670/30は、355波長レーザーの2つの検出チャンネルです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
グループ | 着床前開発 | 着床後の開発 | |||
複製 | 劈開率(%) | 胚盤胞率(%) | 2細胞胚移植/ No.受取人の数 | 出生率(%) | |
A-顕微精 | 5 | 99.33 (149/150) | 75.17 (112/149) | 49/5 | 48.98 (24/49) |
A-ロシ | 5 | 99.33 (149/150) | 73.83 (110/149) | 44/5 | 18.18 (8/44) ** |
ロジA | 5 | 98.00 (147/150) | 64.63 (95/147) | 45/5 | 13.33 (6/45) ** |
アクティベーション | 5 | 100.00 (150/150) | 12.00 (18/150) ** | 51/5 | 0.00 (0/51) ** |
ICSIの | 5 | 98.00 (147/150) | 73.47 (108/147) | 46/5 | 52.17 (24/46) |
テーブル 1. 異なるグループに由来する胚の発生効率。
補足表1。 フローサイトメトリーでソートされた異なる細胞集団の割合。P3部分は丸い精子細胞です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
卵子活性化の補助
ROSIの重要な前提条件は、丸い精子細胞だけでは卵子の活性化を開始できないため、AOAです。現在、マウスで最も確立された方法は塩化ストロンチウムの使用を含みます23,24、最も進んだヒトへの応用は電気的活性化13,14を採用しています。卵子が活性化するタイミングも非常に重要です。文献で報告されているように、マウスにおける最適な活性化アプローチは、最初に卵子を活性化し、次に丸い精子細胞を注入することを含みます25。これは、精子が最初に卵子に入り、その後ホスホリパーゼC ζ放出して卵子を活性化する従来の受精プロセスとは対照的である26。岸上聡氏らが行った専門的な研究では、ROSIが活性化前または活性化後の卵子で男性核を形成する能力が異なることが強調されています。効率的な子孫生産率を達成するためには、卵子がG1フェーズ25に入る前に、両方の注入タイプを実施する必要があります。
注射針の直径
ROSIの文脈では、注射針の直径が大きいほど必ずしも良い結果につながるとは限らないことに注意することが重要です。使用される注射針は直径が6〜7μmで、丸い精子細胞よりもわずかに小さいです。したがって、丸い精子細胞を吸引すると、細胞膜は圧迫効果を受け、核が直接露出する可能性があります。この直接曝露は、解重合およびその後の雄性前核の形成を助長し得る27。
シーリング処理
マウス卵母細胞は、他の種と比較して細胞質粘度が低くなります。細胞膜がわずかに裂けるだけでも、細胞質が容易に流出し、卵子の変性を引き起こす可能性があります28。リスクを軽減するために、丸い精子細胞を卵子細胞質に注入し、注射針を抜いた後、ICSI21の手順と同様に、卵子細胞膜の開口部近くの細胞膜の小さな部分を吸引して空間を密閉することが不可欠です。このシーリングプロセスにより、卵子の変性のリスクが大幅に減少します。
モデルとしてのROSIの適用
臨床応用以外にも、ROSI技術にはモデルとしてさまざまな応用があります。それは、マウスの生成を29倍促進し、マウスの父方遺伝のXist欠失に起因する女性の致死性を救い17、一倍体単為生殖2細胞割球への円形精子細胞注射後のマウス15を生成し、トランスジェニックマウスの子孫16を生成し、癌治療30,31の前に思春期の子供の生殖能力を維持することができます。.マウスROSIの入念な研究は、リプロダクティブヘルス研究の進歩に大きく貢献することができます。
記事の制限事項
この記事は、顕微鏡下での注射用のRSの直接比較選択がないことや、イノベーションの欠如が認識されていることなど、いくつかの制限がある方法論のガイドとして機能します。
著者は、金銭的またはその他の利益の対立を宣言しません。
フローサイトメトリーによる丸型精子細胞の選別に貴重なご協力をいただいたWenjie Zhao氏と、マウス胚移植の専門知識を提供してくださったFang Wang氏に感謝いたします。この研究は、吉林省自然科学基金会(No.YDZJ202301ZYTS461)。原稿の言語編集と校正に携わったBullet Edits Limitedに感謝します。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CaCl22H2O | Sigma | C7902 | Preparation of CZB |
Glucose | Sigma | G6152 | Preparation of CZB |
HEPES-Na (basic) | Sigma | H3784 | Preparation of CZB |
Hoechst 33342 | Beyotime | C1025 | FACS |
human chorionic gonadotropin (HCG) | Ningbo Second Hormone Company | HCG | Ovulation promoting drugs |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | Removing granulosa cells around the oocyte |
KCl | Sigma | P5405 | Preparation of CZB |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | Preparation of CZB |
KSOMaa | Caisson Labs | IVL04-100ML | Potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids |
L-glutamine | Sigma | G8540 | Preparation of CZB |
M2 | Sigma | M7167-50ML | Operating fluid |
MgSO47H2O | Sigma | M1880 | Preparation of CZB |
Na2-EDTA2H2O | Sigma | E5134 | Preparation of CZB |
NaCl | Sigma | S5886 | Preparation of CZB |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Preparation of CZB |
Na-lactate 60% syrup d = 1.32 g/L | Sigma | L7900 | Preparation of CZB |
Na-pyruvate | Sigma | P4562 | Preparation of CZB |
Piezo drill tips (ICSI) | Eppendorf | piezoXpert | Piezoelectric membrane rupture |
pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Ningbo Second Hormone Company | PMSG | Ovulation promoting drugs |
PVA | Sigma | P8136 | Preparation of CZB |
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