Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella preparazione del Gallio 68 etichettato RGD-Peptide e il metodo per la valutazione biologica dei suoi analoghi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un semplice protocollo sistemico per lo sviluppo di un nuovo peptide con etichetta radiometale. A dimostrare la procedura sarà Ki-Hye Jung, un post-doc del nostro istituto.
Iniziare utilizzando acido cloridrico molare 0,5 per elusare il tricloruro di gallio radioetichettato da un generatore di germanio di gallio radioetichettato. Eliminare il composto in cinque flaconcino di reazione millilitro con gas azoto a 80 gradi Celsius. Seguito dall'aggiunta di 100 microgrammi di acetato di glicina arginina o peptide RGD in un acetato di sodio molare al composto essiccato.
Riscaldare la miscela di reazione a 80 gradi Celsius per cinque minuti prima di lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente. Per purificare il prodotto grezzo con cromatografia liquida ad alte prestazioni, aggiungere la soluzione a una colonna C18 e passare la soluzione attraverso una cartuccia a fasi inversa C18. Lavare la cartuccia con due millilitri di soluzione salina ed elutare il peptide radioetichettato con 0,7 millilitri di etanolo 95%, seguito dalla rimozione del solvente a 80 gradi Celsius sotto gas azoto per 20 minuti.
Ricostituire il peptide purificato in PBS e filtrare il prodotto radioetichettato attraverso un colino sterile sterile sterile da 0,22 micron. Formulare il peptide in un millilitro di soluzione salina sterile e individuare un microlitro di soluzione peptidica su una piastra cromatografica istantanea a strato sottile. Quindi, sviluppare la piastra nella camera contenente acido citrico molare 0.1 acquoso fino a nove centimetri di distanza dal punto per determinare la resa radiochimrica.
Per valutare l'assorbimento cellulare in vivo del peptide, trattare una volta 10 alla sesta cellule di glioblastoma umano per pozzo in sei piastre di pozzo con 111 kilobecquerel di peptide RGD radioetichettato per pozzo a 37 gradi Celsius per 30, 60, 90 o 120 minuti in triplice copia. Al termine dell'incubazione, lavare i pozzi due volte con due millilitri di PBS per lavaggio e raccogliere le cellule con 0,25% tripside e 0,02%EDTA in PBS a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti. Quindi, trasferire le cellule da ogni pozzo in tubi conici da 15 millilitri per misurare l'assorbimento di peptidi radioetichettato su un contatore gamma.
Per valutare la stabilità siere del peptide RGD radioetichettato, aggiungere 500 microlitri di siero di topo preparato al momento, 500 microlitri di siero umano e 500 microlitri di PBS a 50 microlitri di ciascun campione e incubare le miscele a 37 gradi Celsius per un massimo di due ore. Quindi individuare uno o due microlitri di ogni campione su una lastra di cromatografia istantanea a strato sottile dopo 30, 60, 90 e 120 minuti di incubazione e sviluppare le piastre come dimostrato. Per determinare la lipofilia del peptide, aggiungere 10 microlitri del peptide RGD radioetichettato a un sistema PBS ottanale e mescolare generosamente le fiale per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi raccogliere il peptide per centrifugazione e raccogliere 100 microlitri di campione da ogni strato per misurare con un contatore gamma. Per generare modelli di tumore radioetichettati, caricare cinque volte 10 alla sesta cellule di glioblastoma umano in 100 microlitri di PBS in una siringa di insulina da mezzo pollice dotata di un ago calibro 28 per topo nudo BALB / c da iniettare e consegnare le cellule tumorali per via sottocutanea nel fianco sinistro di ogni ricevente. Per la quantificazione in vivo del peptide mediante tomografia ad emissione di positroni, o PET, posizionare la testa un topo anestetizzato con cuscinetti tumorali nel portale PET e somministrare per via endovenosa 7,4 megabecquerel di soluzione RGD-peptidica radioetichettata in 200 microlitri di PBS in ogni modello di topo xenografto attraverso la vena della coda per oltre un minuto durante l'esecuzione di una scansione PET in modalità elenco.
Per l'analisi di biodistribuzione ex vivo, iniettare 0,37 megabecquerel di peptide RGD radiomarcato in 200 microlitri di PBS nella vena di coda di un animale xenofobo e portante di tumore e raccogliere i tessuti di interesse a 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'iniezione. Quindi pesare i tessuti e misurare la loro radioattività con un contatore gamma. Dopo la chelazione, le impurità di reazione possono essere rimosse con successo mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni come dimostrato.
Una purezza radiochimica superiore al 99% del peptide RGD radioetichettato può essere ottenuta con un'attività specifica alla fine della sintesi tra 90 e 130 megabecquerel per nanometro. L'analisi pet dimostra un assorbimento iniziale elevato nei principali organi, tra cui fegato, rene, cuore, muscoli e all'interno del tumore. Durante le fasi successive dell'analisi, la regione tumorale può essere chiaramente visualizzato con il rapporto tumore/muscolo rimasto invariato, indicando la stabilità cinetica del peptide.
L'analisi di biodistribuzione ex vivo rivela che la radioattività accumulata nel tumore diminuisce nel tempo come previsto dai risultati in vivo del PET. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, sebbene la nostra metodologia non possa sostituire il delicato processo di valutazione biologica, può essere utilizzata per utilizzare considerevolmente il tempo e il costo di una pratica tradizionale di sviluppo di farmaci. Non dimenticare che lavorare con i materiali radioattivi può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione adeguati come un dosimetro personale e un dosimetro termoluminescente, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di queste procedure.
