Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при подготовке галлия 68 помечены RGD-пептид и метод биологической оценки его аналогов. Основным преимуществом этой методики является то, что это простой системный протокол для разработки нового пептида с маркировкой радиометалла. Демонстрацией процедуры будет Ки Хе Чжун, пост-док из нашего института.
Начните с использования 0,5 молярной соляной кислоты, чтобы элют радиозабюметь трихлорид галлия из радиозабеленной генератора галлия германия. Очистить соединение в пять миллилитров реакции флакон с азотным газом при 80 градусов по Цельсию. Затем добавление 100 микрограммов ацетата аргинина глицина или пептида РГД в один ацетат молярного натрия в высушенное соединение.
Нагрейте реакционной смеси при температуре 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем позволить смеси остыть до комнатной температуры. Чтобы очистить сырой продукт высокой производительностью жидкой хроматографии, добавьте раствор в столбец C18 и перейдите раствор через картридж обратной фазы C18. Вымойте картридж с двумя миллилитров солевого раствора и elute радиолейловый пептид с 0,7 миллилитров 95% этанола с последующим удалением растворителя при 80 градусов по Цельсию под азотным газом в течение 20 минут.
Восстановить очищенный пептид в PBS и фильтровать радиозабрюшенный продукт через стерильный 0,22 микрон стерильный ситечко. Сформулируйте пептид в один миллилитр стерильного солевого раствора и напоймите один микролитр пептидного раствора на мгновенной тонкой слоеной хроматографической пластине. Затем разработать пластину в камере, содержащей aqueous 0,1 молярной лимонной кислоты до девяти сантиметров от места, чтобы определить радио химический выход.
Чтобы оценить поглощение пептида клетками in vivo, обработать один раз от 10 до шестого человека глиобластомы клеток на колодец в шести пластин хорошо с 111 килобеккерель радиозабеленной РГД-пептид на колодец при 37 градусов по Цельсию в течение 30, 60, 90 или 120 минут в триплакате. В конце инкубации, мыть скважины два раза с двумя миллилитров PBS за стирку, и урожай клеток с 0,25%трипсина и 0,02%EDTA в PBS при 37 градусов по Цельсию в течение трех-пяти минут. Затем перенесите клетки из каждого хорошо в 15 миллилитровых конических труб для измерения радиозапись пептидного поглощения на гамма-счетчике.
Для оценки устойчивости сыворотки радиозабрюшенного РГД-пептида добавьте 500 микролитров свежеприготовленной сыворотки мыши, 500 микролитров человеческой сыворотки и 500 микролитров PBS до 50 микролитров каждого образца и инкубировать смеси при 37 градусах Цельсия на срок до двух часов. Затем обнаружить один-два микролитров каждого образца на мгновенный тонкий слой хроматографии пластины после 30, 60, 90 и 120 минут инкубации и развивать пластины, как попродемонстрировано. Чтобы определить липофилиность пептида, добавьте 10 микролитров радиозабрюшенного РГД-пептида в октановую систему PBS и щедро смешайте флаконы в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем соберите пептид путем центрифугации и соберите 100 микролитров образца из каждого слоя для измерения с помощью гамма-счетчика. Для создания радиозаявляемых моделей опухоли, загрузить пять раз от 10 до шестого человека глиобластомы клеток в 100 микролитров PBS в один почерне дюймовый инсулин шприц оснащен 28 калибровочных иглы на BALB / C обнаженной мыши, которые будут введены, и доставить опухолевые клетки подкожно в левый фланг каждого получателя. Для виво количественной оценки пептида по позитронно-эмиссионной томографии, или ПЭТ, поместите голову опухоленосной, обезболивающей мыши в ПЭТ gantry и внутривенно вветь 7,4 мегабеккерели радиозабеленной RGD-пептидного раствора в 200 микролитров PBS в каждой модели ксенотрансплантата мыши через хвостовую вену в течение одной минуты при выполнении ПЭТ-сканирования в режиме списка.
Для анализа биораспределения ex vivo в 200 микролитров PBS вводят 0,37 мегабеккерели радиомаркированного РГД-пептида в 200 микролитров PBS в хвостовую вену ксенотрансплантированного, опухоленосного животного и собирают ткани, представляющие интерес, в 30, 60, 90 и 120 минут после инъекции. Затем взвесьте ткани и измерьте их радиоактивность с помощью гамма-счетчика. После хелации примесей реакции могут быть успешно удалены высокой производительностью жидкой хроматографии, как попродемонстрировано.
Более 99% радиохимической чистоты радиозабеленной пептида РГД может быть достигнуто с определенной активностью в конце синтеза между 90 и 130 мегабеккерелей на нанометров. ПЭТ-анализ показывает первоначальное высокое поглощение в основных органах, включая печень, почки, сердце, мышцы, а также в опухоли. На более поздних стадиях анализа область опухоли может быть четко визуализирована с соотношением опухоли и мышц, остающимся неизменным, что указывает на кинетическую стабильность пептида.
Анализ биораспределения Ex vivo показывает, что накопленная радиоактивность опухоли уменьшается с течением времени, как и ожидалось от выводов IN vivo PET. При попытке этой процедуры, важно помнить, что, хотя наша методология не может заменить деликатный процесс биологической оценки, она может быть использована для значительного использования времени и стоимости традиционной практики разработки лекарств. Не забывайте, что работа с радиоактивными материалами может быть чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как использование надлежащего защитного оборудования, как личный дозиметр и термолюминесцентный дозиметр всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.
