Method Article
Qui, introduciamo un metodo per eseguire l'iniezione di spermatide rotondo (ROSI) nei topi, una tecnica con promettenti applicazioni cliniche e utilità per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo embrionale.
Gli spermatidi rotondi, caratterizzati dal loro contenuto genetico aploide, rappresentano le cellule precursori degli spermatozoi maturi. Attraverso l'innovativa tecnica dell'iniezione di spermatidi rotondi (ROSI), gli ovociti possono essere fecondati con successo e sviluppati in feti vitali. Con un traguardo rivoluzionario raggiunto nel 1995, è nato il primo feto di topo attraverso la tecnologia ROSI. Da allora ROSI è emerso come uno strumento fondamentale per svelare gli intricati meccanismi che regolano lo sviluppo embrionale e ha un potenziale significativo in varie applicazioni, tra cui l'accelerazione della generazione di topi e la produzione di topi geneticamente modificati. Nel 1996 è stata raggiunta una pietra miliare quando è nato il primo feto umano attraverso la tecnologia ROSI. Tuttavia, le applicazioni cliniche di questo metodo hanno mostrato un modello fluttuante di successo e fallimento. Ad oggi, la tecnologia ROSI non ha trovato un'applicazione diffusa nella pratica clinica, principalmente a causa della sua bassa efficienza alla nascita e dell'insufficiente convalida della sicurezza fetale. Questo articolo fornisce un resoconto completo dei metodi precisi per eseguire il ROSI nei topi, con l'obiettivo di gettare nuova luce sulla ricerca di base e sulle sue potenziali applicazioni cliniche.
La fase finale della spermatogenesi prevede la trasformazione di uno spermatide rotondo in uno spermatozoo completamente sviluppato, caratterizzato da strutture distinte della testa, del collo e della coda allungate1. Questa trasformazione comprende cambiamenti significativi nella morfologia cellulare, come la condensazione della cromatina nel nucleo, la sostituzione degli istoni con la protamina, la formazione di acrosomi, lo sviluppo della guaina mitocondriale, la migrazione e la perdita del centriolo, la formazione della struttura della coda e la rimozione dei residui cellulari2.
Nel 1992, il primo feto umano è nato con successo attraverso la tecnologia dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)3. Da allora, i ricercatori hanno esplorato il potenziale dell'utilizzo di spermatidi rotondi, che condividono la stessa composizione genetica aploide degli spermatozoi maturi, per fecondare gli ovociti e sostenere gravidanze vitali 2,4. Successivamente, nel 1996, è stato partorito il primo feto umano concepito con la tecnologia dell'iniezione di spermatidi rotondi (ROSI) 5,6. Vale la pena notare che gli studi che coinvolgono ICSI e ROSI nei topi sono rimasti indietro rispetto a quelli nell'uomo a causa della suscettibilità della membrana degli ovociti del topo ai danni durante il processo di iniezione. Questo problema è stato risolto con successo con l'introduzione del dispositivo piezoelettrico di rottura della membrana. Di conseguenza, nel 1995, è nato il primo mouse concepito attraverso la tecnologia ROSI. Inoltre, sono in corso anche ricerche sui ROSI in vari altri animali 7,8.
Attualmente, la ricerca sui ROSI si concentra principalmente sui seguenti aspetti: applicazione clinica, chiarimento dei meccanismi e strategie per migliorare l'efficienza dello sviluppo, insieme ad applicazioni più ampie della tecnologia ROSI. Nell'ambito delle applicazioni cliniche, nonostante la nascita del primo feto umano ROSI attraverso ROSI nel 1996, i progressi sono stati segnati da una serie di successi e fallimenti 9,10,11,12. Ad oggi, la tecnologia ROSI non ha raggiunto un'implementazione clinica diffusa, in gran parte a causa della sua bassa efficienza e della necessità di ulteriori validazioni per quanto riguarda la sicurezza dei feti concepiti attraverso la tecnologia ROSI. Statistiche incomplete indicano che a livello globale sono stati partoriti meno di 200 feti umani concepiti con ROSI. Un punto di svolta nella comprensione del potenziale della tecnologia ROSI si è verificato nel 2015, quando Tanaka e colleghi hanno riferito del successo della nascita di 14 feti attraverso la tecnologia ROSI, infondendo rinnovata fiducia nella sua applicazione clinica e fattibilità13,14. La tecnologia ROSI è molto promettente per affrontare le sfide della biologia riproduttiva, in particolare nei pazienti con azoospermia non ostruttiva. Oltre alle sue applicazioni cliniche, ROSI funge da strumento prezioso per studiare gli intricati meccanismi dello sviluppo embrionale 15,16,17.
Sono stati condotti numerosi studi sugli animali per indagare i fattori sottostanti che contribuiscono alla bassa efficienza dei ROSI nel raggiungere il pieno sviluppo embrionale. Questi fattori comprendono la scelta dei metodi di attivazione assistita degli ovociti (AOA) e i loro tempi, le anomalie nella stabilità genomica e, in particolare, le anomalie nelle modificazioni epigenetiche. È importante riconoscere che gli spermatidi rotondi sono cellule germinali immature, che differiscono in modo significativo dagli spermatozoi maturi in vari aspetti fisiologici. Mizuki Sakamoto e colleghi hanno indicato che H3K27me3, derivato da spermatidi rotondi, è associato alla cromatina che è meno accessibile e porta a una ridotta espressione genica negli embrioni ROSI18. In uno studio correlato di Jing Wang e colleghi, i difetti di riprogrammazione negli embrioni ROSI negli stadi pronucleari erano prevalentemente associati alla mancata espressione di una coorte di geni responsabili dell'attivazione minore del genoma zigotico19. Hanno anche scoperto che l'introduzione di un inibitore selettivo eucromatico dell'istone lisina metiltransferasi 2, A366, potrebbe potenzialmente aumentare il tasso di sviluppo complessivo di circa il doppio.
Il topo è uno degli animali modello più preziosi per lo studio dello sviluppo embrionale. Questo articolo approfondisce come eseguire il ROSI sui topi. Questo protocollo completo comprende la selezione di topi adatti, procedure dettagliate di induzione dell'ovulazione, tecniche AOA, tecniche di iniezione e la preparazione di topi surrogati. Inoltre, presentiamo un'analisi comparativa degli effetti di due regimi iniettivi sull'efficienza del parto: AOA seguito da ROSI (A-ROSI; primo regime) e ROSI seguito da AOA (ROSI-A; secondo regime). Il nostro obiettivo è incoraggiare i ricercatori a condurre esperimenti ROSI sui topi con maggiore precisione, offrendo un supporto più robusto per la loro applicazione clinica e la ricerca fondamentale sui meccanismi di sviluppo embrionale.
I topi B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 e ICR utilizzati in questo esperimento sono stati acquistati da Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Pechino, Cina). Tutti i trattamenti sugli animali hanno aderito alle procedure sperimentali e agli standard approvati dal Comitato Etico per gli Animali Sperimentali del Primo Ospedale dell'Università di Jilin (numero di approvazione: 20200435).
1. Preparazione dei reagenti pertinenti
2. Preparazione degli ovociti
3. Preparazione di spermatidi rotondi e spermatozoi
4. Iniezione di spermatidi rotondi (ROSI)
5. Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)
6. Attivazione assistita degli ovociti (AOA)
7. Trasferimento di embrioni
8. Analisi statistica
Abbiamo iniziato la nostra indagine esaminando l'effetto dell'AOA sulla capacità di sviluppo degli embrioni. Un'illustrazione schematica del disegno sperimentale è mostrata nella Figura 1A. Prima dell'iniezione dello spermatozoo, gli ovociti sono stati sottoposti ad AOA (A-ICSI) o non sono stati trattati (ICSI). I dati dettagliati sullo sviluppo embrionale sono presentati nella Tabella 1. I risultati non hanno rivelato differenze significative nella scissione, nella blastocisti o nei tassi di natalità tra i gruppi A-ICSI e ICSI (P > 0,05; Figura 1B). Questi risultati indicano che l'AOA con 10 mM di SrCl2 per 20 minuti non ha influenzato il potenziale di sviluppo degli embrioni.
In precedenza era stato riportato che non vi erano differenze percepibili nell'efficienza dello sviluppo degli embrioni ROSI selezionati mediante FACS o mediante esame visivo diretto al microscopio22. I nostri esperimenti hanno utilizzato la tecnologia FACS per identificare RS (Figure 2A, B). Al microscopio, gli spermatidi rotondi di topo avevano un diametro di circa 10 μm e mostravano una struttura nucleolica simile a una sporgenza al centro (Figura 2C). Ipotizziamo che la selezione attraverso la FACS sia più accurata dell'esame visivo diretto al microscopio. Inoltre, la letteratura supporta l'esplorazione diretta della RS attraverso le differenze morfologiche. Gli embrioni ROSI sono stati generati utilizzando due metodi distinti: il gruppo A-ROSI, in cui gli ovociti sono stati sottoposti ad AOA prima dell'iniezione di spermatide rotondo, e il gruppo ROSI-A, in cui gli ovociti sono stati sottoposti ad AOA dopo l'iniezione di spermatide rotondo. Il diagramma schematico del disegno sperimentale è mostrato nella Figura 1C. In particolare, non sono state riscontrate differenze significative nei tassi di clivaggio e blastocisti tra i gruppi A-ROSI, ROSI-A e ICSI (P > 0,05; Figura 1D). I tassi di blastocisti dei gruppi A-ROSI, ROSI-A e ICSI erano significativamente più alti di quelli del gruppo di attivazione (P < 0,05; Figura 1D). Tuttavia, il tasso di natalità del gruppo ROSI era inferiore a quello del gruppo ICSI, indipendentemente dal fatto che gli ovociti fossero attivati prima o dopo l'iniezione (P < 0,05; Figura 1D). È importante sottolineare che il tasso di natalità del gruppo A-ROSI era leggermente superiore a quello del gruppo ROSI-A (Figura 1D). Ulteriori dettagli sui dati sullo sviluppo embrionale sono presentati nella Tabella 1.
Figura 1: Gli embrioni ROSI hanno mostrato una ridotta efficienza di sviluppo rispetto agli embrioni ICSI. (A) Illustrazione schematica del protocollo sperimentale che valuta l'effetto dell'attivazione sullo sviluppo embrionale dell'ICSI. Blu = Gli ovociti non sono stati attivati; Giallo = Gli ovociti sono stati attivati. (B) Efficienza dello sviluppo degli embrioni derivati da A-ICSI e ICSI. (C) Illustrazione schematica del protocollo sperimentale per la generazione di diversi tipi di embrioni. (D) Efficienza dello sviluppo degli embrioni derivati da A-ROSI, ROSI-A, A e ICSI. **, P < 0,01. Abbreviazioni: A= Attivazione E= Giorno embrionale; ROSI= Iniezione di spermatide rotondo; ICSI= Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi. Le barre di errore mostrano la deviazione standard. Il confronto dei tassi viene condotto utilizzando il test del chi-quadrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli spermatidi rotondi sono stati selezionati tramite smistamento citofluorimetrico. (A) Per la selezione degli spermatidi rotondi è stato utilizzato un diagramma di smistamento citofluorimetrico. (B) Immagini rappresentative che mostrino la selezione di spermatidi rotondi. Barra di scala: 10 μm. Abbreviazioni: FSC = Forward scatter; SSC = dispersione laterale; 355 è la lunghezza d'onda di eccitazione; 460/50 e 670/30 sono due canali di rilevamento sotto laser a 355 lunghezze d'onda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Gruppi | Sviluppo preimpianto | Sviluppo post-impianto | |||
Replica | Tasso di scissione (%) | Tasso di blastocisti (%) | Embrioni a 2 cellule trasferiti/ N. dei destinatari | Tasso di natalità (%) | |
A-ICSI | 5 | 99.33 (149/150) | 75.17 (112/149) | 49/5 | 48.98 (24/49) |
A-ROSI | 5 | 99.33 (149/150) | 73.83 (110/149) | 44/5 | 18.18 (8/44) ** |
ROSI-A | 5 | 98.00 (147/150) | 64.63 (95/147) | 45/5 | 13.33 (6/45) ** |
Attivazione | 5 | 100.00 (150/150) | 12.00 (18/150) ** | 51/5 | 0.00 (0/51) ** |
ICSI | 5 | 98.00 (147/150) | 73.47 (108/147) | 46/5 | 52.17 (24/46) |
Tabella 1. L'efficienza dello sviluppo di embrioni derivati da gruppi diversi.
Tabella supplementare 1. La proporzione di diverse popolazioni cellulari ordinate mediante citometria a flusso. La parte P3 è costituita da spermatidi rotondi. Clicca qui per scaricare questo file.
Attivazione assistita degli ovociti
Un prerequisito fondamentale per ROSI è l'AOA, poiché gli spermatidi rotondi da soli non possono avviare l'attivazione degli ovociti. Attualmente, il metodo più consolidato nei topi prevede l'uso di cloruro di stronzio23,24, mentre l'applicazione umana più avanzata impiega l'attivazione elettrica13,14. Anche la tempistica dell'attivazione degli ovociti è di grande importanza. Come riportato in letteratura, l'approccio di attivazione più ottimale nei topi prevede l'attivazione iniziale dell'ovocita e poi l'iniezione dello spermatide rotondo25. Ciò contrasta con il processo di fecondazione convenzionale, in cui gli spermatozoi entrano inizialmente negli ovociti, rilasciando successivamente la fosfolipasi C ζ per attivare l'ovocita26. La ricerca specializzata condotta da Satoshi Kishigami e colleghi sottolinea la capacità differenziale dei ROSI di formare un nucleo maschile negli ovociti pre o post-attivati. Per ottenere un tasso di produzione efficiente della prole, entrambi i tipi di iniezione devono essere effettuati prima che gli ovociti entrino nella faseG1 25.
Il diametro dell'ago per iniezione
Nel contesto della ROSI, è importante notare che un diametro maggiore dell'ago per iniezione non si traduce necessariamente in risultati migliori. L'ago per iniezione utilizzato ha un diametro di 6-7 μm, leggermente più piccolo di uno spermatide rotondo. Pertanto, quando uno spermatide rotondo viene aspirato, la membrana cellulare è sottoposta a un effetto di compressione, che può portare all'esposizione diretta del nucleo. Questa esposizione diretta può favorire la depolimerizzazione e la successiva formazione del pronucleo maschile27.
Trattamento di sigillatura
Gli ovociti di topo mostrano una viscosità citoplasmatica inferiore rispetto ad altre specie. Anche una piccola breccia nella membrana cellulare può causare la fuoriuscita del citoplasma, con conseguente degenerazione degli ovociti28. Per mitigare il rischio, dopo aver iniettato lo spermatide rotondo nel citoplasma dell'ovocita e aver ritirato l'ago per iniezione, è imperativo aspirare una piccola porzione della membrana cellulare vicino all'apertura della membrana cellulare dell'ovocita per sigillare lo spazio, in modo simile alla procedura in ICSI21. Questo processo di sigillatura riduce significativamente il rischio di degenerazione degli ovociti.
Applicazione del ROSI come modello
Oltre alle applicazioni cliniche, la tecnologia ROSI ha varie altre applicazioni come modello. Può accelerare la generazione dei topi29, salvare la letalità femminile derivante da una delezione Xist ereditata dal padre nei topi17, generare topi dopo l'iniezione di spermatidi rotondi in blastomeri partenogenetici aploidi a due cellule15, generare prole di topo transgenico16 e preservare la fertilità nei bambini adolescenti prima del trattamento del cancro30,31. Una ricerca diligente sul ROSI del topo può contribuire in modo sostanziale ai progressi nella ricerca sulla salute riproduttiva.
Limitazioni dell'articolo
Questo articolo funge da guida metodologica con diverse limitazioni, tra cui l'assenza di una selezione comparativa diretta di RS al microscopio per iniezione e una percepita mancanza di innovazione.
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi finanziari o di altro tipo.
Estendiamo la nostra gratitudine a Wenjie Zhao per la sua inestimabile assistenza nello smistamento degli spermatidi rotondi attraverso la citometria a flusso e a Fang Wang per la sua esperienza nel trasferimento di embrioni di topo. Questo lavoro ha ricevuto un sostegno parziale dalla Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Jilin (n. YDZJ202301ZYTS461). Ringraziamo Bullet Edits Limited per l'editing linguistico e la correzione di bozze del manoscritto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CaCl22H2O | Sigma | C7902 | Preparation of CZB |
Glucose | Sigma | G6152 | Preparation of CZB |
HEPES-Na (basic) | Sigma | H3784 | Preparation of CZB |
Hoechst 33342 | Beyotime | C1025 | FACS |
human chorionic gonadotropin (HCG) | Ningbo Second Hormone Company | HCG | Ovulation promoting drugs |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | Removing granulosa cells around the oocyte |
KCl | Sigma | P5405 | Preparation of CZB |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | Preparation of CZB |
KSOMaa | Caisson Labs | IVL04-100ML | Potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids |
L-glutamine | Sigma | G8540 | Preparation of CZB |
M2 | Sigma | M7167-50ML | Operating fluid |
MgSO47H2O | Sigma | M1880 | Preparation of CZB |
Na2-EDTA2H2O | Sigma | E5134 | Preparation of CZB |
NaCl | Sigma | S5886 | Preparation of CZB |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Preparation of CZB |
Na-lactate 60% syrup d = 1.32 g/L | Sigma | L7900 | Preparation of CZB |
Na-pyruvate | Sigma | P4562 | Preparation of CZB |
Piezo drill tips (ICSI) | Eppendorf | piezoXpert | Piezoelectric membrane rupture |
pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Ningbo Second Hormone Company | PMSG | Ovulation promoting drugs |
PVA | Sigma | P8136 | Preparation of CZB |
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