Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la préparation du Gallium 68 étiqueté RGD-Peptide et la méthode pour l’évaluation biologique de ses analogues. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un protocole systémique simple pour le développement d’un nouveau peptide étiqueté radiométéral. Ki-Hye Jung, post-doc de notre institut, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par utiliser 0,5 acide chlorhydrique molaire pour élétauter le trichlorure de gallium radiolabeled d’un générateur de germanium de gallium radiolabeled. Purgez le composé en flacon de réaction de cinq millilitres avec du gaz azoté à 80 degrés Celsius. Suivi de l’ajout de 100 microgrammes d’acétate d’arginine glycine ou peptide RGD dans un acétate de sodium molaire au composé séché.
Chauffer le mélange de réaction à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de laisser refroidir le mélange à température ambiante. Pour purifier le produit brut avec une chromatographie liquide haute performance, ajoutez la solution à une colonne C18 et passez la solution à travers une cartouche en phase inverse C18. Lavez la cartouche avec deux millilitres de solution saline et élisez le peptide radiolabeled avec 0,7 millilitres de 95% d’éthanol suivi de l’enlèvement du solvant à 80 degrés Celsius sous gaz azoté pendant 20 minutes.
Reconstituer le peptide purifié dans PBS et filtrer le produit radioétique à travers une passoire stérile stérile de 0,22 micron. Formuler le peptide en un millilitre de solution saline stérile et repérer un microlitre de solution peptidique sur une plaque chromatographie à couche mince instantanée. Ensuite, développez la plaque dans la chambre contenant de l’acide citrique molaire aqueux de 0,1 jusqu’à neuf centimètres de l’endroit pour déterminer le rendement chimique radio.
Pour évaluer l’absorption cellulaire in vivo du peptide, traiter une fois 10 à la sixième cellule humaine de glioblastome par puits dans six plaques de puits avec 111 kilobecquerel de RGD-peptide radiolabeled par puits à 37 degrés Celsius pendant 30, 60, 90 ou 120 minutes en triplicate. À la fin de l’incubation, laver les puits deux fois avec deux millilitres de PBS par lavage, et récolter les cellules avec 0,25%Trypsine et 0,02%EDTA en PBS à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, transférez les cellules de chaque puits en tubes coniques de 15 millilitres pour mesurer l’absorption de peptide radiolabeled sur un compteur gamma.
Pour évaluer la stabilité sérique du RGD-peptide radiolabeled, ajoutez 500 microlitres de sérum de souris fraîchement préparé, 500 microlitres de sérum humain, et 500 microlitres de PBS à 50 microlitres de chaque échantillon et incuber les mélanges à 37 degrés Celsius pendant jusqu’à deux heures. Placez ensuite un à deux microlitres de chaque échantillon sur une plaque de chromatographie à couche mince instantanée après 30, 60, 90 et 120 minutes d’incubation et développez les plaques comme démontré. Pour déterminer la lipophilicité du peptide, ajouter 10 microlitres du peptide RGD radioétiqueté à un système octaharien de PBS et mélanger généreusement les flacons pendant cinq minutes à température ambiante.
Puis recueillir le peptide par centrifugation et récolter 100 microlitres d’échantillon de chaque couche pour mesurer à l’aide d’un compteur gamma. Pour générer des modèles tumoraux radioétiques, chargez cinq fois 10 à la sixième cellule humaine de glioblastome dans 100 microlitres de PBS dans une seringue d’insuline d’un demi-pouce équipée d’une aiguille de calibre 28 par souris nue BALB/c à injecter, et livrez les cellules de tumeur sous-cutanée dans le flanc gauche de chaque destinataire. Pour la quantification in vivo du peptide par tomographie par émission de positons, ou PET, placez la tête une souris tumorale et anesthésiée dans le portique PET et administrez par voie intraveineuse 7,4 mégabecquerels de solution RGD-peptide radioétique dans 200 microlitres de PBS dans chaque modèle de souris xénogreffe via la veine de la queue pendant une tomodensitométrie en mode liste.
Pour l’analyse de biodistribution ex vivo, injectez 0,37 mégabecquerels de RGD-peptide radiolabeled dans 200 microlitres de PBS dans la veine de queue d’un animal xénogreffe, tumeur-portant, et récoltez les tissus d’intérêt à 30, 60, 90 et 120 minutes après injection. Pesez ensuite les tissus et mesurez leur radioactivité à l’aide d’un compteur gamma. Après la chélation, les impuretés de réaction peuvent être enlevées avec succès par chromatographie liquide de haute performance comme démontré.
Une pureté radiochimique supérieure à 99 % du peptide RGD radioétique peut être obtenue avec une activité spécifique à la fin de la synthèse entre 90 et 130 mégabecquerels par nanomètre. L’analyse de PET démontre une absorption élevée initiale dans les organes principaux, y compris le foie, le rein, le coeur, le muscle, aussi bien que dans la tumeur. Pendant les étapes ultérieures de l’analyse, la région de tumeur peut être clairement visualisée avec le rapport de tumeur à muscle restant inchangé, indiquant la stabilité cinétique du peptide.
L’analyse de biodistribution d’Ex vivo indique que la radioactivité accumulée dans la tumeur diminue au fil du temps comme prévu des résultats in vivo de PET. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que, bien que notre méthodologie ne puisse pas remplacer le processus délicat d’évaluation biologique, elle peut être utilisée pour utiliser considérablement le temps et le coût d’une pratique traditionnelle de développement de médicaments. N’oubliez pas que le travail avec les matières radioactives peut être extrêmement dangereux et des précautions, telles que l’utilisation de l’équipement de protection approprié comme un dosimètre personnel et dosimètre thermoluminescent doit toujours être prise lors de l’exécution de ces procédures.
