Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Abbiamo sviluppato una piattaforma di screening per identificare proteine ​​chinasi dedicati umani per substrati fosforilati che possono essere utilizzati per delucidare nuovi percorsi di trasduzione del segnale. Il nostro approccio è caratterizzato dall'uso di una libreria di purificate protein chinasi umana GST-tag e una proteina ricombinante di interesse substrato. Abbiamo utilizzato questa tecnologia per identificare MAP / microtubuli affinità regolazione chinasi 2 (MARK2) come chinasi per un sito di glucosio-espresso nelle CREB-regolato trascrizionale coattivatore 2 (CRTC2), una proteina necessaria per la proliferazione delle cellule beta, nonché la famiglia di tirosina chinasi Axl come regolatori di metastasi delle cellule di fosforilazione della proteina dell'adattatore ELMO. Descriviamo questa tecnologia e discutiamo come può aiutare a stabilire una mappa completa di come le cellule rispondono agli stimoli ambientali.

Proteina modificazioni post-traduzionali (PTM) sono essenziali per la comunicazione intracellulare. Forse il più studiato di tutti PTM è fosforilazione, catalizzata da proteina chinasi, che regolano una miriade di funzioni proteiche, compresa la loro attività biochimica, localizzazione subcellulare, conformazione e stabilità. L'individuazione dei siti di fosforilazione di proteine ​​bersaglio può essere eseguito la mappatura fosfopeptide trittico o mediante tecniche di proteomica ormai standard che utilizzano i campioni arricchito da peptidi fosforilati ^1,2. Mentre tre quarti del proteoma espresso dovrebbero essere fosforilata ³ e identificate 200.000 siti di fosforilazione ^5, con stime fino a 1 milione ^6, molti di questi non hanno biologia assegnato, percorso di segnalazione, o proteine ​​chinasi.

Mentre individuazione dei siti fosforilazione è relativamente semplice, una sfida comparativamente più grande è quella diidentificare la chinasi affine (s) che gli obiettivi di questi siti, un processo che chiamiamo mappatura chinasi: coppie di substrato. Diversi approcci per identificare chinasi: coppie di substrato sono stati descritti, sia partendo con una chinasi di interesse e cerchi suoi substrati o iniziare con un substrato di interesse e il tentativo di trovare una chinasi modificante sperimentalmente ^7-11 o computazionalmente ^12. Per identificare chinasi per un noto substrato fosforilato, bioinformatica possono essere utilizzate per identificare le proteine ​​che contengono una breve sequenza di amminoacidi conservati che fiancheggiano il residuo fosforilato (sito consensus), nonché individuare chinasi che formano un complesso precipitable con il substrato. Tuttavia, questi approcci sono in termini di tempo e spesso non hanno successo.

Abbiamo sviluppato un approccio funzionale sistematica di individuare rapidamente chinasi che può fosforilare un determinato substrato ^13. Il saggio schermo produce eccellente specificolità, con molto chiara selezione di potenziali chinasi affini. Data la centralità della fosforilazione di segnalazione biologica, lo schermo è utile per la scoperta in quasi tutti i cellulari vie di segnalazione ^14-16. Lo schermo comporta l'esecuzione di un test chinasi larga scala con una libreria di proteine ​​chinasi umani. Le chinasi sono state contrassegnate con glutatione batterica S-transferasi (GST) proteine ​​e sono purificato da estratti cellulari di mammifero, il che significa che gli enzimi ricombinanti - a differenza di quelli preparati da batteri - sono generati in presenza delle proteine ​​chinasi a monte spesso necessari per la enzimi ricombinanti hanno attività in vitro. Infatti, mentre l'attività della chinasi serina, treonina e tirosina per l'attivazione della chinasi a valle sono presenti nel lievito ^10, il genoma di lievito codifica 122 protein chinasi, indicando che il kinome mammiferi, con oltre 500 geni ^17, è diventato molto più complesso per regulaTE i processi unici per gli organismi di ordine superiore. Inoltre, l'effetto di diversi stimoli rilevanti alla biologia cellulare e malattie umane (quali piccole molecole, fattori di crescita, ormoni, ecc) può essere utilizzato per attività chinasica ^14,15 modulate in un contesto appropriato.

1. Preparazione dei reagenti, piatti, e celle

1. Rendere 500 ml di tampone di lisi: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 mM beta-glicerofosfato, glicerolo 5%. Conservare a 4 ° C. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF), e 1 mM vanadato di sodio. Dopo questo passo, PMSF non è richiesto in ogni buffer di risciacquo.
2. Fai 20 ml di 10x Kinase Buffer: Tris 200 mM pH 7.5, 50 mM beta-glicerofosfato (FW 216), 2 mM vanadato di sodio. Aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 5 mM DTT.
3. Fai 20 ml di 10x tampone di M-ATP: 300 micron adenosina trifosfato (ATP), 66 mM MgCl _2, 33 MnCl mM _2. Aliquotare in 1 ml provette e conservare a -20 ° C.
4. Rendere 100 ml di 2x sodio dodecil solfato (SDS) tampone di lisi: 1,5 g base di TRIS, 20 ml di glicerolo, 30 ml di H ₂ O. Sciogliere e regolare il pH a 6,8 con HCl. Aggiungere 40ml 10% SDS, regolare il volume a 100 ml. Aggiungere 25 mg di blu di bromofenolo.
5. Spot 4 ml di 25 ng / ml plasmide di espressione di mammifero che codificano un GST-chinasi ^{14 per} bene in gruppi di 96 pozzetti e targhette di conseguenza. Seal e congelare le piastre a -20 ° C fino al momento dell'uso.
6. 1-2 giorni prima della trasfezione, le cellule cultura HEK293T in Modified Eagle Medium completo di Dulbecco (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici in un 37 ° C incubatore integrato con CO ₂ (finale 5%). Passaggio con tripsina e non consentono lo stock di diventare> 80% confluenti durante l'espansione. Un minimo di 6 x ¹⁰ 7 cellule sono necessari per lo schermo (circa 3 x 15 cm piatti di cellule HEK293T al 80% confluenza).

2. Trasfezione

Nota: Vedere la Figura 1 per un diagramma di flusso intero protocollo.

1. Se sono stati congelati piastre contenenti plasmidi chinasi, scongelare a temperatura ambiente unnd centrifugare a 1900 xg per 3 minuti per raccogliere l'umidità al fondo dei pozzetti.
2. Mescolare 8,6 ml di mezzo di siero ridotta (ad esempio, OPTI-MEM) con 312,7 ml di base lipidica trasfezione reagente. Lasciate riposare per 5 minuti.
3. Aggiungere 10 ml di mezzo di siero ridotto a ciascun pozzetto usando un dosatore automatico provvisto di un piccolo volume di cassette.
4. Aggiungere 10 ml per pozzetto di riduzione a medio siero / trasfezione miscela reagente dal punto 2.2 utilizzando un dosatore automatico provvisto di un piccolo vassoio di volume. Lasciate riposare per 20 a 45 minuti.
5. Risospendere le cellule 293T a 7,5 x 10 ⁵ cellule / ml a 80 ml ​​di DMEM completo. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare (cioè 7,5 x 10 ⁴ cellule) per pozzetto utilizzando un dosatore automatico munito di una cassetta volume standard.
6. Controllare pozzi al microscopio per la distribuzione cellulare uniforme e tornare a incubatore per 24 ore.

Pulldown 3. GST-chinasi

1. Fai fresh: 4 mm soluzione pervanadate mescolando 60 ml di 0,2 M vanadato di sodio con 540 ml di H ₂ O. In una seconda miscela tubo 2,7 ml di perossido di 30% e 1,4 ml di PBS. Aggiungere le due soluzioni insieme e lasciate riposare per 15 minuti prima dell'uso.
2. Usando una pipetta multicanale (non utilizzare un distributore automatico di liquido in quanto crea troppa turbolenza nel pozzo) dispensare 2 ml di 0,25 M _CaCl 2 in ogni pozzetto, seguiti da 2,5 ml di pervanadate preparato al punto 3.1. Incubare ogni piastra a 37 ° C per 10 min e poi posto su ghiaccio.
3. Preparare 35 ml di tampone di lisi con l'aggiunta di DTT, PMSF e vanadato di sodio come indicato nella Sezione 1 (Preparazione dei reagenti).
4. Mantenere le piastre in ghiaccio, rimuovere media da ogni pozzetto usando un aspiratore a vuoto. Aggiungere immediatamente 50 ml / pozzetto di tampone di lisi freddo ghiaccio utilizzando un dosatore automatico munito di una cassetta standard. Lasciare riposare 30 minuti in ghiaccio per Lyse (opzionale: può fermare qui, se necessario, plat di tenutaE e memorizzazione a -80 ° C. Per continuare, piastre disgelo su ghiaccio).
5. Piastre far girare a 1900 xg per 3 minuti a 4 ° C.
6. Raschiare le cellule da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e trasferire tutti i contenuti per etichettato in modo appropriato piastre 96 e V-bottom. Piastre far girare a 1900 xg per 10 minuti a 4 ° C.
7. Durante la rotazione, riempire piastre rivestite glutatione (uno per ogni piastra a 96 pozzetti) con 100 l / pozzetto di ghiaccio tampone di lisi freddo (senza PMSF) come un risciacquo. Mantenere le piastre in ghiaccio.
8. Rimuovere piastre V-bottom dalla centrifuga. Uno alla volta, capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e macchia su un tovagliolo di carta. Trasferire tampone di lisi dalle piastre V-bottom alle piastre glutatione inclinando la piastra e con una pipetta multicanale, facendo attenzione a non disturbare il pellet sul fondo. Coprire e lasciare le piastre in ghiaccio per un minimo di 2 ore per legare.
9. Vicino alla fine della fase di legame 2 hr, preparare una workstation radioattività, garantendo tegli necessarie precauzioni di sicurezza sono in atto per il lavoro radioattivo. Impostare fornetto di 30 ° C.
10. Preparare 200 ml di tampone di lisi aggiungendo DTT e sodio vanadate come indicato nella Sezione 1. PMSF non è necessario in questa fase.
11. Capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e asciugare su un tovagliolo di carta. Sciacquare pozzi 3x con 100 microlitri tampone di lisi (senza PMSF). Non lasciate che i pozzi si siedono a secco - tenerli in risciacquo fino al momento di procedere.
12. Preparare 55 ml di tampone chinasi 1x (KB) diluendo lo stock 10x e l'aggiunta di DTT come indicato nella Sezione 1. placche Sciacquare una volta con 50 ml di 1x KB utilizzando un dosatore automatico dotato di una cassetta volume standard. Lasciare 1x KB in pozzi fino a quando la soluzione A è pronta:
    1. Preparare una soluzione aggiungendo 500 a 530 ug del substrato di interesse, 500 mg di proteina basica della mielina (MBP), 2,65 ml di 10x KB, 13.25 ml di 1 M DTT e H ₂ O fino a 15,9 ml.
13. Uno alla volta, capovolgere le piastre su un lavandino per rimuovere 1x KB risciacquo, asciugare su carta assorbente, e subito aggiungere 30 ml di soluzione A utilizzando un dosatore automatico provvisto di un piccolo volume di cassette. Mantenere le piastre in ghiaccio.
14. Preparare Soluzione B nell'area di lavoro radioattività aggiungendo 2,5 ml 10x M-ATP, 500 pCi gamma- ³² P ATP, e H ₂ O a 10 ml.
    1. Aggiungere 20 ml di soluzione B per bene con una pipetta repeater che aiuta nel mescolare dovuto alla forza di espulsione. Coprire e incubare a 30 ° C ibridazione forno per 30 min.
15. Dopo 30 minuti, trasferire lastre di nuovo al ghiaccio. Aggiungere 50 ml di tampone di lisi 2x SDS in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Può procedere a questo punto il passo successivo, o sigillare le piastre con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C fino conveniente.

4. Esecuzione, colorazione, e gel di essiccazione

Nota: Tutti i lavori devono essere eseguiti in una zona DESIGNAted per la radioattività.

1. Accendete il forno di ibridazione e impostato a 85 ° C. Piastre scongelare a temperatura ambiente. Una volta che il forno ha raggiunto la temperatura, piastre di trasferimento a forno e incubare per 10 minuti a denaturare campioni.
2. Carico di 26 e gel prefabbricati con 15 ml di ogni reazione utilizzando una pipetta multicanale per riempire diversi pozzi in una sola volta. Bisogna fare attenzione che tutti i suggerimenti siano allineati con le corrispondenti bene prima di aggiungere i campioni. Eseguire gel a 150 V. Non lasciate che il colorante inseguimento (linea blu) scappare del fondo del gel come questo contiene il prive di personalità giuridica ATP.
3. Smontare i gel e tagliare la prive di personalità giuridica ATP (linea blu) con un bisturi o un bordo dritto come sarà sovraesporre i film. Mettere il gel in contenitori etichettati e coprire con macchia Coomassie per 15 min.
4. Rimuovere la macchia Coomassie, sciacquare brevemente il gel con acqua e aggiungere Decolorare soluzione. Decolorare i gel finché le proteine ​​sono chiaramente visibili. Una band per MBP e una banda per il substrato dovrebbevisibile per ogni campione.
5. Per asciugare i gel:
   1. Tagliare un grande foglio di carta da filtro e posizionarlo sul asciugatrice.
   2. Bagnate un foglio di cellophane in acqua distillata fino a che non è liscia e ruga libero, e posizionarlo sulla parte superiore del foglio.
   3. Disporre il gel sulla parte superiore del foglio di cellophane, prendendo nota dell'ordine di gel. Bagnare un secondo foglio di cellophane e posto sulla sommità del gel.
   4. Stendere tutte le bolle (un rullo di tenuta piatto funziona bene per questo) per una superficie bella uniforme. Chiudere il lembo, attivare il vuoto, ed asciugare il gel per 3 ore a 80 ° C.
6. Una volta che i gel sono asciutti, esporli a pellicola XAR utilizzando uno schermo per intensificare il segnale. Avvolgere la cassetta con involucro di saran o un sacchetto di plastica e sigillare con nastro adesivo per tenere fuori gelo. Conservare la cassetta a -80 ° C durante la notte.

5. Sviluppare XAR Films

1. Il giorno seguente, rimuovere cassetta dal freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente. Sviluppare il film inuna camera oscura utilizzando un processore pellicola secondo le istruzioni del produttore.
   Nota: Esaminare i film per la prova di coppie chinasi-substrato. Una seconda esposizione più lunga può anche essere utile per rilevare eventi di fosforilazione più deboli.

I risultati rappresentativi di uno schermo sono illustrati nella Figura 2. 180 chinasi sono stati proiettati utilizzando un peptide substrato GST-tag corrispondenti a aa 268-283 da CRTC2 così come la proteina basica classico saggio di chinasi substrato mielina (MBP). Solo due chinasi, MARK2 e altamente connessi MARK3 chinasi fosforilate il peptide CRTC2. MBP è incluso come controllo interno in tutti i saggi, in quanto contiene molti residui fosforilabili e funziona a 18 kDa, verso il fondo del gel. Questo permette una interpretazione di specificità: alcuni chinasi sarà robusta fosforilare un substrato e MBP. Da notare qui è che i pozzetti contenenti solo GST (ad esempio i controlli senza chinasi) purificano sempre qualche attività chinasi endogena, quindi c'è sempre sfondo fosforilazione nel dosaggio. Anche se questo non esclude che la fosforilazione del substrato è reale, suggerisce che in vitro in impostazione chinasi può essere meno selettiva.E 'particolarmente informativo per includere più substrati di diversa MW di trarre conclusioni sulle chinasi-specificità di substrato.

Figura 1. Diagramma di flusso che mostra passaggi chiave del protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Esempio di esito schermo. Autoradiografie di uno schermo di versione 1 della biblioteca (180 protein chinasi umani) eseguita utilizzando substrati GST-peptide corrispondente alla aa 268-283 di topo CRTC2 (riprodotto da Jansson et al., 2008). MBP, è indicato proteina basica della mielina. L'elevato grado di sselezione ubstrate da chinasi correlate è una caratteristica dello schermo. Ciascuna corsia rappresenta i prodotti di reazione di un saggio chinasico distinta. MARK3 (Gel 1) e MARK2 (Gel 16), gli unici chinasi di fosforilano TORC2 268-283 peptide, sono indicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Poiché le pubblicazioni originali descrivono l'approccio ^14,15, la libreria originale di 180 GST-chinasi è stata ampliata per 420 membri, o ~ 80% della proteina kinome umana. Con la libreria espanso, il protocollo come descritto richiede 4-5 giorni e poi 1-4 giorni per sviluppare film (se ritenuto necessario), che può essere ridotto mediante l'uso di phosphorimaging e valorizzazione segnale digitale. Ci sono diversi passaggi chiave in cui occorre prendere cura (vedi figura 1 per una panoramica di protocollo). In primo luogo, è la salute dello stock di cellule (micoplasmi libera, mai permesso di raggiungere la confluenza durante l'espansione, e trattati con tripsina ad ogni passaggio) durante la fase di espansione batch e nelle piastre da 96 pozzetti al momento della transfezione. Le cellule devono essere uniformemente testa di serie, e l'80% confluenti quando trasfezione ha luogo (punto 1.5).

In secondo luogo, è ideale durante la trasfezione di utilizzare un dosatore automatico per minimizzare il volume trasfer errori, limitando in tal modo il coefficiente di variazione ("cvs") tra i pozzi. Per i piccoli volumi, montaggio il distributore con un volume più piccolo perdita limiti cassette di reagente a causa di volumi morti ridotti e aumenta la precisione di erogazione. La fase di trattamento con pervanadate sodio, un inibitore della tirosina fosfatasi pan, è usato come stimolo generale per aumentare stato di fosforilazione delle chinasi bersaglio. Inclusione di calcio in questa fase aumenta l'adesione cellula-matrice, evitando la perdita di cellule a causa degli arrotondamenti indotta da trattamento pervanadate prolungato. Questo passo dovrebbe essere fatto con rigoroso rispetto del tempo di incubazione di 10 minuti.

In terzo luogo, per la chinasi test in sé, ci sono diverse considerazioni nella scelta del substrato ricombinante: peptidi, domini proteici, o proteine ​​intatte grandi come 120 kDa possono tutti essere usati. Se un sito di fosforilazione specifico è noto, un substrato peptidico è l'approccio più straight-forward, ma deve essere abbastanza grande da rilevaresu un gel SDS-PAGE. Pertanto, i substrati peptidici possono essere fuse a GST e purificate da batteri per dare un MW di> 25. Proteine ​​più grandi hanno il vantaggio che essi possono piegati e loro residui fosforilabili esposti come sarebbero nella cella, ancora giunto con l'inconveniente che includeranno residui aggiuntivi che potrebbero essere fosforilato e dare il segnale nel saggio. La nostra preferenza è di eseguire uno schermo mediante un substrato peptidico composto di 15-20 aminoacidi che circondano un residuo che è noto per essere fosforilata in vivo ed è noto regolare evento biologico, poiché questo rende convalida delle chinasi candidati dalla schermata sia in vitro e in vivo molto più velocemente.

Ultimo, idealmente la quantità di approcci di proteine ​​o superiore a 1 mg per bene; questo naturalmente varia con la MW del substrato. Meno proteine ​​per bene può produrre risultati significativi, ma il 'di più è meglio' regola si applica in quanto aumenta il segnale: noise. Standard, gel non gradiente sono raccomandati come gel gradiente crepa troppo spesso durante l'asciugatura. Dopo l'essiccazione il gel, il rilevamento di un segnale radioattivo su sfondo con un contatore Geiger dà un'ottima indicazione del successo del test.

Poiché lo schermo è in vitro ed esistono ulteriori livelli di complessità in vivo, una chinasi candidato (s) per un determinato substrato deve essere convalidato in cellule. In particolare, lo schermo può identificare un membro della famiglia che ha la capacità biochimica di fosforilare il substrato in vitro, ma non è espresso nello stesso tipo cellulare o nello stesso compartimento subcellulare come substrato. Ad esempio, mentre MARK2 e MARK3 erano entrambi risultati in una schermata per chinasi che può fosforilare CRTC2 sulla Ser275, solo MARK2 formato un complesso con il substrato in cellule ^14. La seguente è una serie di esperimenti supplementari che possono essere utilizzati per confermare la rilevanza fisiologica di una chinasi candidato. Abetest, mobilità spostamenti del substrato su SDS-PAGE seguito coespressione della chinasi candidato può essere utilizzato come controllo conferma. Controlli appropriati tale cotrasfezione di una chinasi attività catalitica in grado di confermare la specificità. In secondo luogo, il substrato può essere immunoprecipitata da estratti cellulari che sono stati incubati con ^{32 P-ortofosfato} per confermare l'incorporazione di fosfato nel substrato in presenza del tipo selvatico e non una chinasi cataliticamente inattiva. In terzo luogo, un anticorpo phosphospecific può essere generato contro la sequenza phosphoacceptor (se conosciuto) e usato per confermare un aumento della fosforilazione del substrato quando la chinasi è sovraespresso. Uno schermo secondario con un substrato mutante con un residuo non fosforilabile al sito bersaglio può confermare la specificità prima generazione di un phosphoantibody, un controllo particolarmente importante con grande dominio e proteina intera substrati. Inibizione farmacologica approcci per inibire un candiData chinasi può essere utilizzato anche, ma la cautela deve essere esercitata come l'inibizione della chinasi correlate è una realtà sottovalutata. Ultimo, silenziamento della chinasi candidato (s) in cellule RNAi mediata seguita e western blotting per controllare la perdita di fosforilazione sito bersaglio con un anticorpo phosphospecific può essere effettuata.

The authors have nothing to disclose.

Questo lavoro è stato sostenuto da NSERC concessione 386634. Vorremmo ringraziare i membri della Screaton Lab per le discussioni utili.