Procedimentos de Cuidados Básicos

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN

Camundongos e ratos representam mais de 90% dos animais utilizados para pesquisa biomédica. O cuidado adequado desses animais de pesquisa é fundamental para o resultado de experimentos. Existem procedimentos gerais que se aplicam à maioria desses camundongos e ratos, mas alguns dos animais, como os imunocomprometidos, exigem medidas adicionais a serem tomadas para sustentá-los para experimentação.

Camundongos imunocomprometidos comumente usados incluem aqueles que naturalmente ocorreram em camundongos criados e aqueles que foram criados através da engenharia genética. Os primeiros camundongos imunocomprometidos usados na pesquisa eram ratos "nus". O rato BALB/c Nude (nu) foi descoberto em 1966, dentro de uma colônia BALB/c que produzia ratos sem cabelo e um timo. Estes camundongos atrímicos têm um sistema imunológico inibido que é desprovido de células T. O valor desse animal foi logo descoberto para uso em estudos de infecções microbianas, deficiências imunológicas e autoimunidade. Embora não seja tão comumente usado como o rato nu, há também um rato nu. O rato nu é deficiente de células T e mostra populações de células empobrecidas em áreas dependentes de timo de órgãos linfoides periféricos. Outro camundongo deficiente imunológico que ocorre naturalmente é o grave camundongo de imunodeficiência combinada (SCID). Estes camundongos têm um defeito que prejudica a produção de células B e T funcionais. Com a incapacidade de montar uma resposta imune adequada, esses camundongos podem servir como receptores de hospedeiro para transplantes de células humanas. Várias cepas de camundongos geneticamente modificadas com deficiências imunológicas estão disponíveis comercialmente. ¹ A gravidade da deficiência varia de acordo com a modificação genética; no entanto, todos os ratos e ratos imunocomprometidos são manuseados da mesma forma.

Este manuscrito descreverá o cuidado de animais imunocompetntes e imunocomprometidos. Serão discutidas moradia, dieta, requisitos ambientais e manejo para ambos os grupos de animais.

Habitação/Caging

Ratos e ratos são principalmente alojados em caixas de sapatos com um fundo sólido que contém material de cama. A gaiola típica do mouse shoebox fornece 75 polegadas quadradas de espaço no chão, o que é adequado para um máximo de cinco ratos adultos. No entanto, o design experimental pode exigir grupos de quatro ratos. Neste caso, os camundongos devem ser alojados ao receber em grupos de quatro, para evitar a interrupção de grupos sociais quando o experimento começar. Em geral, o corte de ratos permite um máximo de dois animais adultos adultos totalmente crescidos. Se os ratos devem ser alojados a longo prazo, eles devem ser estabelecidos em casas de pares.

As gaiolas podem ser estáticas ou ventiladas individualmente (IVC). As gaiolas estáticas são cobertas com uma tampa de barra de arame ou são instaladas em um rack sob uma prateleira que é então o topo da gaiola. O material do filtro é adicionado sobre a parte superior da gaiola, seja como um capô sobre a tampa da barra de arame, ou como uma folha de papel filtro sobre as prateleiras do rack. Os IVCs são configurais como uma gaiola, tampa de barra de arame e capô que são colocados em um rack que fornece fluxo de ar para dentro da gaiola. O uso de IVCs elimina a necessidade de mudar a gaiola com a maior frequência que as gaiolas estáticas são alteradas.

Os sistemas de gaiola padrão fornecem uma fonte de água e uma área para distribuição de alimentos. A água pode ser fornecida através de uma garrafa de água colocada no topo da gaiola ou através de um tubo de sipper que é um componente embutido na gaiola animal. Quando a gaiola é colocada em um rack, a água é transportada para o tubo de sipper para um sistema de rega automática que é projetado para atender às necessidades do animal em toda a instalação animal. O caging deve estar devidamente preparado para fornecer o cuidado adequado aos animais. Há alimentadores colocados dentro da gaiola animal, ou uma seção da tampa da barra de arame é usada para armazenamento de alimentos. Os alimentos devem ser colocados de tal forma que não sejam sujos pelos animais.

O Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório² (o "Guia") afirma que todos os implementos de caging devem ser higienizados pelo menos a cada 2 semanas. Algumas gaiolas e acessórios podem precisar ser trocados com mais frequência, como ditado pelo nível de odor e amônia no recinto. Em geral, os IVCs são programados para mudar a cada duas semanas, a menos que haja quatro ou mais machos ou uma fêmea com uma ninhada; esses gabinetes podem exigir mudanças semanais. Como a mudança da gaiola é uma oportunidade para os camundongos serem expostos a patógenos, a mudança do caging para camundongos deficientes imunológicos deve ser feita da forma mais rara possível.

Dieta

Existem muitas composições de dietas disponíveis com variações nos níveis de proteína, carboidratos e gordura. Normalmente, os alimentos devem ser compostos por 15-19% de proteína, 44% de carboidratos e 4-9% de gordura. Alimentos com maior teor de gordura são frequentemente usados para colônias de reprodução para melhorar a reprodução. Como o alimento pode ser uma fonte de contaminação para camundongos imunocomprometidos, deve ser esterilizado a vapor ou irradiado. Os alimentos submetidos ao processo de autoclavagem devem ser especialmente formulados para suportar o processo. No entanto, o processo de irradiação não altera o conteúdo dos alimentos.

A água é outra fonte potencial de contaminação para os animais imunes deficientes. A água deve ser processada através de uma autoclave ou filtração que inclui a água que passa por um filtro UV. Para esterilizar água em uma autoclave, garrafas individuais de água são cobertas com papel alumínio. As tampas das garrafas com tubos de sipper são esterilizadas separadamente em um saco de autoclave. A acidificação da água a um pH de 2,5-3 ajuda a controlar o crescimento de organismos bacterianos nas garrafas de água. A água é acidificada adicionando duas gotas de ácido clorídrico de 12 mol (M) (HCl) a oito litros de água de osmolalidade invertida (RO). Sistemas de rega automática podem ser usados com uma série de filtragem em todo o sistema que inclui filtros de partículas e um filtro de luz ultravioleta.

Ambiente

As condições ambientais dentro de uma unidade de cuidados com animais devem ser rigorosamente controladas. Regulamentos e diretrizes federais estabeleceram as normas para o cuidado e manuseio de animais comumente usados. Iluminação, temperatura ambiente, umidade e fluxo de ar são fornecidos para atender às necessidades fisiológicas dos animais. Com exceção da necessidade de um leve aumento da temperatura ambiente, os parâmetros para os animais imunocomprometidos são os mesmos dos animais convencionais. Os animais nus atímicos também requerem roupas de cama adicionais e materiais de ninho do tipo papel triturados em suas gaiolas para ajudar na termregulação.

Os quartos de animais devem ser mantidos a uma temperatura entre 68-72°F com um nível de umidade de 40-60%. ^{2 Níveis} de umidade abaixo de 40% podem resultar em rabo-de-cavalo de camundongos e ratos, uma condição que faz com que a pele da cauda seque até o ponto de constrição ao redor da cauda, o que pode levar ao sloughing da cauda. Os ciclos de iluminação devem ser definidos para evitar estressores aos animais causados por fotoperióduos inadequados ou intensidade de luz. Normalmente, os fotoperióduos são 12 horas de folga e 12 horas de folga. A intensidade da iluminação deve variar de acordo com a atividade na sala. Quando os técnicos estão trabalhando na sala dos animais, podem ser utilizados níveis mais altos de iluminação. No entanto, a iluminação deve ser reduzida para aproximadamente 325 lux uma vez que toda a atividade é concluída. ² As luzes devem estar em temporizadores e os ciclos verificados através de sistemas de monitoramento. Conforme orientado pelo Guia, os quartos de animais devem ter um mínimo de 10-15 mudanças de ar de ar 100% fresco por hora. ² As mudanças de ar diminuem micróbios e odores na sala dos animais. Em quartos de animais densamente povoados, o número de mudanças de ar por hora pode precisar ser aumentado.

Os fatores ambientais no nível da gaiola incluem o tipo de entalhe, o substrato utilizado dentro da gaiola, o sistema de entrega de água e a dieta. A habitação social é obrigatória, a menos que cientificamente justificada, ou um animal seja incompatível com todos os outros. As disposições de enriquecimento ambiental, como cabanas de papel e materiais de ninho, permitem que os animais expuserem comportamentos específicos das espécies, o que, por sua vez, diminui o nível de estresse e aumenta o bem-estar geral dos animais. Os materiais de aninhamento também fornecem uma área de sono saturada em feromônios calmantes que auxiliam na carcaça de vários ratos machos na mesma gaiola. A área de aninhamento é movida para a gaiola limpa após a mudança da gaiola para ajudar a prevenir a agressão nos machos à medida que são introduzidos em um novo ambiente. ³

1. Manusear camundongos imunocompetuntes (convencionais)

Foi demonstrado que as doenças imunológicas dos camundongos são muito semelhantes às dos humanos. ² Como esses animais possuem capacidades imunológicas limitadas, procedimentos no manuseio e cuidado desses animais foram projetados para minimizar o risco de doenças infecciosas através do uso de controles de engenharia, equipamentos de proteção individual para a equipe de cuidados com animais e procedimentos operacionais padrão; estes mitigam a contaminação do caging e outros equipamentos com os quais os animais estão em contato.

1. Desempacotamento de contêineres de transporte: Receber animais de outras instituições ou vendedores de animais representa um risco para os animais já alojados dentro da instalação animal. Durante o trânsito, as caixas de transporte de animais podem entrar em contato com agentes patogênicos. Portanto, deve ser realizado um procedimento adequado ao desempacotar os contêineres de transporte.
   1. Os requisitos mínimos de Equipamentos de Proteção Individual (EPI) são luvas, jaleco limpo ou esfregões, máscara de partículas e óculos de segurança ao manusear os animais.
   2. Selecione a gaiola apropriada, incluindo a tampa da barra de arame e a parte superior da barreira. A gaiola deve ser mobiliada com materiais apropriados para cama e aninhamento. Todos os caging devem ser preparados e colocados na área receptora antes da chegada dos animais.
   3. Ao chegar, as caixas de transporte são colocadas em uma sala segura e controlada pela temperatura. Em seguida, examine o recipiente em busca de danos.
   4. Desinfete as superfícies externas do recipiente de transporte com um produto de dióxido de colina para destruir quaisquer patógenos nocivos. Certifique-se de que o desinfetante esteja em contato com a caixa de acordo com as recomendações do fabricante, geralmente de 15 a 30 minutos.
   5. Coloque o contêiner em uma Estação de Transferência de Animais (ATS). O ATS fornece fluxo de ar filtrado pelo HEPA dentro do capô que fornece proteção alérgena, criando uma barreira de ar de vácuo entre o usuário e a zona de trabalho. Isso garante uma exposição mínima ao material de cama animal/dander e gaiola. O ar unidirecional também protege os animais do ar da sala circundante, minimizando a chance de contaminação.
   6. Uma vez aberto o contêiner de transporte, avalie a saúde geral dos animais. Anote qualquer animal ferido ou doente.
   7. Coloque os animais nas gaiolas montadas nos tamanhos de grupo adequados. O agrupamento deve estar de acordo com as normas espaciais e o protocolo experimental ao qual serão atribuídos.
   8. Cubra a gaiola com a tampa da barra de arame. Fixar o divisor na tampa da barra de arame para criar duas áreas na tampa.
   9. Selecione a comida apropriada e coloque a comida em um lado da tampa da barra de arame. Deixe o segundo lado aberto para permitir uma melhor circulação de ar.
   10. A água será fornecida através de garrafas de água ou de um sistema de rega automática. Garrafas de água são usadas para camundongos recém-desmamados para garantir que eles sejam capazes de manter seus níveis de hidratação. Para o IVC com rega automática, carregue o tubo de rega antes de colocá-lo no rack.
   11. Coloque a gaiola em um rack. Se usar IVCs, verifique se a gaiola está totalmente presa no rack e se o tubo de sipper está preso ao sistema de rega.
2. Gaiola mudando ratos convencionais
   1. Gaiolas de animais são trocadas em um ATS. O ATS é desinfetado no final de cada sessão.
   2. Apenas uma gaiola pode ser aberta de cada vez.
   3. O caging preparado com os materiais apropriados de cama e ninho é trazido para a sala dos animais. Um pequeno número de gaiolas são colocadas no ATS.
   4. As gaiolas IVC com tubos internos de sipper devem ser carregadas para forçar a água no sípper para remover o espaço morto de ar no tubo de sipper. Se não estiverm devidamente carregados, os ratos podem não ser capazes de fornecer pressão suficiente sobre o tubo de sipper para remover o ar dele.
   5. Os requisitos mínimos de Equipamentos de Proteção Individual (EPI) são luvas, jaleco limpo ou esfregões, máscara de partículas e óculos de segurança ao manusear os animais.
   6. Uma gaiola de animais a serem trocados é colocada em uma nova gaiola, e depois no ATS.
   7. Os animais são transferidos à mão ou com o uso de fórceps acolchos. Luvas são trocadas entre gaiolas ou entre grupos de ratos. Luvas também podem ser desinfetadas com um produto químico nãotóxico entre as gaiolas.
   8. Foi demonstrado que transferir a área de aninhamento dos camundongos para uma gaiola limpa auxilia na transição para a gaiola limpa, especialmente para machos abrigados em grupo. Outros itens de enriquecimento também são transferidos para a nova gaiola.
   9. Uma vez que o topo da gaiola ou alimentador é colocado na nova gaiola, a comida é adicionada.
   10. A parte superior da barreira é colocada na nova gaiola e a gaiola é devolvida ao rack.
   11. As gaiolas IVC devem ser adequadamente encaixadas no rack para garantir que as válvulas de ar e água estejam engajadas.

2. Manipulação de camundongos imunocomprometidos

1. Desempacotamento de contêineres de transporte
   1. Animais imunocomprometidos devem ser descompactados em condições estéreis. Todos os indivíduos que manuseam camundongos deficientes imunológicos devem usar um vestido esterilizado a vapor, máscara, capô de cabelo e luvas estéreis. A técnica asséptica deve ser usada o tempo todo ao entregar esses animais.
   2. Todos os equipamentos e caging deveriam ter sido esterilizados por vapor, radiação UV ou quimicamente esterilizados com um molho de 70% de etanol por pelo menos 30 minutos Há duas opções para o ensilamento estéril: o caging padrão que foi embrulhado e o vapor esterilizado, ou o caging que é esterilizado normalmente através da irradiação pelo fornecedor. Estas gaiolas são de um uso, unidades descartáveis.
   3. Antes de manipular ratos sob o capô de fluxo laminar, o capô é pulverizado com 70% de etanol com o soprador operando. O soprador de capô deve permanecer sempre ligado para manter o ambiente estéril. Após cada uso, o capô é pulverizado com um desinfetante e limpo de todos os detritos e novamente pulverizado com 70% de etanol.
   4. Na melhor das condições, duas pessoas são necessárias para o recebimento adequado dos camundongos imunocomprometidos: uma para manusear os animais usando técnicas assépticas (o técnico estéril) e outra que manuseará itens contaminados (o técnico não estéril). A pessoa não-estérile ainda deve usar um vestido limpo, de mangas compridas; jaleco ou jaleco; máscara; capô; e luvas estéreis para evitar a contaminação do interior estéril caso precisem alcançar o capô.
   5. Prepare um capô de fluxo laminar como descrito anteriormente. É preferível ter um capuz dedicado a animais imunocomprometidos. Recomenda-se que o capô seja equipado com luzes de esterilização ultravioleta (UV) que podem ser usadas para esterilizar o interior do capô entre os usos. Um temporizador é utilizado para garantir que a superfície do capô tenha exposição adequada aos raios UV.
   6. O exterior de todos os suprimentos que são colocados no capô são pulverizados com 70% de álcool, incluindo a embalagem externa de alimentos, água e caging.
   7. Os contêineres de transporte são pulverizados com uma solução de dióxido de cloro antes de serem colocados no capô. Uma vez colocados no capô, eles devem permanecer abertos por 15-30 minutos.
   8. O manipulador de animais designado abre o alimento estéril e a água sob o capô.
   9. O técnico não-estérico abre a caixa de transporte sob o capô. Deve-se tomar cuidado com o técnico não-estérile para evitar o contato com as superfícies internas do capô e o interior da caixa de transporte.
   10. O tutor animal abre a gaiola estéril, e prepara a gaiola colocando comida e água no topo da gaiola. Os ratos são então removidos da caixa de transporte e colocados na gaiola estéril.
   11. A condição animal é notada pelo manipulador de animais estéreis. Todos os animais que pareçam doentes ou tiverem ferimentos óbvios serão segregados. Todas as gaiolas marcadas com animais que necessitam de atenção veterinária serão colocadas para manuseio, mudança de gaiola ou manipulação experimental por último, para reduzir a contaminação potencial de outros animais.
   12. A pessoa não-estérmula removerá a gaiola povoada do capô. As gaiolas podem ser colocadas em um rack padrão como gaiolas estáticas, ou em um rack ventilado como IVCs. Nos IVCs, os camundongos devem ser fornecidos com materiais adicionais de aninhamento para auxiliar na regulação térmica.
   13. O manipulador de animais deve trocar luvas após cada contêiner de transporte para evitar uma possível contaminação cruzada de grupos de animais. O número do contêiner de transporte é registrado no cartão da gaiola para rastrear a origem dos animais em caso de doença.
   14. Suprimentos não utilizados podem ser salvos para uso futuro, desde que o recipiente original possa ser recados. Comida não comida é removida da sala.
   15. Os camundongos devem passar por um período mínimo de uma semana de aclimatação antes do uso experimental.
2. Mudança de gaiola para camundongos imunocomprometidos
   1. As gaiolas do rato são trocadas pelo menos uma vez por semana, ou mais frequentemente, se consideradas necessárias.
   2. Etapas para preparação do capô, preparação de gaiolas e EPI pessoal são as mesmas para a desempacotamento dos animais.
   3. Os animais são transferidos manualmente ou com o uso de fórceps acolchos. O manipulador de animais designado deve reglove após cada 5-10 gaiolas, se as luvas estão rasgadas ou contaminadas, ou se um animal parece doente.
   4. Quaisquer gaiolas com animais aparecendo doentes serão colocadas no final da ordem de mudança da gaiola, para evitar a possível exposição de animais saudáveis a patógenos ou contaminantes.
   5. Se a comida e/ou a água devem ser adicionadas à gaiola antes da próxima mudança programada da gaiola, deve ser feita asepticamente sob o capô preparado.

O cuidado adequado e o manuseio dos animais utilizados na pesquisa biomédica são cruciais para o resultado dos experimentos. Regulamentos e diretrizes estabelecidas ditam muitas das práticas utilizadas. No entanto, medidas adicionais são necessárias para camundongos e ratos que têm deficiências imunológicas para mitigar a exposição acidental a patógenos oportunistas. Quando as práticas aderem aos procedimentos estabelecidos, a saúde e o bem-estar dos animais experimentais são aprimorados e melhores resultados experimentais são alcançados.

1. Belizário J.E. 2009. Immunodeficient Mouse Models: An Overview. The Open Immunology Journal. 2. 79-85.
2. Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.
3. Van Loo, P. 2001. Modulation of aggression in male mice: influence of cage cleaning regime and scent marks. In Male Management: Coping with Aggression Problems in Male Laboratory Mice. Surrey: UK.