שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהכנת גליום 68 שכותרתו RGD-פפטיד ואת השיטה להערכה ביולוגית של האנלוגים שלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פרוטוקול מערכתי פשוט לפיתוח פפטיד חדש שכותרתו רדיומטית. הדגמת ההליך תהיה קי-היי יונג, פוסט-דוקטורט מהמכון שלנו.
התחילו בשימוש בחומצה הידרוכלורית טוחה 0.5 כדי לשאוב טריכלוריד גליום רדיולייבל מגנרטור גליום גרמניום. לטהר את המתחם בבקבוקון תגובה חמישה מיליליטר עם גז חנקן ב 80 מעלות צלזיוס. ואחריו תוספת של 100 מיקרוגרם של ארגינין גליצין אצטט או פפטיד RGD אחד נתרן אצטט טוחן לתרכובת מיובשת.
מחממים את תערובת התגובה ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני המאפשר את התערובת להתקרר לטמפרטורת החדר. כדי לטהר את המוצר הגולמי עם כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים, הוסף את הפתרון לעמודת C18 והעביר את הפתרון דרך מחסנית הפוכה C18. לשטוף את המחסנית עם שני מיליליטר של מלוחים וללטף את פפטיד radiolabeled עם 0.7 מיליליטר של 95% אתנול ואחריו הסרת הממס ב 80 מעלות צלזיוס תחת גז חנקן במשך 20 דקות.
יש לייצר מחדש את הפפטיד המטוהר ב-PBS ולסנן את המוצר עם תריס הרדיו באמצעות מסננת סטרילית סטרילית של 0.22 מיקרון. מנסח את הפפטיד במיליליטר אחד של תמיסת מלח סטרילית ומבחין במיקרוליטר אחד של תמיסת פפטיד על צלחת כרומטוגרפיה של שכבה דקה מיידית. לאחר מכן, לפתח את הצלחת בתא המכיל חומצת לימון מימית 0.1 טוחן עד תשעה סנטימטרים מהנקודה כדי לקבוע את התשואה הכימית רדיו.
כדי להעריך את ספיגת תאי ה-vivo של הפפטיד, יש לטפל פעם אחת ב-10 לתאי הגליאובלסטומה האנושיים השישיים לבא בשישה צלחות באר עם 111 קילובקרל של RGD-פפטיד רדיולובלד לבא ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30, 60, 90 או 120 דקות בטריליקט. בסוף הדגירה, לשטוף את הבאר פעמיים עם שני מיליליטר של PBS לכל לשטוף, לקצור את התאים עם 0.25% טריפסין ו 0.02% EDTA ב PBS ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, להעביר את התאים מכל באר לתוך 15 צינורות חרוט מיליליטר כדי למדוד את ספיגת פפטיד radiolabeled על מונה גמא.
כדי להעריך את יציבות הסרום של RGD-פפטיד radiolabeled, להוסיף 500 microliters של סרום העכבר מוכן טרי, 500 microliters של סרום אנושי, ו 500 microliters של PBS כדי 50 microliters של כל מדגם הדגירה את תערובות ב 37 מעלות צלזיוס עד שעתיים. ואז לזהות אחד עד שני microliters של כל מדגם על צלחת כרומטוגרפיה שכבה דקה מיידית לאחר 30, 60, 90 ו 120 דקות של דגירה ולפתח את הצלחות כפי שהוכח. כדי לקבוע את lipophilicity של פפטיד, להוסיף 10 microliters של radiolabeled RGD-פפטיד למערכת PBS אוקטנאלי ומערבבים את הבקבוקונים בנדיבות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן לאסוף את הפפטיד על ידי צנטריפוגה לקצור 100 microliters של מדגם מכל שכבה למדידה עם מונה גמא. כדי ליצור מודלים גידול radiolabeled, לטעון חמש פעמים 10 לתאי גליובלסטומה האנושית השישית ב 100 microliters של PBS לתוך מזרק אינסולין חצי אינץ מצויד מחט 28 מד לכל עכבר עירום BALB / c להיות מוזרק, ולספק את תאי הגידול תת עורית לתוך האגף השמאלי של כל נמען. לכמות ב vivo של הפפטיד על ידי טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים, או PET, למקם את הראש גידול נושאת, עכבר הרדמה לתוך gantry PET ולנהל דרך הווריד 7.4 מגה becquerels של פתרון radiolabeled RGD-פפטיד ב 200 microliters של PBS לתוך כל מודל העכבר xenograft דרך וריד הזנב במשך דקה אחת בעת ביצוע סריקת PET במצב רשימה.
לניתוח ביובליזיה לשעבר vivo, להזריק 0.37 מגה becquerels של radiolabeled RGD-פפטיד ב 200 microliters של PBS לתוך וריד הזנב של קסנוגרפט, נושאת גידול חיה, לקצור את הרקמות של עניין ב 30, 60, 90 ו 120 דקות לאחר ההזרקה. ואז לשקול את הרקמות ולמדוד את הרדיואקטיביות שלהם עם מונה גמא. לאחר קלאציה, זיהומים תגובה ניתן להסיר בהצלחה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים כפי שהוכח.
יותר מ 99% טוהר רדיוכימי של פפטיד RGD radiolabeled ניתן להשיג עם פעילות ספציפית בסוף הסינתזה בין 90 ל 130 מגה becquerels לכל ננומטר. ניתוח PET מדגים ספיגה גבוהה ראשונית באיברים העיקריים, כולל הכבד, הכליה, הלב, השריר, כמו גם בתוך הגידול. במהלך השלבים המאוחרים יותר של הניתוח, אזור הגידול יכול להיות חזותי בבירור עם יחס הגידול לשרירים שנותר ללא שינוי, המציין את היציבות הקינטית של הפפטיד.
ניתוח חלוקה ביולוגית של Ex vivo מגלה כי הרדיואקטיביות המצטברת בגידול פוחתת עם הזמן כצפוי מממצאי ה- IN vivo PET. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי, למרות המתודולוגיה שלנו לא יכול להחליף את תהליך ההערכה הביולוגית העדינה, זה יכול לשמש במידה ניכרת להיות להשתמש בזמן ועלות של שיטות פיתוח תרופות מסורתיות. אל תשכח כי עבודה עם חומרים רדיואקטיביים יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות, כגון שימוש בציוד מגן הנכון כמו dosimeter אישי dosimeter תרמולומינסנט צריך תמיד להילקח בעת ביצוע הליכים אלה.
