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L'obiettivo di questo protocollo è quello di preparare, purificare e caratterizzare microbolle riempite di gas (agenti di contrasto mirati per l'imaging molecolare ad ultrasuoni). Vengono descritti due sistemi di targeting: bolle biotinilate aderenti alla streptavidina e microbolle peptidiche RGD cicliche che si legano a αv β3, un noto biomarcatore di neovascolarizzazione tumorale.
Il targeting delle microbolle (agenti di contrasto a ultrasuoni per l'imaging molecolare) è stato studiato per più di due decenni. Tuttavia, i metodi di preparazione delle microbolle e di targeting dell'attacco del ligando sono ingombranti, complicati e lunghi. Pertanto, è necessario semplificare la procedura di preparazione delle microbolle mirata per avvicinarla alla traslazione clinica. Lo scopo di questa pubblicazione è quello di fornire una descrizione dettagliata e una spiegazione dei passaggi necessari per la preparazione mirata delle microbolle, la caratterizzazione funzionale e il test. Viene presentata una sequenza delle procedure ottimizzate e semplificate per due sistemi: un modello di coppia di targeting biotina-streptavidina e un peptide RGD ciclico che ha come bersaglio la proteina ricombinante αvβ3 , che è sovraespressa sul rivestimento endoteliale della neovascolarizzazione tumorale.
Qui, mostriamo quanto segue: accoppiamento covalente del ligando di targeting a un ancoraggio lipidico, valutazione della qualità del reagente e test che confermano il completamento con successo della reazione; preparazione del mezzo precursore acquoso contenente i componenti della conchiglia delle microbolle, seguita dalla preparazione delle microbolle mediante amalgama; valutazione dell'efficacia del trasferimento lipidico sul guscio dello stabilizzatore di microbolle; regolazione della distribuzione delle dimensioni delle microbolle mediante flottazione a gravità normale per rimuovere le microbolle più grandi che potrebbero essere dannose per l'uso in vivo; valutazione della distribuzione dimensionale delle microbolle mediante rilevamento elettrozonale; valutazione del legame mirato delle microbolle alla superficie rivestita di recettore in un test di saggio di legame statico (in un piatto capovolto); e valutazione del legame mirato delle microbolle alla superficie rivestita di recettore in un test in camera di flusso a piastre parallele.
L'imaging molecolare con microbolle mirate è in fase di ricerca e test da oltre due decenni. Il concetto generale è semplice: le microbolle riempite di gas che possiedono un'affinità selettiva per il biomarcatore molecolare specifico dell'endotelio vascolare nell'area della malattia vengono iniettate per via endovenosa. Queste particelle circolano e si accumulano nel bersaglio (ad esempio, la neovascolarizzazione tumorale o l'area del danno infiammatorio ischemico). Le microbolle aderenti vengono quindi rilevate mediante ecografia con contrasto. I primi sforzi di ricerca concettuale del secolo scorso 1,2 stanno ora gradualmente progredendo verso l'adozione clinica: hanno raggiunto la fase di sperimentazione clinica su media scala solo pochi anni fa 3,4. Lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire una spiegazione dettagliata sulla preparazione e la caratterizzazione di tali microbolle mirate, sulla base di due esempi pubblicati 1,5.
La procedura per la preparazione del peptide-PEG-fosfolipide, un componente cruciale per la formulazione di queste microbolle mirate, è integrata con la descrizione del controllo di qualità del reagente, come richiesto per il completamento con successo della reazione. Sfortunatamente, alcuni fornitori di reagenti lipidici a base di esteri attivi forniscono materiale che viene idrolizzato all'arrivo e quindi non è in grado di partecipare alla formazione del legame ammidico. Vengono fornite le informazioni sulla quantità di materiale lipidico trasferito sul guscio delle microbolle dal mezzo acquoso durante la preparazione delle microbolle, nonché la tecnica per ottenere queste informazioni.
È importante preparare microbolle con una distribuzione granulometrica relativamente stretta: la co-presenza di grandi microbolle nel terreno iniettabile per i test intravascolari in vivo può portare all'intasamento della microvascolarizzazione; L'accumulo aspecifico di microbolle che bypassano gli shunt polmonari potrebbe causare un aumento tissutale aspecificofalso positivo 6, che viene evitato rimuovendo microbolle di dimensioni maggiori. Pertanto, viene presentata una semplice procedura per ottenere la selezione della dimensione delle particelle, integrata dalla descrizione di un metodo per valutare la concentrazione e la distribuzione dimensionale delle particelle con un contatore di particelle.
Il primo protocollo di test per la valutazione del targeting delle microbolle, come presentato di seguito, descrive un sistema puramente modello, con microbolle biotinilate mirate alla superficie rivestita di streptavidina1. Il secondo protocollo si basa su un manoscritto che descrive la preparazione semplificata di microbolle mirate a peptidi, decorate con un peptide RGD ciclico che possiede un'affinità specifica verso αv β3, un biomarcatore molecolare della neovascolarizzazione tumorale5. È stato dimostrato che le microbolle decorate con questo ciclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys], cioè il peptide c(RGDfK) con la tecnica presentata, mirano alla neovascolarizzazione tumorale e ottengono l'imaging molecolare ad ultrasuoni in un modello di tumore murino.
1. Accoppiamento covalente del peptide a NHS-PEG-DSPE
2. Preparazione di microbolle per amalgama
3. Testare il trasferimento dei lipidi DiI dal mezzo acquoso micellare al guscio della bolla
4. Regolazione della distribuzione delle dimensioni delle microbolle
5. Valutazione della distribuzione dimensionale delle microbolle
6. Test del targeting a microbolle in vitro in un saggio di aderenza/ritenzione
7. Test del targeting delle microbolle in vitro: valutazione dei saggi dinamici di adesione/ritenzione in una camera di flusso a piastre parallele
NOTA: Testiamo l'adesione delle bolle biotinilate allo strato di streptavidina con l'ecografia.
Accoppiamento covalente di peptide e lipide
Il completamento della reazione e la formazione del prodotto desiderata sono stati confermati da TLC. Un controllo peptidico separato non reagito non si è spostato verso l'alto durante la TLC: è stato trattenuto all'inizio e il suo punto era positivo per il gruppo amminico primario, come osservato dopo lo spray con ninidrina, dopo il riscaldamento. Questa macchia peptidica libera positiva alla ninidrina non è stata più osservata nella miscela dopo il completamento della reazione, dopo la TLC del campione della miscela di reazione, dopo la rimozione di DIPEA, DMSO e la ridissoluzione in cloroformio. Per quanto riguarda la questione cruciale della qualità del reagente estere NHS, la Figura 1 presenta la traccia spettrofotometrica della cinetica di idrolisi, con il punto di tempo zero all'inizio della reazione che è quando l'estere NHS in un solvente organico è stato aggiunto alla cuvetta. Ciò conferma la funzionalità dell'estere attivo NHS della carbossi-PEG-DSPE (vedi Sezione 1 dei metodi). Al punto di tempo zero, l'estrapolato A260=0,33 rappresenta il materiale che era già stato idrolizzato prima del test. Al completamento della reazione di idrolisi, in eccesso di 10-15 min, A260=1.54 (quando l'assorbanza non aumenta più considerevolmente). Ciò conferma la presenza di estere attivo. Fornisce inoltre dati quantitativi, che oltre il 78% del materiale non è NHS pre-idrolizzato, e può quindi essere utilizzato con successo per l'accoppiamento peptidico, con la corretta regolazione della quantità di reagente.
Preparazione e trasferimento del materiale lipidico dal mezzo acquoso al guscio della bolla: lipidi di fluorescenza
Le microbolle per questo studio sono state preparate per contenere una traccia (inferiore all'1%) del colorante fluorescente DiI, con caratteristica fluorescenza rossa, che è stato aggiunto come soluzione in PG alla soluzione salina-PG di DSPC e PEG stearato. Le microbolle risultanti dimostrano chiaramente la fluorescenza del guscio quando l'eccitazione della luce verde e i filtri di emissione rossi vengono utilizzati nel microscopio (vedi Figura 2, a sinistra). La microscopia in campo chiaro della fase gassosa a microbolle (Figura 2, a destra) può essere confrontata con la fluorescenza della conchiglia a microbolle. Per la valutazione quantitativa del trasferimento di materiale lipidico dalla fase acquosa al guscio della bolla, le microbolle sono state fatte galleggiare mediante centrifugazione e il segnale di fluorescenza della fase infranatante chiara è stato confrontato con la fluorescenza della soluzione iniziale, prima dell'amalgama delle microbolle. È stata osservata una riduzione del segnale di quasi un ordine di grandezza (Figura 3), ovvero oltre l'85% del materiale lipidico si è trasferito al guscio della microbolla per amalgama.
Preparazione e correzione della distribuzione dimensionale delle microbolle
Le microbolle generate dall'amalgama hanno dimostrato una distribuzione dimensionale tipica, con un'alta concentrazione (ad esempio, ~4,8 x 109 particelle per mL per le bolle biotinilate). La distribuzione dimensionale era ampia, con particelle presenti all'interno del range misurato (tra 1 e 30 μm); ~6,3% le microbolle superano i 5 μm di diametro (Figura 4, curva verde). La somministrazione intravascolare di microbolle di grandi dimensioni può portare al loro accumulo aspecifico nei capillari sanguigni e deve essere evitata. Una breve flottazione (15-17 minuti) della fiala capovolta in gravità normale, con la successiva raccolta di 0,3 mL vicino alla superficie del setto, consente la rimozione completa delle microbolle più grandi, con una perdita minore nella concentrazione totale del numero di particelle, fino a ~4,6 x 109: dopo la flottazione, solo lo 0,01% delle particelle nel campione purificato ha diametri superiori a 5 μm (Figura 4, curva rossa).
Adesione di microbolle alla superficie rivestita di recettore: saggio statico
Questa procedura è stata descritta per la prima volta nel secolo scorso1 e viene utilizzata come test rapido che conferma la funzionalità delle microbolle mirate. Le microbolle possono entrare in contatto con la superficie del piatto che trasporta il recettore. Se avviene l'interazione ligando-recettore, le bolle possono essere trattenute sulla superficie nonostante il lavaggio vigoroso. Viene presentato un esempio di tale test rapido dell'adesione funzionale di microbolle di c(RGDfK) sulla superficie rivestita con αricombinante vβ3 . La Figura 5 è un'immagine rappresentativa al microscopio in campo chiaro di microbolle aderenti sulla superficie del recettore in una piastra di Petri, dopo un lavaggio con PBS, per rimuovere le bolle non legate. Le bolle in questo tipo di microscopia si presentano come modelli circolari scuri. In condizioni simili, se la superficie è rivestita solo di albumina (per bloccare l'adesione aspecifica), le microbolle non aderiranno e saranno facilmente lavate via anche dal risciacquo delicato.
Legatura di microbolle dal fluido che scorre: camera di flusso a piastre parallele
Questa procedura è stata inizialmente proposta come strumento per lo studio dell'adesione cellulare in un ambiente a flusso controllato15 e adattata per lo studio del targeting delle microbolle decenni dopo11. Il test in un sistema a flusso continuo, a differenza di un test statico, è molto più realistico per uno scenario di imaging clinico, in cui le bolle circolanti in un flusso di sangue toccano brevemente la parete del vaso e possono aderire ad essa se è presente il recettore bersaglio. Vengono presentati due esempi di tali studi. Il primo esempio è un approccio più tradizionale, in cui l'adesione di microbolle decorate con peptidi alla superficie rivestita dal recettore viene monitorata mediante videomicroscopia. La microscopia permette di distinguere le microbolle aderenti da quelle che scorrono. Consente inoltre di quantificare le microbolle aderenti nel fotogramma del microscopio: molte più microbolle di c(RGDfK) (colonna di sinistra) aderiscono alla superficie, rispetto al controllo, dove viene utilizzato il peptide c(RADfK) strapazzato, o se la superficie è rivestita solo con BSA (Figura 6).
Il secondo esempio è l'ecografia con mezzo di contrasto della piastra di Petri rivestita con streptavidina (Figura 7, lato destro) in cui le microbolle biotinilate si adsorbono con successo dal mezzo che scorre e possono essere rilevate mediante ecografia con mezzo di contrasto dopo un lavaggio con PBS. La superficie della capsula di controllo non trattiene le microbolle aderenti al flusso, quindi essenzialmente tutto il segnale di contrasto ultrasonico viene rimosso con il flusso PBS. La quantificazione del segnale di contrasto ad ultrasuoni mostra una forte significatività statistica della differenza osservata; Il rapporto tra i segnali di destinazione e di controllo superava un ordine di grandezza.
Figura 1. Cinetica dell'idrolisi dell'estere attivo NHS-PEG-DSPE, osservata mediante rilascio di NHS in mezzo alcalino mediante test spettrofotometrici a lunghezza d'onda di 260 nm. Il punto temporale zero è il tempo di aggiunta di NHS-PEG-DSPE in solvente organico al tampone borato 0,1 M, pH 9,2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Microscopia di microbolle riempite di gas dopo l'amalgama. A sinistra, microscopia a fluorescenza (eccitazione verde, emissione rossa, colorante a guscio lipidico DiI). A destra, microscopia in campo chiaro (osservazione in fase gassosa), stesso ingrandimento. Larghezza del fotogramma, 85 um (micrometro da tavolino da 10 μm incorporato in basso a destra di ogni immagine). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Spettroscopia di fluorescenza di un campione di colorante lipidico DiI dal terreno di preparazione delle microbolle prima dell'amalgamazione (a destra) e dopo l'amalgama e la rimozione delle microbolle mediante flottazione centrifuga (a sinistra). Eccitazione della fluorescenza - 555 nm, emissione - 620 nm. Dati presentati come media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Distribuzione granulometrica del numero di concentrazioni di microbolle dopo la preparazione all'amalgama (verde), con successiva flottazione a gravità normale per la rimozione di microbolle di grandi dimensioni (rosso) e conteggio di fondo solo diluente (blu). Conteggio delle particelle con rilevamento elettrozonale in soluzione salina normale, orifizio da 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Microscopia in campo chiaro di microbolle di c(RGDfK) su un piatto rivestito con αvβ3. La larghezza del fotogramma dell'immagine è di 106 μm; la barra è di 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. La camera di flusso parallela su piastra in vitro ha come bersaglio le microbolle decorate con peptidi sulla superficie rivestita con α ricombinante vβ3. Le microbolle decorate con cRGDfK hanno aderito in modo efficiente alla piastra (a sinistra), l'attacco delle microbolle cRADfK (strapazzate, al centro) di controllo è stato minimo (p<0,00005), così come la ritenzione di microbolle sulla superficie di controllo della sola albumina (a destra, p<0,0025). Sforzo di taglio della parete di flusso della camera a 1 dyn/cm2. Adesione di microbolle monitorata mediante videomicroscopia; Viene presentato il numero di particelle nel campo visivo. Il tempo di accumulo è di 4 min. Dati presentati come media ± deviazione standard. Ristampato con il permesso di5. Diritto d'autore, 2018, Società chimica americana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Ecografia con contrasto di una camera di flusso a piastre parallele dopo l'adesione mirata e il lavaggio del tampone delle microbolle biotinilate sulla piastra rivestita con streptavidina (al centro, microbolle mirate aderenti, a destra, stessa piastra, dopo lo scoppio di ultrasuoni ad alto infarto miocardico) e piastra di controllo rivestita solo con albumina (a sinistra). Due minuti di perfusione della dispersione di microbolle (PBS/BSA, 106 particelle/mL) a una velocità di taglio di 450 s-1 , seguiti da lavaggio con tampone. La quantificazione del segnale ultrasonico viene eseguita dalle regioni di interesse nei fotogrammi video dopo la sottrazione di fondo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'importanza di una tecnica semplice per la preparazione di microbolle decorate con leganti è evidente. L'uso della tecnica di amalgamazione per la preparazione di microbolle, come sperimentato da Unger et al.,16 può servire a questo scopo per una serie di motivi. La produzione di microbolle mediante amalgamatore è facile da eseguire. È disponibile un'unità da tavolo monofase da 120 V a ingombro ridotto ed economica. La procedura è rapida (45 secondi) ed efficiente: viene preparato immediatamente 1 mL di dispersione di microbolle in un mezzo acquoso. Contiene miliardi di particelle per mL, più che sufficienti per gli studi di ricerca. La produzione avviene in una fiala sigillata con spazio di testa del gas perfluorurato. Se necessario, il contenuto del flaconcino rimarrà sterile dal momento del riempimento asettico, durante la produzione (amalgama) e fino all'uso. Ciò rende l'approccio rilevante per l'uso clinico, in quanto non richiede preparazioni elaborate in un ambiente sterile dedicato in clinica.
La procedura si basa sull'autoassemblaggio: durante la miscelazione, poiché viene applicato un elevato taglio all'interfaccia gas-acqua all'interno della fiala in movimento, si formano piccoli frammenti di gas, che assumono una forma sferica a causa dell'azione della tensione superficiale. Il PG, come cotensioattivo, presente nel mezzo ad alta concentrazione, riduce la tensione superficiale e l'energia necessaria per generare l'interfaccia gas-acqua durante il taglio. Successivamente, tensioattivi più "classici", come i lipidi PEG e i fosfolipidi, che sono presenti a concentrazioni molto più basse, raggiungono l'interfaccia, molto probabilmente spostando il PG e stabilendo uno strato monomolecolare sulla superficie della bolla. Questo guscio è ragionevolmente stabile; è probabilmente dovuto a una combinazione di un lipide "solido" (la temperatura di transizione di fase DSPC è di 56 °C, quindi non è incline alla fusione intermembrana) e di un esteso rivestimento a spazzola PEG che circonda le microbolle e inibisce il contatto diretto del monostrato delle bolle vicine. Si può ipotizzare che la presenza di un'alta concentrazione di PG nel terreno possa ridurre la stabilità del guscio delle microbolle. In sua assenza, le microbolle sono stabili nelle fiale sigillate in atmosfera di fluorocarburi per molti mesi, con solo una fusione moderata tra le bolle. Per l'uso clinico, con un piccolo dispositivo amalgamatore al letto del paziente, l'intervallo tra la preparazione delle microbolle e l'uso può essere breve, minuti o ore. Con il PG presente nel terreno, la concentrazione di microbolle non mostra un calo significativo, almeno per diverse ore di conservazione refrigerata.
Un ulteriore vantaggio della procedura descritta (assistita dall'uso del cosurfattante PG nel terreno di preparazione delle bolle) è l'elevata efficacia (>85%) del trasferimento lipidico al guscio, mentre la sonicazione tradizionale fornisce un'efficacia del ~20%5 e i moderni metodi microfluidici ancora più bassi17. Un alto livello di efficienza di trasferimento è importante non solo perché si riduce lo spreco di materiale lipidico e il costoso ligando, ma anche perché si riduce al minimo la quantità di legante privo di bolle co-presente nel terreno. Quindi il ligando libero potrebbe non avere l'opportunità di bloccare il recettore bersaglio del biomarcatore a cui ci si aspetta che le microbolle si leghino tramite ligando sulla loro superficie. La quantità generale del recettore del biomarcatore sul sistema vascolare bersaglio è spesso piuttosto elevata, quindi questo potrebbe non essere della massima importanza. Dalla letteratura brevettuale disponibile18 si potrebbe suggerire che almeno il 50% del materiale del guscio lipidico e del ligando mirato nelle formulazioni di microbolle nei test clinici possa essere associato al guscio della bolla. Questo può essere generalmente confrontato con anticorpi o peptidi radiomarcati che sono ampiamente utilizzati negli studi di imaging dei recettori della medicina nucleare: la maggior parte di quelli che hanno come bersaglio le molecole del ligando in realtà non trasportano radioisotopi "caldi" anche per la più alta attività specifica riportata19, mentre per le microbolle mirate, il materiale del guscio in questo studio (incluso il lipide ligando) è per lo più attaccato alle microbolle.
L'adesione selettiva di microbolle mirate preparate con questa tecnica in vitro è stata dimostrata, in due serie di modelli di targeting: adesione statica e un esperimento di targeting in camera di flusso. In un test statico, le microbolle mirate hanno aderito saldamente allo strato del recettore bersaglio e non sono state rimosse con il risciacquo del tampone, a differenza di un ambiente di controllo, in cui le microbolle sono state rimosse dalla superficie anche con un risciacquo delicato. Allo stesso modo, in un test a flusso continuo, eseguito in una camera di flusso a piastre parallele, le bolle biotinilate hanno dimostrato un'adesione statisticamente significativa e superba allo strato di streptavidina su una piastra di polistirene, rispetto alla superficie di controllo della sola albumina. Le microbolle decorate con peptide c (RGDfK) hanno aderito selettivamente alla superficie rivestita αvβ3, sia nel saggio di adesione statica, sia in una camera di flusso a piastre parallele.
I seguenti problemi possono essere considerati come le limitazioni del protocollo descritto. In primo luogo, la procedura non tiene conto delle particelle submicroniche. Lo strumento utilizzato nello studio non è stato impostato per rilevare le nanobolle (cioè particelle di diametro inferiore a 1 μm). Queste particelle potrebbero essere state presenti nella formulazione. Sebbene il loro segnale di retrodiffusione acustica sia generalmente noto per essere basso e non siano stati osservati in questo studio al microscopio, la presenza di nanobolle dovrebbe comunque essere considerata. Il secondo problema significativo è l'eterogeneità dimensionale delle microbolle. Nonostante la rimozione di particelle più grandi, la dimensione delle bolle risultanti è tutt'altro che uniforme. Questa dovrebbe essere una considerazione e una giustificazione per ulteriori ricerche nel campo della formulazione di microbolle.
In conclusione, la narrazione fornita in questo manoscritto dovrebbe fornire un livello sufficiente di dettagli tecnici per produrre microbolle mirate in modo rapido e semplice. Vengono fornite le fasi per eseguire un'ulteriore purificazione (se necessario), regolando le dimensioni e/o valutando la piccola quantità di materiale del guscio che rimane nel mezzo acquoso. Vengono descritti gli strumenti analitici dettagliati per la valutazione dei parametri delle microbolle, come la distribuzione dimensionale e la concentrazione, e la capacità in vitro delle microbolle decorate con ligando di aderire ai recettori bersaglio.
A. Klibanov è co-fondatore e azionista di minoranza di Targeson Inc, una startup nel settore delle microbolle precliniche mirate, ora disciolta. Il suo laboratorio UVA ha un subappalto tramite NIH R44 HL139241 da SoundPipe Therapeutics.
A.L. Klibanov riconosce il sostegno in parte tramite NIH R01EB023055, assegnato dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering del National Institutes of Health, un subappalto all'Università della Virginia tramite NIH R01NS076726, assegnato all'UCSF dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institutes of Health e un subappalto all'Università della Virginia tramite sovvenzione NIH R44HL139241, assegnato a SoundPipe Therapeutics dal National Heart, Lung, and Blood Institute. Il contenuto di questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amalgamator | Lantheus, Billerica, MA. | Vialmix | ESPE Capmix, Wig-L-Bug or another amalgamator capable of 4300 rpm can be used. |
biotin-PEG3400-DSPE | Laysan Bio, Arab, AL. | Biotin-PEG-DSPE-3400 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific, Waltham, MA | BP1600-100 or similar | |
Ca-Mg-free PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA | 14190-144 | |
Centrifuge with a bucket rotor | IEC/Thermo, Fisher Scientific, Waltham, MA. | NH-SII | Any centrifuge with a bucket rotor |
chloroform | Fisher Scientific, Waltham, MA | C297-4 | |
cyclic (RGDfK) peptide | AnaSpec, Fremont, CA | AS-61111 | |
Decafluorobutane | F2 Chemicals, Preston UK | CAS 355-25-9 | |
DiI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. | 468495-100MG | |
DIPEA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. | 387649 | |
Disposable UV cuvette, 1.5 ml | BrandTech, Essex, CT. | 759150 | |
DMSO | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. | 276855 | |
Dry block heater, high temperature | Techne Cole Palmer, Staffordshire UK | DB-3A | |
DSPC | Lipoid, Ludwigshafen, Germany | LIPOID PC 18:0/18:0 | |
Fluorescence microplate reader | Molecular Devices, San Jose, CA. | Spectramax Gemini XS | No longer available, superceded by Gemini XPS; any fluorescence plate reader with red dye detection capability will work |
Microscope with fluorescence epi-illumination. | Leica | Laborlux 11 | No longer available; any fluorescence microscope is sufficient; high-sensitivity video camera is required for image stream collection |
NHS-PEG3400-DSPE | NOF-America, White Plains, NY. | SUNBRIGHT DSPE-034GS | Some of the alternative manufacturers provide material that is mostly, or completely, hydrolyzed on arrival |
Ninhydrin spray for TLC plates | BVDA, Haarlem, The Netherlands | AS-72177 | |
Normal saline irrigation solution (0.9% NaCl) | Baxter, Deerfield IL. | 2F7124 | |
Parallel plate flow chamber, for 35mm Corning Petri Dish | Glycotech, Gaithersburg, MD. | 31-001 | May only work with Corning Petri dishes, but not necessarily with other makers, due to different dimensions |
Particle sizing system | Beckman Coulter, Hialeah, FL | Multisizer 3 | No longer available, superceded by Multisizer 4, with similar electrozone sensing principle. Alternatively, optical methods, e.g., Accusizer, can be used. |
PEG 6000 monostearate | Kessco Stepan, Joliet, IL. | CAS 9004-99-3 | |
Petri Dishes, 35 mm diameter, 10 mm tall | Corning, Corning, NY. | 430165 | |
Plastic coverslips, 22x22mm | Cardinal Health, McGaw Park, IL. | M6100 | |
Propylene glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. | P4347 | |
Recombinant murine alphavbeta3, carrier-free | R&D Systems, Minneaposis, MN. | 7889-AV-050 | |
Rubber stoppers, 13mm | Kimble-Chase, Vineland, NJ | W017900 | |
Serum vials, 2 ml, 13mm | Kimble-Chase, Vineland, NJ | 223683 | |
Silica TLC Plates, F254 | Analtech, Newark, DE | P02521 | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. | S9640 | |
Streptavidin | AnaSpec, Fremont, CA | AS-72177 | |
Syringe pump, infuse/withdraw option | Harvard Apparatus, Holliston, MA | PHD2000, 70-2001 | |
Ultrasound imaging system with contrast-specific mode. | Siemens/Acuson, Mountain View CA | Sequoia c512, 15L8 probe | Old generation Sequoia is out of production for more than a decade. Available as used equipment. CPS mode has to be unlocked for the 15L8 transducer. |
UV Spectrophotometer | Beckman, Brea, CA. | DU640 | No longer available, may be replaced with any 260 nm ultraviolet-capable unit |
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