Pre-clinica ortotopico Modello murino di Human cancro alla prostata

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Il cancro della prostata è la seconda causa più comune di morte per cancro (9%) tra i maschi negli Stati Uniti, accanto al cancro del polmone e dei bronchi (28%) ^1. Secondo dati recenti, si stima che 220, 800 casi di cancro alla prostata di nuova diagnosi e 27, 540 decessi si verificherà nel 2015 ^1. Il tasso di sopravvivenza relativa cinque anni di cancro alla prostata in fase iniziale è> 99%, mentre quella di malattia metastatica avanzata è solo il 28% ^1. Una sfida importante per il trattamento della malattia metastatica avanzata è la mancanza di comprensione dei meccanismi molecolari alla base della propensione di questa malattia di metastatizzare ad altri organi, in particolare per l'osso, che è un sito frequente per il cancro alla prostata. Quindi, vi è una chiara necessità di studiare la composizione molecolare di questi tumori della prostata al fine di sviluppare regimi terapeutici efficaci contro la progressione ad avanzato ^2,3 malattia metastatica.

Prostata tumori mostra HIGh eterogeneità biologica, senza un percorso ben definito per la progressione. Le metastasi si verificano spesso senza indicazione preventiva del tumore invasività ^4. Questa eterogeneità clinica è attribuito alla diversità molecolare del cancro della prostata. Comprendere la composizione molecolare di questi tumori letali è la chiave per la progettazione di strategie meglio diagnostiche e terapeutiche per questa malattia. Di conseguenza, la ricerca sul cancro della prostata è attualmente focalizzata sulla comprensione e la prevenzione delle metastasi.

Modelli murini pre-clinici in vivo offrono una varietà di opzioni per comprendere i meccanismi molecolari della progressione del cancro alla prostata per malattia metastatica avanzata. Inoltre, questi modelli sono importanti per le valutazioni precliniche di nuove strategie terapeutiche contro questa malattia. I modelli animali più comunemente usati includono modelli di topi transgenici, iniezione coda vena, l'impianto intra-cardiaca e modelli di topo ortotopico umani. studi transgenici sono il tempo Consuming e correlazione di sviluppo del cancro alla prostata nei topi con quella degli esseri umani hanno mostrato variabilità ^11. In modelli murini metastatici spontanei, le cellule vengono iniettate direttamente in circolo e sebbene, hanno tempo di risposta rapido, non possono essere utilizzati per studiare il tumore primario o passi iniziali nella cascata metastatica ^5. modelli xenotrapianto ortotopico hanno la limitazione di sviluppare lesioni metastatiche ossee, il luogo comune di metastasi del cancro alla prostata. Tuttavia, il cancro alla prostata ortotopico modello murino di xenotrapianto umano è ben caratterizzato e ampiamente utilizzato per studiare gli eventi molecolari dello sviluppo del tumore primario, cross-talk tra tumore e microambiente organo, la fase iniziale della malattia metastatica e l'uso di farmaci sperimentali per l'intervento terapeutico ^{6 , 7,8-11.}

Protocolli per tutte le procedure che coinvolgono gli animali devono essere esaminati e approvati da un Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC). Seguire le procedure ufficialmente riconosciute per la cura e l'uso di animali da laboratorio. iniezione intra-prostatica richiede chirurgia aperta addominale e degli animali deve essere conservato in un ambiente privo di agenti patogeni con una sala operatoria designato in cui vengono utilizzati corrette tecniche asettiche chirurgici durante l'intera procedura.

1. Preparazione di cellule per Implantation

NOTA: in base alle esigenze di ricerca, qualsiasi linea di cellule di cancro alla prostata può essere utilizzato. Le linee cellulari sono coltivate secondo le istruzioni del fornitore.

1. Per la linea cellulare PC3M-Luc-C6 che esprime stabilmente il gene della luciferasi di lucciola, le cellule di coltura in Minimum Essential Medium (MEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), aminoacidi 1x non essenziali, 1x Phleomycin D1 e 1mM piruvato di sodio . Mantenere le cellule in un incubatore with atmosfera umidificata di 95% CO aria e 5% ₂ a 37 ° C. cellule PC3M-Luc-C6 sono stati acquistati dalla struttura di base UCSF.
2. Celle di raccolta di tripsinizzazione. Lavare piastre di coltura una volta con tampone fosfato (PBS). Aggiungere 2 ml 0,05% tripsina ad un piatto da 10 cm incubare per 3-5 minuti in un incubatore con atmosfera umidificata di 95% CO aria e 5% ₂ a 37 ° C sino cellule sono staccati.
   1. Per evitare grumi, non agitare le cellule colpendo o scuotendo il piatto in attesa per le cellule di staccare. Raccogliere le cellule in 5 ml di mezzi completi e centrifugare per 5 minuti a 200 x g. Lavare il pellet di cellule con PBS per rimuovere tripsina.
3. Enumerare cellule vive mediante test di esclusione trypan blue. Mescolare 10 ml di sospensione cellulare in PBS con 10 ml di 0,4% (peso / v) trypan blue soluzione. Caricare il composto in un emocitometro o camera di conteggio scivolo e contare le cellule immediatamente sotto un microscopio o leggere il vetrino da camera in una cella di counter.
   1. Preparare una sospensione cellulare contenente 2,5 x 10 ⁵ cellule in 10 microlitri mezzi. Mescolare la sospensione cellulare con estratto di matrice extracellulare 10 ml membrana basale-like e mettere le cellule in ghiaccio. Aggiungere luciferina alla sospensione cellulare (1: 200 ml; magazzino 30 mg / ml di concentrazione) prima dell'iniezione in topi.
      NOTA: In questo modo immediato bio-immagini di animali per verificare la coerenza di iniezioni di cellule tra i diversi gruppi sperimentali. Iniettare cellule più rapidamente possibile, preferibilmente entro 30 min dopo tripsinizzazione poiché vitalità cellulare diminuisce rapidamente dopo stacco.

2. Preparazione del campo operatorio

1. Eseguire un intervento chirurgico in una zona sgombra, disinfettati che promuove asepsi.
2. Sterilizzare l'/ banco di laboratorio contatore con una soluzione di candeggina prima di un intervento chirurgico.
   NOTA: L'uso di alcol è scoraggiato a causa del tempo prolungato contatto necessario per entrare in vigore (15 min).
3. Utilizzare teli sterili,pulire i rilievi assorbibili o asciugamani, e sostituire questi materiali dopo ogni sessione chirurgica. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'uso. metodi preferiti sono un'autoclave a vapore, perle di vetro sterilizzatore, ossido di etilene, o perossido di idrogeno di sterilizzazione al vapore.
4. Utilizzare un microscopio da dissezione asetticamente pulita per eseguire la procedura chirurgica o ricercatori esperti in grado di eseguire senza un microscopio.

3. L'impianto delle cellule tumorali

1. Utilizzare maschio 6-8 settimane vecchio immunocompromessi Balb / c o NOD / topi SCID.
   NOTA: E 'più difficile operare su animali più piccoli e animali più grandi tendono ad avere cinetiche lente di crescita tumorale e metastasi.
2. Iniettare pre-chirurgia dolore farmaci secondo le istruzioni del stabulario. Ad esempio, Buprenorfina intraperitoneale alla dose di 0,1 mg / kg di peso corporeo può essere utilizzato.
3. Anestetizzare gli animali mettendoli in una camera isoflurano con 1-3% isoflurano in ossigeno e wafinché animali sono completamente anestetizzati. Assicurarsi che non vi sia riflessa punta del tono muscolare a questo punto. Usare un lubrificante unguento oftalmico veterinaria per prevenire la cecità a causa di xeroftalmia durante l'anestesia generale.
   NOTA: Anestetizzare gli animali per la sperimentatore metodo preferito esempio, per pentobarbital sodio, 0,05 mg per peso corporeo grammo viene somministrato intra-peritoneale o soluzione ketamina / xilazina (concentrazione: 17.16 mg / ml) alla dose di 65 mg / kg di peso corporeo viene utilizzato per via sottocutanea. inalazione isoflurano è un metodo preferito di anestesia. L'unguento occhio deve essere applicato delicatamente senza sfregare contro la cornea.
4. Rimuovere l'animale dalla camera di isoflurano e posto in un apparato cono con flusso continuo di 1-2% isoflurano in ossigeno per garantire che l'animale è sotto anestesia totale prima di procedere.
   1. Rimuovere i capelli da topi da barba o usare una crema rimozione dei capelli prima di iniziare la procedura.
      NOTA: Sarebbe preferibile posizionare il mouse su una piastra elettrica sterile durante l'intervento chirurgico.
5. Posizionare il mouse in posizione supina. Pulire il basso addome con il 10% w / w soluzione iodopovidone seguito da 70% etanolo tamponi.
6. Con una coppia di pinza sottile, sollevare una zona di pelle 2 mm sopra la ghiandola del prepuzio, circa 1-2 cm sopra la guaina del pene, e circa 2-3 cm sotto la parte inferiore della gabbia toracica.
7. Effettuare una incisione mediana 1 centimetro di lunghezza, prima attraverso la pelle con un bisturi e quindi attraverso lo strato muscolare con una forbice (figura 1).
8. Individuare la vescica nella cavità del corpo. Si tratta di un organo sferico marrone giallo-chiaro, situato direttamente sotto l'incisione (Figura 1).
9. Con una coppia di pinze buona aderenza in vescica e sollevarlo poi basso fuori della cavità del corpo verso la guaina del pene. Questo esporrà le due vescicole seminali che sono una coppia di organi saclike bianchi e chiaramente distinti.
10. Con untampone di cotone in ogni mano, esternare le vescicole seminali, una per una, e tirare fuori della cavità del corpo e si stese a faccia in giù sulla superficie esterna dell'addome con la vescica nel mezzo (Figura 2).
11. Usando i tamponi di cotone, inclinare leggermente indietro le vescicole seminali nel punto di inserimento vicino al collo della vescica, verso la guaina del pene, in modo che i due lobi della prostata dorsali sono chiaramente visibili. Usare tamponi di cotone umido per evitare danni ai tessuti (Figura 3).
12. Agitare la sospensione cellulare con una micropipetta prima di caricare nella siringa.
13. Pur ponendo le vescicole seminali in posizione con un tampone di cotone, inserire l'ago della siringa nel lobo dorsale prostatica al microscopio (Figura 4). Iniettare lentamente 20 ml di sospensione cellulare fino a quando viene identificata una formazione bulla. Una bulla sporgenti indica che l'iniezione è corretta.
14. Mentre ritraendo l'ago, premere leggermente sul sito di iniezione conun batuffolo di cotone e tenere premuto per qualche secondo per evitare perdite.
15. Sollevare con cautela le vescicole seminali con tamponi di cotone e inserirli nuovamente al corpo della cavità uno per uno seguito dalla vescica. Evitare 'twirling' gli organi interni durante l'esecuzione di questa procedura.
16. Dopo aver posizionato gli organi nella cavità del corpo, suturare lo strato muscolare prima in un modello interrotto con assorbibili 4-0 sutura catgut cromico seguita dalla chiusura pelle non assorbibile 4-0 nylon sutura chirurgica. La pelle può anche essere tirato insieme e chiuso con pinze chirurgiche per chiudere completamente l'incisione.
    NOTA: I topi hanno l'abitudine di graffi e morsi al loro ferita, che può portare alla riapertura della ferita, quindi utilizzare di colla tissutale è consigliato anche insieme con suture. animali immagine immediatamente per assicurare che non ci sia uguale intensità bioluminescente tra tutti i gruppi sperimentali.
17. Rientro gli animali per pulire le gabbie e tenerli sotto una lampada di riscaldamento o di caloreing pad. Monitorare gli animali costantemente fino a quando non completamente recuperano dall'anestesia e mantengono decubito sternale.

4. Monitoraggio degli animali

1. Monitorare gli animali regolarmente fino alla fine dell'esperimento, secondo protocolli istituzionali. Se si utilizza clip metalliche chirurgici, rimuovere dopo una o due settimane. Durata dell'esperienza dipende dalla specifica esigenza di ricerca.
   NOTA: Questo esperimento è stato condotto per 21 giorni per esaminare la costituzione ottimale delle cellule tumorali impiantate nella prostata mouse.
2. Somministrare farmaci antidolorifici in base alle istruzioni del stabulario. Ad esempio, Buprenorfina intraperitoneale alla dose di 0,1 mg / kg di peso corporeo può essere utilizzata al momento della procedura con una seconda dose dopo 6 hr e ulteriori dosi ogni 8-12 ore, se necessario.
3. Monitorare il peso degli animali, il consumo di cibo, il colore della pelle e la consistenza, l'attività e la frequenza della minzione e la defecazione. Eutanasia animali immediately se vi è una perdita significativa di peso corporeo superiore al 15%.
   1. Per l'eutanasia, consegnare CO ₂ da un serbatoio pressurizzato in una gabbia non affollate con una portata di spostare il 10-30% della camera o della gabbia del volume / minuto, permettendo di CO ₂ per entrare nella camera lentamente in modo che si verificano narcotizzazione incoscienza e completo prima della morte.
   2. Mantenere flusso CO ₂ per almeno un minuto dopo l'arresto respiratorio e lasciare gli animali nella camera per un tempo sufficiente affinché la morte si verifica prima di eseguire un metodo fisico.
   3. Eseguire la decapitazione, la dislocazione cervicale o qualsiasi altro IACUC approvati metodo fisico dopo eutanasia degli animali chimicamente.
      NOTA: Significativa riduzione del peso corporeo spesso indica una condizione letargica. Tumorali animali portatori devono essere in buona salute eccetto per la presenza di tumori fino alla fine dell'esperimento. L'eutanasia deve essere coerente con le linee guida AVMA su eutanasia e deve essere Listad nel protocollo IACUC approvato.

5. non invasiva bio-immagini degli animali

1. Monitorare gli animali settimanale utilizzando una tecnica di imaging non invasiva per monitorare la colonizzazione delle cellule tumorali, la crescita del tumore e metastasi a distanza qualsiasi.
   NOTA: le modalità di imaging come la GFP imaging, imaging luciferasi, i raggi X o 3D micro-tomografia computerizzata (UCT), ecc possono essere utilizzati in base alla specifica di ricerca hanno bisogno di ^12-15.

Dopo l'impianto ortotopico di cellule PC3M-Luc-C6 nel lobo posteriore prostatica, topi sono stati settimanale ripreso utilizzando un sistema di imaging bioluminescenza animale vivo per monitorare la colonizzazione di cellule e la crescita tumorale nel corso dell'esperimento (Figura 5A - B). Quantificazione del segnale bioluminescente ha indicato che le cellule PC3M-Luc-C6 colonizzato con successo i lobi della prostata. Aumento bioluminescenza è indicativo di un aumento della crescita del tumore primario nel corso dell'esperimento (Figura 5B). Sulla base della rete di ricerca, i topi possono essere monitorati settimanalmente in modo non invasivo mediante radiografia, la fluorescenza o di imaging luminescenza per monitorare la crescita del tumore e le eventuali lesioni metastatiche a distanza. Altri parametri che si possono ottenere con questo modello sono: variazioni del peso corporeo e del consumo di cibo nel corso dell'esperimento; effetto del trattamento farmacologico sulla dimensione del tumore e del peso; quantificazionedi dimensioni del tumore e il peso al termine dell'esperimento; estrazione di DNA / RNA / proteine ​​per determinare cambiamenti molecolari che si verificano all'interno del tumore primario dopo la cessazione dell'esperimento.

Figura 1:. Addominale incisione mediana per l'impianto intra-prostatica di cellule tumorali addominale incisione mediana è di circa 1-2 cm. vescica urinaria è direttamente sotto l'incisione. Pressatura soffice su entrambi i lati dell'incisione aiuta a sporgere vescica urinaria. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Disposizione dei vescicole seminali per avescicole TRA-prostatica impianto di cellule tumorali. seminale sono organi sac-come bianchi e sono situati direttamente adiacente alla vescica. Vescicole seminali sono esteriorizzate con tamponi di cotone e disposti a destra ea sinistra con la vescica nel centro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Dorso della prostata Al punto di inserimento, inclinare leggermente indietro le vescicole seminali verso la guaina del pene in modo che i due lobi della prostata dorsali sono chiaramente visibili. Usare tamponi di cotone umido per evitare danni ai tessuti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:.. L'impianto intra-prostatica di cellule tumorali Le cellule tumorali sono iniettati nel lobo dorsale della prostata Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. Imaging in vivo bioluminescenza di modello di impianto intra-prostatica (A) in vivo immagini bioluminescenza di topi nel corso tempo sperimentale dopo cellule PC3M-Luc-C6 luciferasi marcato sono stati impiantati nel lobo dorsale prostatica topi nudi. (B) Quantificazione del segnale di bioluminescenza dimostra che le cellule PC3M-Luc-C6 colonizzato con successo la ghiandola prostatica con increascato la crescita del tumore ortotopico nel corso dell'esperimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Questo manoscritto descrive una procedura dettagliata per la creazione di un cancro alla prostata modello ortotopico xenotrapianto del mouse umana. Questo modello è stato istituito con l'impianto diretto della linea di cellule di cancro alla prostata umano PC3M-Luc-C6 nei lobi prostatici dorsale di topi immunocompromessi. Tumori stato permesso di sviluppare nel corso dell'esperimento. La crescita del tumore è stata monitorata settimanalmente da un sistema di imaging bioluminescenza non invasivo durante l'esperimento.

Il fattore più importante nella creazione di modelli di xenotrapianto di tumore è quello di raggiungere coerenza in tutto l'impianto di cellule tumorali. Per ottenere risultati statisticamente significativi, ogni gruppo sperimentale dovrebbe contenere 5-10 topi e variazioni dimensionali tumore non deve superare il 10% della dimensione media del tumore. Per raggiungere questo obiettivo, alcuni passaggi critici all'interno del protocollo sono importanti, come ad esempio: i) lo svolgimento di un intervento chirurgico nella zona che promuove asepsi durante l'intervento chirurgico; ii) le cellule dovrebbero essere transplanted appena possibile dopo il distacco dalla cultura; iii) volume di iniezione deve essere coerente; iv) attenta sollevamento degli organi interni dentro e fuori della cavità del corpo durante l'impianto di cellule; v) tutti gli animali devono essere iniettati con la stessa tecnica e da un investigatore; vi) gli animali dovrebbero essere randomizzati in gruppi sperimentali dopo l'impianto delle cellule tumorali.

Alcuni problemi che possono verificarsi sono: i) tumore non si sviluppa affatto o noduli tumorali sviluppano nella cavità mesentere o organo; ii) le dimensioni del tumore irregolare si osserva tra lo stesso gruppo sperimentale; iii) ci possono essere elevata mortalità chirurgia legate. Questi problemi possono essere superati adottando misure semplici come ad esempio: i) testare la coltura cellulare per qualsiasi contaminazione con micoplasma, ecc; ii) impedire la fuoriuscita della sospensione delle cellule tumorali nel mesentere e cavità addominale durante l'iniezione; iii) agitando la sospensione cellulare prima di ciascuna siringa carico; iv) corretto dosaggio anestesia dovrebbe essere followed e riscaldamento pastiglie dovrebbero essere utilizzati per mantenere la temperatura corporea durante la procedura.

Un'ampia varietà di dati possono essere raccolti utilizzando questo modello a seconda di una particolare obiettivo di ricerca compreso peso mouse, consumo di cibo, dimensioni del tumore e il peso, cambiamenti genetici e molecolari nelle cellule tumorali che contribuiscono alla crescita tumorale e linfonodi regionali metastasi linfonodali ^{10 , 16.} Hoffman e il suo gruppo hanno sviluppato la tecnica di impianto ortotopico chirurgica (SOI) e hanno ampiamente utilizzato questa tecnica per trapiantare frammenti istologicamente intatta dei principali tipi di tumori umani tra cui la prostata, vescica e tumori del rene nei roditori ^17. Questi modelli ortotopico hanno vantaggio rispetto ai modelli transgenici o sottocutaneo del mouse in quanto rappresentano con precisione il cancro clinica ^18,19. Questi modelli sono stati utilizzati anche per trapiantare i tumori presi direttamente dai pazienti al corrispondente organo del Rode immunodeficientinti. Modelli ortotopico sono anche ben adatti per esaminare gli effetti del trattamento farmacologico sulla crescita tumorale e metastasi linfonodali ^10. Sono anche utili per esaminare gli effetti di alterata espressione genica ex vivo, e determinare il suo effetto sull'incidenza di tumori, nonché la crescita intra-prostatica e metastasi ^20. Tuttavia, una limitazione del ortotopico modello di cancro della prostata è che tali modelli sono stati segnalati per portare a metastasi spontanea all'osso che è il sito più frequente per il cancro alla prostata metastasi ^12.

Il mancato raggiungimento metastasi ossee può essere dovuto a topi che muoiono di ostruzione urinaria, prima di ogni osso lesioni metastatiche possono sviluppare, o perché il microambiente del mouse non riesce a ricapitolare il microambiente umano, non riuscendo in tal modo a sviluppare metastasi ossee ^12. Tuttavia, questo modello fa ricapitolare gli eventi precoci nella cascata metastatica prima di embolia e l'ingresso delle cellule tumoraliin circolo e quindi è uno strumento prezioso per studiare il tumore primario, processo precoce di trasformazione metastatica e per le valutazioni precliniche di nuove strategie terapeutiche ^10,12.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

We thank Dr. Roger Erickson for his support and assistance with the preparation of the manuscript. This work was supported by the National Cancer Institute at the National Institutes of Health through grant numbers RO1CA160079, RO1CA138642, UO1CA184966 and VA funded program project number 1P1 BX001604.