Method Article
La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.
L'attività cerebrale, i segnali elettrochimici passati tra i neuroni, è determinata dai modelli di connettività delle reti neuronali e dalla morfologia dei processi e delle sottostrutture all'interno di questi neuroni. Come tale, gran parte di ciò che è noto sulla funzione cerebrale è sorto insieme agli sviluppi nelle tecnologie di imaging che consentono ulteriori informazioni su come i neuroni sono organizzati e collegati nel cervello. I miglioramenti nella pulizia dei tessuti hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di spesse fette di cervello, facilitando la ricostruzione morfologica e le analisi delle sottostrutture neuronali, come i pergole dendritiche e le spine. In parallelo, i progressi nel software di elaborazione delle immagini forniscono metodi per analizzare rapidamente set di dati di imaging di grandi dimensioni. Questo lavoro presenta un metodo relativamente rapido di elaborazione, visualizzazione e analisi di spesse fette di tessuto neurale etichettato ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY, la microscopia confocale e l'analisi delle immagini. Questo protocollo faciliterà gli sforzi verso la comprensione dei modelli di connettività e delle morfologie neuronali che caratterizzano i cervelli sani e i cambiamenti in queste caratteristiche che sorgono negli stati cerebrali patologici.
Comprendere l'organizzazione spaziale, i modelli di connettività e la morfologia di strutture biologiche tridimensionali complesse è essenziale per delineare le funzioni di cellule e tessuti specifici. Ciò è particolarmente vero nelle neuroscienze, in cui è stato dedicato un enorme sforzo alla costruzione di mappe neuroanatomiche ad alta risoluzione del sistema nervoso centrale1,2. Un attento esame dei neuroni che compongono queste mappe produce varie morfologie, con connessioni e posizioni che riflettono la funzione di questi diversi insiemi di neuroni3,4. Inoltre, lo studio delle strutture subcellulari, in particolare delle spine dendritiche, può informare la maturità delle sinapsi, riflettendo così i processi di sviluppo e gli stati di malattia neurologica5,6,7. Pertanto, gli approcci che migliorano la risoluzione e la produttività dell'imaging sono essenziali per comprendere meglio la funzione cerebrale a tutte le scale.
Recenti progressi hanno ampliato il toolkit molecolare e genetico per marcare e manipolare popolazioni di neuroni. Lo sviluppo di nuovi marcatori fluorescenti, combinato con nuovi metodi di introduzione di questi marcatori nei neuroni, consente l'etichettatura differenziale di popolazioni di neuroni interagenti all'interno dello stesso animale o campione di cervello8,9,10,11. Poiché la luce è dispersa da lipidi opachi e dato l'alto contenuto lipidico del tessuto cerebrale, l'imaging delle popolazioni neuronali è stato principalmente limitato a sezioni sottili o si è affidato a tecniche avanzate di microscropia (ad esempio, microscopia confocale, multi-fotone e a foglio di luce) per l'immagine di strutture profonde. Tuttavia, questi sforzi sono stati notevolmente rafforzati dai progressi nelle tecniche di pulizia dei tessuti. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) è una di queste tecniche, in cui i tessuti di interesse vengono infusi con monomeri di idrogel (acrilammide e bis-acrilammide) e quindi lavati con detergenti12. I monomeri di idrogel si ibridano per creare uno scaffold idrogel 3D stabile che è otticamente trasparente e permeabile alle etichette delle macromolecole. Gli acidi nucleici e le proteine sono mantenuti all'interno della matrice ibridata, mentre i lipidi vengono rimossi dai lavaggi detergenti (Figura 1). Ciò si traduce in un tessuto stabile che è abbastanza rigido da mantenere la forma e l'orientamento originali delle cellule e delle molecole non lipidiche, mentre otticamente abbastanza trasparente da immaginare facilmente strutture profonde ad alta risoluzione. Questo mantenimento della struttura e dell'orientamento dei tessuti consente l'imaging di fette spesse, preservando così le connessioni cellula-cellula e le relazioni spaziali. Inoltre, poiché la posizione e la disponibilità di proteine e acidi nucleici viene mantenuta durante il processo di compensazione, i tessuti eliminati sono in grado di contenere marcatori basati sull'espressione, nonché etichette esogene. Pertanto, CLARITY si presta come un metodo potente per l'imaging di grandi quantità di strutture cerebrali profonde e le connessioni tra queste strutture ad alta risoluzione.
L'uso di CLARITY migliora notevolmente gli approcci all'imaging delle popolazioni neuronali. Questa tecnica è particolarmente abile nel generare grandi quantità di dati di imaging. CLARITY funziona bene con più forme di fluorescenza a base di proteine. Questo protocollo utilizza un approccio basato sul lentivirale per etichettare scarsamente le cellule con EGFP e tdTomato; tuttavia, gli alleli reporter transgenici che esprimono tdTomato o EGFP per etichettare le cellule per la ricostruzione sono stati utilizzati di routine. È importante scegliere un fluoroforo che sia fotostali e luminoso (ad esempio, EGFP o tdTomato). Inoltre, l'utilizzo di un forte promotore per esprimere il fluoroforo produce un contrasto e una qualità dell'immagine superiori. Gli svantaggi di questa tecnica derivano dal fatto che analizzare correttamente questa grande quantità di dati può richiedere sia lavoro che tempo. Microscopi specializzati possono aiutare a migliorare la produttività e ridurre il carico di lavoro. Tuttavia, la costruzione, la proprietà e / o l'uso di microscopi avanzati sono spesso proibitivi per molti laboratori. Questo lavoro presenta un metodo ad alto rendimento, relativamente rapido e semplice per visualizzare grandi quantità di tessuto neurale ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY di grandi sezioni, combinata con la microscopia confocale standard. Questo protocollo descrive questo approccio attraverso i seguenti passaggi: 1) sezionare e preparare il tessuto neurale, 2) eliminare il tessuto, 3) montare il tessuto, 4) imaging delle fette preparate e 5) elaborare immagini di fette complete utilizzando la ricostruzione e l'analisi del software di visualizzazione al microscopio (Figura 2). Questi sforzi si traducono in immagini ad alta risoluzione che possono essere utilizzate per analizzare popolazioni di neuroni, modelli di connessione neuronale, morfologia dendritica 3D, abbondanza e morfologia della colonna vertebrale dendritica e modelli di espressione molecolare all'interno del tessuto cerebrale intatto.
Il seguente protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali per il Baylor College of Medicine.
1. Dissezione e preparazione dei tessuti
2. Pulizia dei tessuti
3. Preparazione e montaggio del tessuto eliminato
4. Imaging di campioni di tessuto cancellati
5. Elaborazione delle immagini e quantificazione 3D mediante software di analisi al microscopio
NOTA: i pacchetti software di analisi delle immagini microscopiche sono potenti strumenti per la visualizzazione e l'elaborazione tridimensionale delle immagini. Molti di questi programmi sono perfettamente adatti per la gestione di set di dati di grandi dimensioni generati dall'imaging di campioni di tessuto cancellati. I seguenti passaggi e le figure associate corrispondono al flusso di lavoro del software Imaris.
Dopo l'acquisizione dell'immagine, la morfologia cellulare rappresentativa è stata analizzata utilizzando statistiche incorporate e classificando gli script all'interno del software di analisi. I dati raccolti (Figura 6A) riflettono che il neurone 2 ha una struttura dendritica più grande con una maggiore densità di spine. Nel complesso, i dati suggeriscono che il neurone 2 ha una struttura dendritica più complessa rispetto al neurone 1. Per corroborare questo risultato, è stata eseguita un'analisi standard di Sholl, che afferma che il neurone 2 è più dendricomente complesso del neurone 1 come indicato dall'aumento del numero di intersezioni di Sholl a 50-100 μm dal soma (Figura 6B). Infine, le spine dendritiche dei due neuroni ripresi sono state classificate in quattro categorie principali in base alle loro forme e dimensioni complessive. Le spine che presentano forme più simili a filopodi sono probabilmente sottotipi di colonna vertebrale più immaturi. Le spine con teste definite, chiamate spine di funghi, probabilmente contengono sinapsi più sviluppate e mature7. L'analisi qui presentata mostra che il neurone 1 contiene una percentuale maggiore di spine simili ai filopodi rispetto al neurone 2 (Figura 6C). Pertanto, in base alla morfologia, il neurone 2 è più maturo dal punto di vista dello sviluppo in quanto è più grande, più altamente ramificato e contiene una maggiore densità di spine mature.
Figura 1: Il protocollo CLARITY rende i tessuti trasparenti mantenendo la struttura intrinseca e le relazioni spaziali molecola-molecola. (A) Orientamento originale del tessuto neuronale e dei componenti intercellulari prima della compensazione. (B) I monomeri di idrogel (linee viola) vengono infusi nel tessuto e polimerizzati in una rete di idrogel. Il tessuto e la rete idrogel sono reticolati tramite fissazione di formaldeide. (C) Il tessuto viene quindi lavato con soluzioni detergenti ioniche mentre esposto a campi elettrici. Durante questo processo, le micelle detergenti rimuovono le molecole lipidiche dal tessuto, lasciando dietro di sé una rete reticolata di idrogel trasparente e biomolecole. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma di flusso del protocollo, diagramma della preparazione del tessuto, della pulizia, del montaggio, dell'imaging e dell'elaborazione delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Costruzione di camere di montaggio per campioni di tessuto disboscati. (A) Eliminato l'intero cervello in PBS prima dell'immersione in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. (B) Brain slice in soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. (C) Camera di imaging per campioni di tessuto di grandi e piccoli dimensioni. Le camere possono essere realizzate utilizzando una varietà di materiali tra cui, ma non solo, plastiche stampate in 3D e tubi conici tagliati. (D) Camera di imaging per l'imaging dell'intero cervello o dell'emisfero, utilizzando un tubo conico da 50 ml come sollievo prima di versare l'agarose. (E) Camera di imaging dell'intero cervello o emisfero con agarose completamente impostato; questa configurazione è ottimale per obiettivi di immersione di barile di grandi dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Acquisire set di dati di grandi dimensioni di alta qualità da campioni di tessuto cancellati. (A) Impostazioni di acquisizione delle immagini utilizzate per l'imaging ad alta risoluzione di intere cellule. Il foro stenopeico era completamente chiuso per consentire sezioni ottiche fini. La velocità di scansione è stata determinata empiricamente in base ai tempi di permanenza ottimali dei pixel. (B) Impostazioni del percorso luminoso: queste dipenderanno dal fluoroforo e dall'attrezzatura utilizzata. (C) impostazioni Z-stack; è stato utilizzato un fine z-step per acquisire quante più informazioni possibili nella direzione z. (D) Proiezione massima rappresentativa; la barra della scala rappresenta 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi 3D dei dendriti nel software di analisi. (A) Vista laterale di uno z-stack di 600 μm acquisito da un tessuto di 1 mm di spessore che esprime tdTomato; la barra della scala rappresenta 100μm. (B) Vista dall'alto dello stesso z-stack acquisito nel pannello A; la barra della scala rappresenta 100μm. (C) Immagine acquisita confocale del tessuto che esprime EGFP. I file di immagine possono essere importati direttamente nel software di analisi e pre-elaborati per una maggiore qualità dell'immagine; la barra della scala rappresenta 25 μm. (D) La sottrazione di soglia viene utilizzata per rimuovere il segnale di fondo coerente presente in C. (E) Tracciatura del filamento e identificazione della colonna vertebrale: questo processo è meglio se eseguito semi-automatico con la funzione di auto-profondità controllata. Le spine sono state poi etichettate a mano dopo la ricostruzione completa della dendrite; la barra della scala rappresenta 25 μm. (F) Classificazione della colonna vertebrale utilizzando un'estensione MATLAB integrata. Le spine sono state codificate a colori in base alla loro morfologia; le spine tozze sono rosse; le spine dei funghi sono verdi; le spine lunghe e sottili sono blu; filopodia sono viola; la barra della scala rappresenta 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati rappresentativi. (A) Tabella delle misure morfologiche comuni generate automaticamente dal programma di analisi selezionato. (B) Numero di intersezioni di Sholl generate dalle statistiche del programma. (C) Grafico a torta che rappresenta la distribuzione delle morfologie della colonna vertebrale dendritica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Soluzione | Composizione | Note |
Soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione | 80 g di histodenz | pH a 7,5 con NaOH |
60 mL di tampone fosfato 0,02 M | Conservare a 4 °C | |
0,01% di azide di sodio | Adattato da Marx, V. Nature Methods volume 11, pagine 1209-1214 (2014) | |
Idrogel | 13,33 ml di acrilammide al 30% (no-bis) | Mescolare insieme su ghiaccio, altrimenti la soluzione potrebbe iniziare a polimerizzare |
10 ml di PBS 10x | Aliquota e conservazione a -20 °C | |
250 mg di VA-044 | ||
76,66 mL di ddH2O |
Tabella 1: Ricette per la soluzione di corrispondenza delle immagini rifrattive e la soluzione idrogel. Sono elencate la composizione della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione e l'idrogel.
Prima dell'avvento delle tecniche contemporanee di pulizia dei tessuti, lo studio della morfologia neuronale consisteva nel sezionamento, nell'imaging e nella ricostruzione di sezioni molto sottili adiacenti. L'uso della pulizia del tessuto elettroforetico in combinazione con l'imaging confocale fornisce una visione libera della morfologia neuronale completa. Dagli alberi dendritici intatti, fino al più piccolo bouton sinaptico, l'imaging e la quantificazione della morfologia neuronale non sono mai stati più fattibili.
La preparazione del tessuto cerebrale eliminato è semplice e richiede solo un pezzo di attrezzatura specializzata. Il tessuto eliminato e ripreso utilizzando questo protocollo sovverte la necessità di noiose sezioni sottili, manipolazione e montaggio, riducendo drasticamente il tempo dalla sperimentazione all'acquisizione dell'immagine. Inoltre, il tessuto ripreso senza sezionamento rimane più fedele alle strutture originali, in quanto non vi sono fonti di danno o necessaria ricostruzione dell'immagine post-hoc. Infine, questo protocollo consente di risparmiare tempo consentendo l'imaging simultaneo di caratteristiche su larga scala come gli alberi dendritici insieme a caratteristiche submicroniche su piccola scala come le spine.
Un'importante raccolta di passaggi in questo protocollo sono i passaggi di lavaggio che seguono il processo di compensazione. Questi passaggi sono fondamentali per rimuovere tutte le tracce del tampone di compensazione elettroforetica SDS. Se il tessuto eliminato non è sufficientemente lavato, si formeranno precipitati durante la fase di montaggio. Questi precipitati possono talvolta essere risolviti incubando il tessuto a 37-55 °C per un breve periodo. Tuttavia, se i precipitati persistono, disperderanno la luce, producendo scarsa profondità e qualità dell'immagine.
Il montaggio di grandi pezzi di tessuto rappresenta una sfida rispetto alla tradizionale imaging a fette sottili. Qui presentiamo più processi per montare tessuti di grandi dimensioni, che dipendono dalla tecnica di imaging, dalle proprietà della lente dell'obiettivo e dalle dimensioni del campione di tessuto. In primo luogo, è importante utilizzare una lente obiettiva adatta per l'immersione nello specifico mezzo di corrispondenza dell'indice di rifrazione utilizzato e che abbia una distanza di lavoro sufficiente per l'imaging di campioni di tessuto di grandi dimensioni. Questo protocollo è in gran parte limitato dalle proprietà ottiche della piattaforma di imaging utilizzata, in particolare dalla distanza di lavoro degli obiettivi. L'imaging in profondità è facilmente ottenuto utilizzando questo protocollo. Tuttavia, se non è disponibile un obiettivo con una distanza di lavoro sufficiente, il tessuto stesso presenterà una barriera fisica all'acquisizione di immagini di grandi dimensioni. La prossima decisione importante è la tecnica di imaging. La microscopia a due fotoni viene in genere utilizzata per la sua superba qualità dell'immagine, la profondità di imaging e la velocità di acquisizione. La microscopia a due fotoni consente l'imaging fino a 1 mm nel tessuto cancellato CLARITY senza perdita di qualità dell'immagine, come dimostrato nella Figura 5A,B. Tuttavia, risultati molto simili possono essere ottenuti quando si utilizza la microscopia confocale tradizionale anche se con un sacrificio alla profondità di imaging rispetto alla microscopia a due fotoni (Figura 5C,D).
In sintesi, questo metodo fornisce una piattaforma robusta e conveniente per analizzare la morfologia neuronale sia su larga che su piccola scala. Inoltre, questo metodo riduce in gran parte i tempi di gestione ed elaborazione, fornendo al contempo immagini tridimensionali più accurate e complete. La morfologia cellulare è un proxy comunemente usato per valutare la funzione del circuito e la salute alla base di molte malattie e patologie13,14,15. L'imaging della morfologia dei neuroni è potente, semplice e adatto per il test in una moltitudine di modelli di malattia.
Gli autori non hanno nulla da rivelare in questo momento.
Vorremmo ringraziare il nucleo virale NRDDC presso l'Istituto neurologico Jan e Dan Duncan per la produzione di AAV e lentivirus utilizzati in questi esperimenti. Inoltre, vorremmo ringraziare il Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine per l'allevamento dei topi e la manutenzione generale dei topi utilizzati. Vorremmo ringraziare l'American Heart Association per il loro sostegno con il numero di premio 20PRE35040011 e BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists per il loro supporto (PJH). Infine, vorremmo ringraziare Logos per aver fornito al nostro laboratorio il sistema di pulizia dei tessuti elettroforetici Logos X-Clarity.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
VA-044 | Wako | 925-41020 | |
X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon