Procedure di assistenza di base

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Topi e ratti rappresentano oltre il 90% degli animali utilizzati per la ricerca biomedica. La cura adeguata di questi animali da ricerca è fondamentale per l'esito degli esperimenti. Esistono procedure generali che si applicano alla maggior parte di questi topi e ratti, ma alcuni degli animali, come quelli immunocompromessi, richiedono ulteriori misure da adottare per sostenerli per la sperimentazione.

I topi immunocompromessi comunemente usati includono quelli che si sono verificati naturalmente nei topi consanguinei e quelli che sono stati creati attraverso l'ingegneria genetica. I primi topi immunocompromessi utilizzati nella ricerca erano topi "nudi". Il topo BALB/c Nude (nu) è stato scoperto nel 1966, all'interno di una colonia BALB/c che produceva topi privi sia di capelli che di timo. Questi topi atimici hanno un sistema immunitario inibito che è privo di cellule T. Il valore di questo animale è stato presto scoperto per l'uso in studi di infezioni microbiche, immunodeficienze e autoimmunità. Anche se non è così comunemente usato come il topo nudo, c'è anche un topo nudo. Il ratto nudo è carente di cellule T e mostra popolazioni cellulari impoverite nelle aree dipendenti dal timo degli organi linfoidi periferici. Un altro topo immunodeficiente naturale è il topo immunodeficienza combinata grave (SCID). Questi topi hanno un difetto che compromette la produzione di cellule B e T funzionali. Con l'incapacità di montare un'adeguata risposta immunitaria, questi topi possono servire come riceventi ospiti per trapianti di cellule umane. Diversi ceppi di topo geneticamente modificati con deficienze immunitarie sono disponibili in commercio. ¹ La gravità della carenza varia con la modificazione genetica; tuttavia, tutti i topi e i ratti immunocompromessi sono gestiti in modo simile.

Questo manoscritto descriverà la cura degli animali immunocompetenti e immunocompromessi. L'alloggio, la dieta, i requisiti ambientali e la manipolazione saranno discussi per entrambi i gruppi di animali.

Alloggiamento/Intarsio

Topi e ratti sono principalmente alloggiati in intasature tipo scatola da scarpe con un fondo solido che contiene materiale da letto. La tipica gabbia per mouse shoebox fornisce 75 pollici quadrati di spazio sul pavimento, che è adeguato per un massimo di cinque topi adulti. Tuttavia, il disegno sperimentale può richiedere gruppi di quattro topi. In questo caso, i topi dovrebbero essere alloggiati al ricevimento in gruppi di quattro, per evitare l'interruzione dei gruppi sociali quando inizia l'esperimento. In generale, l'intasamento dei ratti consente un massimo di due animali adulti adulti. Se i ratti devono essere ospitati a lungo termine, dovrebbero essere stabiliti in alloggi di coppia.

Le gabbie possono essere statiche o ventilate individualmente (IVC). Le gabbie statiche sono coperte con un coperchio a barra metallica o sono sistemate su un rack sotto uno scaffale che è quindi la parte superiore della gabbia. Il materiale filtrante viene aggiunto sopra la parte superiore della gabbia come un cofano sopra il coperchio della barra metallica o come un foglio di carta da filtro sopra i ripiani del rack. Gli IPC sono impostati come una gabbia, un coperchio a barra metallica e un cofano che vengono posizionati su un rack che fornisce il flusso d'aria nella gabbia. L'uso di IPC elimina la necessità di cambiare la gabbia tutte le volte che vengono cambiate le gabbie statiche.

I sistemi di gabbie standard forniscono una fonte d'acqua e un'area per la distribuzione del cibo. L'acqua può essere fornita tramite una bottiglia d'acqua posizionata sulla parte superiore della gabbia o tramite un tubo del sorso che è un componente incorporato della gabbia animale. Quando la gabbia è inserita su un rack, l'acqua viene trasportata nel tubo del sipper per un sistema di irrigazione automatico progettato per soddisfare le esigenze dell'animale in tutta la struttura per animali. L'intasamento deve essere adeguatamente preparato per fornire cure adeguate agli animali. Ci sono alimentatori collocati all'interno della gabbia per animali, o una sezione del coperchio della barra metallica viene utilizzata per la conservazione degli alimenti. Il cibo deve essere posto in modo tale che non sia sporcato dagli animali.

La Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio² (la "Guida") afferma che tutti gli attrezzi di intasamento devono essere disinfettati almeno ogni 2 settimane. Alcune gabbie e accessori potrebbero dover essere cambiati più spesso come dettato dal livello di odore e ammoniaca nell'involucro. In generale, gli IPC sono programmati per cambiare ogni due settimane a meno che non ci siano quattro o più maschi o una femmina con una cucciolata; tali custodie possono richiedere cambi settimanali. Poiché il cambio di gabbia è un'opportunità per i topi di essere esposti a patogeni, il cambiamento dell'ingabbiamento per topi immunodeficienti dovrebbe essere fatto il più raramente possibile.

Dieta

Ci sono molte composizioni di diete disponibili con variazioni nei livelli di proteine, carboidrati e grassi. In genere, i mangimi dovrebbero essere composti da 15-19% di proteine, 44% di carboidrati e 4-9% di grassi. Il cibo con un aumentato contenuto di grassi viene spesso utilizzato per le colonie riproduttive per migliorare la riproduzione. Poiché il cibo può essere una fonte di contaminazione per i topi immunocompromessi, deve essere sterilizzato a vapore o irradiato. Gli alimenti sottoposti al processo di autoclave devono essere appositamente formulati per resistere al processo. Tuttavia, il processo di irradiazione non altera il contenuto degli alimenti.

L'acqua è un'altra potenziale fonte di contaminazione per gli animali immunodeficienti. L'acqua deve essere lavorata attraverso un'autoclave o una filtrazione che include l'acqua che passa attraverso un filtro UV. Per sterilizzare a vapore l'acqua in un'autoclave, le singole bottiglie d'acqua sono coperte con un foglio di alluminio. I coperchi delle bottiglie con tubi per sorseggiatori vengono sterilizzati separatamente in un sacchetto per autoclave. L'acidificazione dell'acqua a un pH di 2,5-3 aiuta a controllare la crescita degli organismi batterici nelle bottiglie d'acqua. L'acqua viene acidificata aggiungendo due gocce di acido cloridrico (HCl) 12 mole (M) a otto litri di acqua ad osmolalità inversa (RO). I sistemi di irrigazione automatici possono essere utilizzati con una serie di filtrazione in tutto il sistema che include filtri antiparticolato e un filtro a luce ultravioletta.

Ambiente

Le condizioni ambientali all'interno di una struttura per la cura degli animali devono essere strettamente controllate. I regolamenti e le linee guida federali hanno stabilito gli standard per la cura e la manipolazione degli animali di uso comune. L'illuminazione, la temperatura ambiente, l'umidità e il flusso d'aria sono forniti per soddisfare le esigenze fisiologiche degli animali. Ad eccezione della necessità di una temperatura ambiente leggermente aumentata, i parametri per gli animali immunocompromessi sono gli stessi di quelli per gli animali convenzionali. Gli animali nudi atimici richiedono anche lettiera aggiuntiva e materiali di nidificazione di carta triturati nelle loro gabbie per aiutare con la termoregolazione.

Le stanze degli animali devono essere mantenute a una temperatura compresa tra 68-72 ° F con un livello di umidità del 40-60%. ² Livelli di umidità inferiori al 40% possono causare la coda di topi e ratti, una condizione che fa asciugare la pelle della coda al punto da restringersi attorno alla coda, che può portare allo sloughing della coda. I cicli di illuminazione devono essere impostati per evitare fattori di stress per gli animali causati da fotoperiodi o intensità luminosa inappropriati. Normalmente, i fotoperiodi sono 12 ore accesi e 12 ore spenti. L'intensità luminosa dovrebbe variare in base all'attività nella stanza. Quando i tecnici lavorano nella stanza degli animali, è possibile utilizzare livelli di illuminazione più elevati. Tuttavia, l'illuminazione dovrebbe essere abbassata a circa 325 lux una volta conclusa tutta l'attività. ² Le luci devono essere accese sui timer e i cicli verificati attraverso sistemi di monitoraggio. Come indicato dalla Guida, le stanze degli animali devono avere un minimo di 10-15 cambi d'aria del 100% di aria fresca all'ora. ^{2 I} cambi d'aria diminuiscono i microbi e gli odori nella stanza degli animali. Nelle stanze degli animali densamente popolate, potrebbe essere necessario aumentare il numero di cambi d'aria all'ora.

I fattori ambientali a livello di gabbia includono il tipo di ingabbiamento, il substrato utilizzato all'interno della gabbia, il sistema di erogazione dell'acqua e la dieta. L'edilizia sociale è obbligatoria a meno che non sia scientificamente giustificato, o un animale è incompatibile con tutti gli altri. Le disposizioni di arricchimento ambientale, come capanne di carta e materiali di nidificazione, consentono agli animali di esibire comportamenti specifici per specie, che a loro volta diminuiscono il livello di stress e aumentano il benessere generale degli animali. I materiali di nidificazione forniscono anche una zona notte satura di feromoni calmanti che aiuta con l'alloggiamento di più topi maschi nella stessa gabbia. L'area di nidificazione viene spostata nella gabbia pulita al momento del cambio della gabbia per aiutare a prevenire l'aggressività nei maschi mentre vengono introdotti in un nuovo ambiente. ³

1. Manipolazione di topi immunocompetenti (convenzionali)

È stato dimostrato che i disturbi immunitari dei topi sono molto simili a quelli degli esseri umani. ² Poiché questi animali hanno capacità immunologiche limitate, le procedure di manipolazione e cura di tali animali sono state concepite per ridurre al minimo il rischio di malattie infettive mediante l'uso di controlli tecnici, dispositivi di protezione individuale per il personale addetto alla cura degli animali e procedure operative standard; mitigano la contaminazione dell'ingabbiamento e di altre attrezzature con cui gli animali sono in contatto.

1. Disimballaggio dai container di spedizione: ricevere animali da altre istituzioni o venditori di animali rappresenta un rischio per gli animali già ospitati all'interno della struttura per animali. Durante il transito, le scatole di trasporto degli animali possono venire a contatto con agenti patogeni. Pertanto, è necessario eseguire una procedura corretta quando si disimballano i contenitori di spedizione.
   1. I requisiti minimi dei dispositivi di protezione individuale (DPI) sono guanti, camici da laboratorio o scrub puliti, una maschera antiparticolato e occhiali di sicurezza quando si maneggiano gli animali.
   2. Selezionare la gabbia appropriata, compreso il coperchio della barra metallica e la parte superiore della barriera. La gabbia deve essere fornita con lettiere e materiali di nidificazione appropriati. Tutte le intasagioni devono essere preparate e collocate nell'area ricevente prima dell'arrivo degli animali.
   3. All'arrivo, le scatole di trasporto vengono collocate in una stanza sicura e a temperatura controllata. Quindi, esaminare il contenitore per eventuali danni.
   4. Disinfettare le superfici esterne del contenitore di spedizione con un prodotto a biossido di colina per distruggere eventuali agenti patogeni dannosi. Assicurarsi che il disinfettante sia a contatto con la scatola in conformità con le raccomandazioni dei produttori, di solito 15-30 minuti.
   5. Posizionare il contenitore in una stazione di trasferimento degli animali (ATS). L'ATS fornisce un flusso d'aria filtrato HEPA all'interno della cappa che fornisce protezione dagli allergeni creando una barriera d'aria sottovuoto tra l'utente e la zona di lavoro. Ciò garantisce un'esposizione minima ai peli di animali / peli e al materiale della lettiera della gabbia. L'aria unidirezionale protegge anche gli animali dall'aria della stanza circostante, riducendo al minimo la possibilità di contaminazione.
   6. Una volta aperto il container, valutare la salute generale degli animali. Prendi nota di eventuali animali feriti o malati.
   7. Metti gli animali nelle gabbie assemblate nelle dimensioni del gruppo appropriate. Il raggruppamento dovrebbe essere conforme alle normative spaziali e al protocollo sperimentale a cui saranno assegnati.
   8. Coprire la gabbia con il coperchio della barra metallica. Fissare il divisore sul coperchio della barra metallica per creare due aree sul coperchio.
   9. Selezionare il cibo appropriato e posizionare il cibo in un lato del coperchio della barra metallica. Lasciare aperto il secondo lato per consentire una migliore circolazione dell'aria.
   10. L'acqua sarà fornita tramite bottiglie d'acqua o un sistema di irrigazione automatico. Le bottiglie d'acqua vengono utilizzate per i topi appena svezzati per garantire che siano in grado di mantenere i loro livelli di idratazione. Per l'ingabbiamento IVC con irrigazione automatica, caricare il tubo di irrigazione prima di posizionarlo sul rack.
   11. Posizionare la gabbia su un rack. Se si utilizzano IPC, verificare che la gabbia sia completamente inserita nel rack e che il tubo del sorso sia fissato al sistema di irrigazione.
2. Gabbia che cambia topi convenzionali
   1. Le gabbie per animali vengono cambiate in un ATS. L'ATS viene disinfettato alla fine di ogni sessione.
   2. È possibile aprire una sola gabbia alla volta.
   3. L'intasamento preparato con la lettiera appropriata e i materiali di nidificazione viene portato nella stanza degli animali. Un piccolo numero di gabbie sono collocate nell'ATS.
   4. Le gabbie IVC con tubi di sorso interni devono essere caricate per forzare l'acqua nel sorso per rimuovere lo spazio morto dell'aria nel tubo del sorso. Se non caricati correttamente, i mouse potrebbero non essere in grado di fornire una pressione sufficiente sul tubo del sorso per rimuovere l'aria da esso.
   5. I requisiti minimi dei dispositivi di protezione individuale (DPI) sono guanti, camici da laboratorio o scrub puliti, una maschera antiparticolato e occhiali di sicurezza quando si maneggiano gli animali.
   6. Una gabbia di animali da cambiare viene collocata in una nuova gabbia e quindi nell'ATS.
   7. Gli animali vengono trasferiti a mano o con l'uso di una pinina imbottita. I guanti vengono cambiati tra le gabbie o tra gruppi di topi. I guanti possono anche essere disinfettati con una sostanza chimica non tossica tra le gabbie.
   8. È stato dimostrato che il trasferimento dell'area di nidificazione dei topi in una gabbia pulita aiuta con la transizione nella gabbia pulita, specialmente per i maschi ospitati in gruppo. Anche altri elementi di arricchimento vengono trasferiti nella nuova gabbia.
   9. Una volta che la parte superiore della gabbia o l'alimentatore viene inserito nella nuova gabbia, viene aggiunto il cibo.
   10. Il piano della barriera viene posizionato sulla nuova gabbia e la gabbia viene restituita al rack.
   11. Le gabbie IVC devono essere correttamente agganciate al rack per garantire che le valvole dell'aria e dell'acqua siano inserite.

2. Manipolazione di topi immunocompromessi

1. Disimballaggio dai container di spedizione
   1. Gli animali immunocompromessi devono essere disimballati in condizioni sterili. Tutti gli individui che maneggiano topi immunodefici devono indossare un camice sterilizzato a vapore, maschera, cofano per capelli e guanti sterili. La tecnica asettica dovrebbe essere usata in ogni momento quando si consegnano questi animali.
   2. Tutte le attrezzature e l'intasamento dovrebbero essere state sterilizzate a vapore, radiazioni UV o sterilizzate chimicamente con un ammollo in etanolo al 70% per almeno 30 minuti Ci sono due opzioni per l'intasamento sterile: intasamento standard che è stato avvolto e sterilizzato a vapore, o intasamento che viene sterilizzato - di solito attraverso l'irradiazione - dal venditore. Queste gabbie sono un uso unico, unità usa e getta.
   3. Prima di manipolare i topi sotto il cappuccio a flusso laminare, il cappuccio viene spruzzato con etanolo al 70% con il ventilatore in funzione. Il ventilatore del cappuccio deve rimanere sempre acceso per mantenere l'ambiente sterile. Dopo ogni utilizzo, il cappuccio viene spruzzato con un disinfettante e pulito da tutti i detriti e nuovamente spruzzato con etanolo al 70%.
   4. In modo ottimale, sono necessarie due persone per la corretta ricezione dei topi immunocompromessi: una per gestire gli animali usando tecniche asettiche (il tecnico sterile) e una che gestirà gli oggetti contaminati (il tecnico non sterile). La persona non sterili dovrebbe comunque indossare un abito pulito a maniche lunghe; cappotto da laboratorio o smock; maschera; cofano; e guanti sterili per prevenire la contaminazione dell'interno sterile nel caso in cui debbano raggiungere il cofano.
   5. Preparare una cappa a flusso laminare come descritto in precedenza. È preferibile avere una cappa dedicata agli animali immunocompromessi. Si raccomanda che la cappa sia dotata di luci di sterilizzazione a raggi ultravioletti (UV) che possono essere utilizzate per sterilizzare l'interno della cappa tra un uso e l'altro. Un timer viene utilizzato per garantire che la superficie della cappa abbia un'adeguata esposizione ai raggi UV.
   6. L'esterno di tutte le forniture che vengono inserite nel cofano viene spruzzato con alcol al 70%, incluso l'imballaggio esterno di cibo, acqua e intasamento.
   7. I contenitori di spedizione vengono spruzzati con una soluzione di biossido di cloro prima di essere collocati nel cofano. Una volta messi nel cappuccio, devono rimanere aperti per 15-30 minuti.
   8. Il conduttore di animali designato apre il cibo sterile e l'acqua sotto il cofano.
   9. Il tecnico non sterilia apre la scatola di spedizione sotto il cofano. Il tecnico non sterili deve prestare attenzione per evitare il contatto con le superfici interne della cappa e l'interno della scatola di spedizione.
   10. Il conduttore di animali apre la gabbia sterile e prepara la gabbia posizionando cibo e acqua sulla parte superiore della gabbia. I topi vengono quindi rimossi dalla scatola di spedizione e collocati nella gabbia sterile.
   11. Le condizioni degli animali sono notate dal conduttore di animali sterili. Tutti gli animali che appaiono malati o hanno lesioni evidenti saranno segregati. Tutte le gabbie contrassegnate con animali che richiedono attenzione veterinaria saranno posizionate per la manipolazione, il cambio della gabbia o la manipolazione sperimentale per ultimo, per ridurre la potenziale contaminazione di altri animali.
   12. La persona non sterilista rimuoverà la gabbia popolata dal cofano. Le gabbie possono essere posizionate su un rack standard come gabbie statiche o su un rack ventilato come IPC. Negli IPC, i topi dovrebbero essere dotati di materiali di nidificazione aggiuntivi per aiutare con la regolazione termica.
   13. Il conduttore di animali dovrebbe cambiare i guanti dopo ogni contenitore di spedizione per evitare possibili contaminazioni incrociate di gruppi di animali. Il numero del contenitore di spedizione è registrato sulla scheda della gabbia per tracciare l'origine degli animali in caso di malattia.
   14. Le forniture inutilizzate possono essere salvate per un uso futuro a condizione che il contenitore originale possa essere risigillato. Il cibo inutilizzato viene rimosso dalla stanza.
   15. I topi devono sottoporsi a un periodo di acclimatazione minimo di una settimana prima dell'uso sperimentale.
2. Cambio gabbia per topi immunocompromessi
   1. Le gabbie per topi vengono cambiate almeno una volta alla settimana, o più spesso se ritenuto necessario.
   2. I passaggi per la preparazione della cappa, la preparazione della gabbia e i DPI del personale sono gli stessi del disimballaggio degli animali.
   3. Gli animali vengono trasferiti a mano o con l'uso di pinse di forza imbottite. Il conduttore di animali designato dovrebbe reglove dopo ogni 5-10 gabbie, se i guanti sono strappati o contaminati, o se un animale appare malato.
   4. Eventuali gabbie con animali che appaiono malati saranno posizionate alla fine dell'ordine di cambio della gabbia, per evitare la possibile esposizione di animali sani a patogeni o contaminanti.
   5. Se il cibo e/o l'acqua devono essere aggiunti alla gabbia prima del successivo cambio di gabbia programmato, deve essere fatto in modo asettico sotto il cofano preparato.

La cura e la manipolazione adeguate degli animali utilizzati nella ricerca biomedica è fondamentale per l'esito degli esperimenti. Regolamenti e linee guida stabilite dettano molte delle pratiche utilizzate. Tuttavia, sono necessarie misure aggiuntive per topi e ratti che hanno deficienze immunitarie per mitigare l'esposizione accidentale a patogeni opportunistici. Quando le pratiche aderiscono a procedure stabilite, la salute e il benessere degli animali da esperimento vengono migliorati e si ottengono risultati sperimentali migliori.

1. Belizário J.E. 2009. Immunodeficient Mouse Models: An Overview. The Open Immunology Journal. 2. 79-85.
2. Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.
3. Van Loo, P. 2001. Modulation of aggression in male mice: influence of cage cleaning regime and scent marks. In Male Management: Coping with Aggression Problems in Male Laboratory Mice. Surrey: UK.