המחברים מבקשים להודות פרופ &#39;מאוריציו Masi לדיון פורה מיס קיארה Allegretti לעריכה השפה. מחקר &#39;מחברים נתמך על ידי Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero דלה הצדעה GR-2010- 2,312,573).

הערה: כימיקלים המשמשים כפי שהתקבלו. לינארית RGD נרכש, אבל זה יכול להיות מוכן על ידי סינתזה פפטיד שלב מוצק רגיל Fmoc 16,19. ממסים של כיתת אנליטי. הדיאליזה מחייבת שימוש קרום עם M w חתוך שווה 3,500 Da. התרכובות המסונתזות מאופייני 1 ספקטרום NMR H ונרשם על כלורופורם באמצעות ספקטרומטר 400 MHz (CDCl 3) או תחמוצת דאוטריום (D 2 O) כמו ממסים, משמרות כימיות מדווחות כערכים δ חלקים למ&#39;. יתר על כן, הידרוג חשוף ניתוח FT-IR באמצעות טכניקה גלולה KBR והאפיון הפיזי שלהם כרוך מחקרי gelation הוערכו באמצעות המבחנה ההפוכה ב 37 ° C. 1. סינתזה של 4-Azidobutanoyl כלוריד 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 500 מ&quot;ג של 4-azidobutanoic חומצה (3.90 מילימול) ב 10 מ&quot;ל של dichloromethane ו -0.5 מ&quot;ל של dimethylformamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את הפתרון ב 0 ° C, באמצעות אמבט קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 505 μl של כלוריד oxalyl (5.85 מילימול) עד ​​5 מ&quot;ל של dichloromethane ולאט לאט מוסיפים dropwise למערכת התגובה, תוך ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 ב 0 ° C באמצעות באמבט קרח, לחזור לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את המוצר הנרכש על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת המדגם ב CDCl 3 16. </li></ol> 2. סינתזה של-אזיד RGD נגזרים 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מ&quot;ג של RGD (0.145 mmol) ב 1 מ&quot;ל של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 24 מ&quot;ג 1 (0.16 מילימול) ב 2 מ&quot;ל של tetrahydrofuran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את כל הפתרון RGD כדי dropwise פתרון 1 ב 0 ° C באמצעות אמבט קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור לטמפרטורת החדר ומערבבים לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 1 M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את OBTained המוצר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16. </li></ol> 3. PAA אלקין שינוי 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 200 מ&quot;ג של 35% w / w פתרון PAA (2.8 מילימול) ב 15 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15.4 מ&quot;ג הידרוכלוריד propargylamine (0.20 מילימול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 42.8 מ&quot;ג של מימה 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 0.28 מילימול) ב 14 מ&quot;ל של 1: פתרון מים מזוקקים על ידי חימום עד 50 מעלות צלזיוס: 1 v / v אצטוניטריל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את כל הפתרון HOBt לפתרון PAA בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 53.6 מ&quot;ג של ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0.28 מילימול) לתערובת התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 M HCl כדי להתאים את ה- pH ל 5.5 ומערבבים מערכת התגובה הלילה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M w החתוך של 3.5 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> perform דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הפולימר הפונקציונלי ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16. </li></ol> 4. סינתזה של PAA-RGD פולימר 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 78 מ&quot;ג של PAA שונה אלקין 3 (1.083 mmol) ב 10 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 25 מ&quot;ג של הנגזר אזיד 2 RGD (0.0722 מילימול) ב 5 מ&quot;ל של tetrahydrofuran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את כל הפתרון RGD לפתרון פולימריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.2 מ&quot;ג של יודיד נחושת (0.0116 מילימול) ו -2.2 מ&quot;ג של ascorbate נתרן (0.0111 מילימול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפלוקס את התערובת וכתוצאה מכך לילה בשעה 60 ° C, עם ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את התערובת עד 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyzדואר הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M w החתוך של 3.5 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ&quot;ל של 37% w / w HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את המוצר הנרכש על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16. </li></ol> 5. פונקציונליות RGD סינתזה הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את PBS. ממיסים 645 מ&quot;ג מלח PBS ב 50 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערבבו 40 מ&quot;ג של carbomer ו -10 מ&quot;ג של פונקציונליות PAA 4 ב 9 מ&quot;ל של PBS (שלב 5.1), בטמפרטורת החדר, עד המסה מלאה (30 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 400 מ&quot;ג של PEG לפתרון ולשמור ערבוב במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הערבוב ולאפשר למערכת להתיישב למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 N NaOH כדי להתאים את pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 5 מ&quot;ל של תערובת שהושג, להוסיף 25 מ&quot;ג של אבקת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרין את המערכת עם קרינת מיקרוגל ב -500 W עד רתיחה, במשך זמן בדרך כלל בין 30 שניות ו 1 דקות, ולאחר אלקטרומגנטית לחמם עד 80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את התערובת חשופים בטמפרטורת החדר עד לטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 מ&quot;ל של PBS (שלב 5.1), על מנת לקבל פתרון ביחס של 1: יחס נפח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 12 גלילי פלדה המכילה multiwell צלחת בקוטר של 1.1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 500 aliquots μl מהפתרון ומניח אותם לכל גלילי פלדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר במנוחה במשך 45 דקות עד gelification מלא במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלונים באמצעות מלקחי נירוסטה להשיג את הידרוג. </li></ol> 6. טוען של כלי טיפולי (Drug או תאים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור steps 5.1-5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהתערובת (כבר מדינת סול) מגיעה 37 ° C, להוסיף 5 מיליליטר של התמיסה המכילה פתרון תרופה הרצוי או תרבית תאים, כדי לקבל מערכת סופית ביחס של 1: יחס נפח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.9-5.12 להשיג ברשתות פולימריות עם biocompounds בפח פיזי בתוך הג&#39;ל. </li></ol> 7. אפיון הידרוג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FT-IR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היווצרות קריש, להשרות אחד הידרוג synthetized ב 2.5 מ&quot;ל של מים מזוקקים למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מימית שבו הידרוג&#39;ל הוא שקוע ולהקפיא-יבש עם נוזלי N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרבד המדגם הידרוג&#39;ל פי טכניקה גלולה KBR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מרית מלאה KBR לתוך מרגמה אגת. קח כמות קטנה של מדגם הידרוג&#39;ל (כ 0.1-2% מסכום KBR, או רק מספיק כדי לכסות את קצה מרית) ומערבבים עם אבקת KBR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את התערובת עד שהאבקה בסדר והומוגני. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת גלולת KBR ליצירת גלולת IR. לחץ על האבקה באמצעות עיתונות מעבדה ידנית: 3 דקות ב קיבולת לחץ שווה ל 5 טון ולאחר מכן במשך 3 דקות בתפוקת לחץ של 10 טון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הלחץ להשגת הגלולה הסופית כפי הומוגנית ושקופה במראה. הכנס גלולה לתוך מחזיק מדגם IR ולהפעיל את ספקטרום 16. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחקרים gelation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 2 מ&quot;ל צינור microcentrifuge עם 900 μl של PBS לאזן ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של פתרון פולימר מוכן ליצור את הידרוג&#39;ל לדגור על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הצינור ולבחון אם הג&#39;ל זורם בבית 1, 2, 5, 10 ו -20 דקות. רשום את המועד שבו הג&#39;ל אינו זורם כמו בפעם gelation. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+in+Regenerative+Medicine.">Hydrogels in Regenerative Medicine.</a> Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).</li><li>Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+options+for+drug+delivery+to+the+spinal+cord.">Current options for drug delivery to the spinal cord.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10 (3), 385-396 (2013).</li><li>Huebsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell/matrix+interface+to+control+stem-cell+fate.">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li><li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+spinal+cord+by+transplantation+of+neural+stem+cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel.">Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li><li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels.">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat. Mater. 12 (5), 458-465 (2013).</li><li>Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+drug+delivery+system+with+predictable+and+tunable+drug+release+and+degradation+rates.">Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (6), 2318-2323 (2013).</li><li>Rossi, F., van Griensven, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Functionalization+as+a+Powerful+Tool+to+Improve+Scaffold+Performances.">Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances.</a> Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2043-2051 (2014).</li><li>Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+peptide+functionalized+thiol-ene+hydrogels+as+culture+substrates+for+understanding+valvular+interstitial+cell+activation+and+de+novo+tissue+deposition.">Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition.</a> Acta Biomater. 8 (9), 3201-3209 (2012).</li><li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Controlled+Photocleavage+for+the+Orthogonal+and+Sequential+Release+of+Multiple+Proteins.">Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 52 (51), 13803-13807 (2013).</li><li>Larra&#241;eta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-Assisted+Preparation+of+Hydrogel-Forming+Microneedle+Arrays+for+Transdermal+Drug+Delivery+Applications.">Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications.</a> Macromol. Mater. Eng. 300 (6), 586-595 (2015).</li><li>Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-Assisted+Hydrogel+Synthesis:+A+New+Method+for+Crosslinking+Polymers+in+Aqueous+Solutions.">Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions.</a> Macromol. Rapid Comm. 33 (4), 332-336 (2012).</li><li>Perale, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug+delivery+hydrogel+system+for+spinal+cord+injury+repair+strategies.">Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies.</a> J. Control. Release. 159 (2), 271-280 (2012).</li><li>Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Library+of+Tunable+Agarose+Carbomer-Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications:+The+Role+of+Cross-Linkers.">A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (4), 2211-2221 (2012).</li><li>Frith, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+hydrogel+incorporating+mesenchymal+precursor+cells+and+pentosan+polysulphate+for+intervertebral+disc+regeneration.">An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9430-9440 (2013).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry:+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions.">Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 40 (11), (2001).</li><li>Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-assisted+synthesis+and+click+chemistry+as+simple+and+efficient+strategy+for+RGD+functionalized+hydrogels.">Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels.</a> Tetrahedron Lett. 55 (50), 6817-6820 (2014).</li><li>Ossipov, D. A., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(vinyl+alcohol)-based+hydrogels+formed+by+&amp;#34;click+chemistry&amp;#34.">Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by &amp;#34;click chemistry&amp;#34.</a> Macromolecules. 39 (5), 1709-1718 (2006).</li><li>Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+and+Amphiphilic+Polyethylene+Glycol-Based+Hydrogels+with+Tunable+Degradability+Prepared+by+&amp;#34;Click&amp;#34;+Chemistry.">Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by &amp;#34;Click&amp;#34; Chemistry.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 4012-4021 (2012).</li><li>Hou, R. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+synthetic+route+for+RGD+tripeptide.">New synthetic route for RGD tripeptide.</a> Prep. Biochem. Biotechnol. 36 (3), 243-252 (2006).</li><li>Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Degradation+of+Agar-Carbomer+Based+Hydrogels+for+Tissue+Engineering+Applications.">Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications.</a> J. Appl. Polym. Sci. 123 (1), 398-408 (2012).</li><li>Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+drug+delivery+using+chemoselective+functionalization+of+hydrogels.">Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels.</a> Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).</li><li>Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+Polymer+Library+for+Developing+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiac+Patches.">Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches.</a> Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+hydrogel-Nanoparticles+release+system+for+sustained+combination+therapies+in+the+spinal+cord.">Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord.</a> Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).</li><li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery.">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 8 (24), 1128-1137 (2003).</li><li>Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+to+functional+hyaluronic+acid+hydrogels+using+orthogonal+chemical+reactions.">Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions.</a> Chem. Commun. 46 (44), 8368-8370 (2010).</li><li>Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+performance+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+cell-degradable+polymer-peptide+hydrogels.">The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (14), 3564-3574 (2011).</li><li>Caron, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+three+dimensional+biomimetic+hydrogel+to+deliver+factors+secreted+by+human+mesenchymal+stem+cells+in+spinal+cord+injury.">A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury.</a> Biomaterials. 75, 135-147 (2016).</li><li>Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+spacer+arm+length+between+adhesion+ligand+and+alginate+hydrogel+on+stem+cell+differentiation.">Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation.</a> Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).</li><li>Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Release+of+Low+Molecular+Protein+Insulin-like+Growth+Factor-1+through+Self-Assembling+Peptide+Hydrogel+with+Biotin+Sandwich+Approach.">Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach.</a> J.Biomed. Eng. 32 (2), 387-392 (2015).</li></ol>

The authors state no conflict of interest and they have not received any payment in preparation of this manuscript.

The PAA post-polymerization modification with alkyne moieties and the RGD functionalization with the azide group guarantee the formation of a stable bond between the polymer and the peptide. Indeed, triazole serves as a rigid linking unit among the carbon atoms, attached to the 1,4 positions of the 1,2,3-triazole ring and it cannot be cleaved hydrolytically or otherwise. In addition, triazole is extremely difficult to oxidize and reduce, unlike other cyclic structures such as benzenoids and related aromatic heterocycles24. In this way, the chemical lability of PAA-RGD product is almost absent under the experimental conditions of hydrogel synthesis. The peptide is grafted to the 3D polymeric network due to the nature of its chemical bond and it is not physically entrapped (therefore, it could leave the system).
The alkyne PAA is prepared using propargylamine in an aqueous solution, in the presence of EDC and HOBt, to obtain the amine derivative. Experimental results indicate that the percentage of triple bond linking to the PAA is proportional to the amount of amine used. Referring to the NMR analysis, the polymer functionalization degree is between 90% and 100% when the molar ratio between the reagents PAA and propargylamine is 1:1 and is about 50% when the ratio is 1:0.5. Due to the fact that the formation of the gel network involves an esterification reaction, it is necessary to maintain some PAA carboxyl groups capable of reacting with hydroxyl groups of PEG and agarose. The modification of half PAA carboxyl groups is adequate for this, but hydrogels with improved physicochemical properties are obtained when the polymer functionalization degree is equal to 10% (molecular ratio PAA:propargylamine 1:0.1)25. The purification of the alkyne PAA is performed by dialysis, using a dialysis membrane with molecular weight cut-off (MWCO) of 3.5 kDa, allowing the removal of by-products and unreacted species. The product is finally isolated using lyophilization. 
RGD is characterized by the amino terminal group -NH2, which can be used as a coupling point to link the spacer-N3. The linkage between these compounds is obtained via an amide bond that is very stable and not too difficult to form16. In order to proceed in this way, 4-azidobutanoyl chloride is prepared as the linker of the spacer-N3 system. 
The alkyne moieties react with the RGD-azide derivative, through a click reaction, using copper iodide as a catalyst and sodium ascorbate as an antioxidant agent due to the possible oxidation of copper (Cu+ &#8594; Cu2+) in experimental atmospheric conditions. After screening different solvents and temperatures, the best results are performed by using a tetrahydrofuran/water mixture at 60 &#176;C16. According to the biological application, the post-synthesis retention of copper poses potential toxicity risks, especially for applications where the cells must remain viable. As a solution, dialysis is used to remove the copper catalyst and other by-products, obtaining a purified PAA-RGD compound suitable for hydrogel synthesis without any possible side effects. Click chemistry ensures a quantitative yield of the polymeric product grafting RGD. 
Due to the same reactivity of each PAA carboxyl group, the polymer functionalization is statistically evaluated. The exact number of modified carboxyl groups per PAA chain cannot be established and the reported functionalization degree is referred as the total number of carboxyl groups that have reacted with propargylamine. This estimation affects the subsequent assessment of the RGD functionalization and its effective amount loaded into each hydrogel. In addition, GPC analysis is not performed because in this work, the polymer is used and the protocol does not begin from monomers. The percentage of RGD functionalization is commonly verified with 1H-NMR and it is not possible to obtain reliable data from HPLC analysis. However, considering that each step of this work is replicated many times and the same experimental values and results are recorded, the illustrated results are reliable.
Another limitation is the use of copper as the catalyst as previously reported. The possible interaction of the copper with the PAA carboxyl groups during the click reaction and its subsequent presence as an entrapped molecule in the hydrogel network would reduce the biocompatibility of the system and would generate toxic effects in cell cultures. The three-day dialysis minimizes this potential limitation of the technique.
The functionalized PAA is used as a subunit in hydrogel formation, with carbomer, PEG and agarose. Carbomer and agarose are chosen because of their well-known biocompatibility in therapeutic approaches and tissue engineering. Carbomer also has anti-inflammatory properties while agarose is a suitable polymer for tissue repair strategies and provides a good environment for cell adhesion, spreading, proliferation, and protein drugs. Carbomer is a cross-linked poly-acrylic acid containing carboxyl groups (65%) that make it an ionizable molecule. The molecular weight is 106 Da. Its use is fundamental for gel synthesis due to its high number of reactive carboxyl groups. However, at the same time, it is very difficult to estimate a quantitative yield of any possible chemical functionalization because of its complex structure. For this reason, PAA is used due to its lower molecular weight (105 Da) and its linear structure. The combination of carbomer and PAA allows the design of gel networks with a RGD moiety that, otherwise, would not be viable. PEG is also introduced into the gel network due to its high biocompatibility, its ability to increase stem cell adhesion, and its high elasticity (being a small polymer) that can create elastic junctions between the carbomer and the agarose to form local interconnections through their own hydroxyl groups26. It also has a physical effect by increasing system viscosity and thus enhancing tight macromer cross-linking.
The use of the four polymers leads to a 3D network that is highly biocompatible, injectable and capable of maintaining its biochemical functionality with improved cell adhesion due to the presence of RGD. The latter is decisive in generating a suitable cell microenvironment within the hydrogel that otherwise would not give a satisfactory result27.
The hydrogel network can be consider as a "carbon skeleton" of macromolecules forming a stable structure comprised mostly of C-C bonds, where the cross-linking points are C-O bonds formed by esterification between carboxyl and hydroxyl groups. The microwave irradiation is a key point to ensure the agarose solubility in the aqueous reagent system and to avoid any further purification in the synthesis of sterile hydrogels via the sol/gel transition, because any initiators or monomers can be used and by-products are not formed. The microwave-assisted reaction also guarantees a high efficiency, and the functionalization degree of polymer chains with bioactive compounds or drugs generally does not affect the morphology, the structure, and the physical properties of the networks. These hydrogels are able to form in situ due to their ability to easily conform to any shape and be injected using minimally invasive surgical procedures. This is a significant advantage compared to the use of rigid and preformed scaffolds.
The synthesized networks can be used as an enhanced cell survival biomaterial, thanks to its high biocompatibility and the ability to create a hospitable cell microenvironment27. The improvement of this work is the ability to design a three-dimensional structure where the RGD is chemically linked through a stable and strong bond that is not cleavable in physiological conditions, thus avoiding RGD diffusion through the hydrogel pores to maintain its therapeutic effect at a high level for a long and sustained period of time. Alternative synthesis of chemical linkers, such as the ester or the hydrazone bonds, do not allow the same effect towards cells because they are cleavable, or pH/temperature sensitive under the cell microenvironment21,28,29. In addition, the tripeptide release is mostly driven by a pure diffusion mechanism that is very quick due to its small steric hindrance. The alternatives to modifications of the physical and mechanical parameters of the hydrogel network, for example reducing pores size, cannot be enough to maintain an adequate concentration of RGD within the matrix.
A possible additional functionalization is the use of fibronectin, which can optimize the hydrogel compatibility with the extracellular matrix in order to make viable living cells. One of the most important aspects is maintaining cell viability within hydrogel networks for days. In this way, cells can leave the matrix able to proliferate and differentiate in vivo. The first experimental results are published27. This highlights the comparison between RGD-functionalized hydrogels and non-functionalized hydrogels showing promising results. In particular, the RGD in the gel network improves stem cell survival and guarantees the immunomodulation of the pro-inflammatory and pro-regenerative effect at the lesion site in vivo. The presence of RGD linked to the hydrogel is a crucial point to achieve suitable therapeutic results. The RGD maintains its availability for cell interactions and it does not escape rapidly through hydrogel pores, maintaining its bioactive impact.

הידרוג הן רשתות תלת מימדי נוצר על ידי פולימרים צולבים הידרופילי, אשר הם טבעיים או סינתטיים, ואת המאופיינת במבנה תלת מימדי ייחודי. מכשירים אלו אטרקטיביים יותר ויותר בתחומי הביו-הרפואיים של אספקת סמים, הנדסת רקמות, נושאות גנים 1,2 חיישנים חכמים. אכן, תכולת המים הגבוהה שלהם, כמו גם המאפיינים rheological המכאניים שלהם להפוך אותם מועמדים מתאימים לחקות microenvironments רקמות רך ולגרום להם כלים יעילים ציטוקינים מסיסים במים או מסירת גורם גדילה. אחד לשימוש המבטיח ביותר הוא בתור ביולוגי בזריקות נושאת תאי תרכובות ביו. הידרוג עשוי לשפר הישרדות תא ואת גורלו תאי גזע מלא על ידי החזקה ודווקא מתן אותות רגולטוריות תאי גזע באופן רלוונטי פיסיולוגי, כפי שנצפה במבחנה בניסויי vivo 3,4. היתרון המוביל של זה הוא האפשרותכדי לשמור על תאים מוזרקים בתוך האזור של חיסון (in situ), הפחתת כמות התאים שמשאירה את שטח extravasates לתוך מבול הדם, נודד בכל רחבי הגוף ואיבוד יעד המטרה 5. היציבות של רשתות הידרוג&#39;ל תלת ממדי נובעת מאתרי cross-linking שלה, שהוקמו על ידי קשרים קוולנטיים או כוחות משיכה בין שרשרות הפולימר 6. במסגרת זו, כימיה סלקטיבית מאונכת להחיל שרשרות פולימר הוא כלי תכליתי מסוגל לשפר את הביצועים הידרוג&#39;ל 7. ואכן, השינוי של פולימרים עם קבוצות כימיות מתאימות יכול לעזור לספק כימי מתאים, פיזי תכונות מכאניות לשפר כדאיויות תא והשימוש בם היווצרות רקמה. באותו אופן, בין הטכניקות לטעון תאים או גורמי גדילה בתוך מטריצת ג&#39;ל, השימוש של פפטיד RGD מאפשר שיפורי הידבקות תא והישרדות. RGD הוא tripeptide מורכבשל ארגינין, גליצין וחומצה אספרטית, שהוא בלי ספק היעיל ביותר, ולעתים קרובות מועסקי tripeptide בשל יכולתה לטפל יותר קולטן הידבקות תא אחד וההשפעה הביולוגית שלה על עיגון תא, התנהגות והישרדות 8,9. בעבודה זו, הסינתזה של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמדת במטרה בעיצוב הרשתות מאופיינות תכונות הביוכימיות מספיק עבור microenvironment תא מסבירי פנים. שימוש קרינת מיקרוגל בסינתזה הידרוג&#39;ל מציע הליך פשוט כדי למזער תגובות לוואי ולקבל שיעורי תגובה גבוהים ותשואות בתוך פרק זמן קצר יותר לעומת התהליכים התרמיים הקונבנציונליים 10. שיטה זו אינה דורשת צעדים טיהור והתשואות הידרוג&#39;ל סטרילית בשל אינטראקציות של פולימרים והיעדר ממיס אורגני במערכת התגובה 11. לכן, היא מבטיחה באחוזים גבוהים של RGD צמוד רשת הפולימרים כי אף modifications נדרש הקבוצות הכימיות פולימר המעורבים ביצירת ג&#39;ל. קבוצות carboxyl, מן PAA ו carbomer, וקבוצות הידרוקסיל, מ PEG ו agarose, להצמיח את המבנה התלת-ממדי הידרוג&#39;ל באמצעות תגובה polycondensation. הפולימרים ציינו משמשים לסינתזה של הידרוג בטיפולים תיקון פגיעה בחוט השדרה 12. התקנים אלה, כפי שדווח קודם עובד 13,14, להראות התאמה ביולוגית גבוהה, כמו גם תכונות מכניות physicochemical הדומים לאלו של רקמות חיות רבות בטבע thixotropic. יתר על כן, הם נשארים מקומי באתרו, על אזור ההזרקה. בעבודה זו, קבוצות carboxyl PAA הם שונים עם מחצית אלקין (איור 1), וכן תרכובת RGD-יזיד הוא מסונתזת ניצול תגובתיות של קבוצת מסוף tripeptide -NH 2 עם תרכובת כימית מוכנה עם מבנה (CH 2) n - N 3 (&lt;strong&gt; איור 2). כתוצאה מכך, PAA השונה מגיב עם נגזר RGD-יזיד הקלקה CuAAC התגובה 15-17 (איור 3). שימוש זרז נחושת (I) מוביל לשיפורים משמעותיים בשני קצב התגובה ואת רגיוסלקטיביות. התגובה CuAAC נעשה שימוש נרחב סינתזה אורגנית ב מדע הפולימרים. הוא משלב יעילות גבוהה וסובלנות גבוהה הקבוצות הפונקציונליות, וזה מושפע שימוש בממסים אורגניים. סלקטיביות גבוהה, זמן תגובה מהיר הליך טיהור פשוט לאפשר הקניית פולימרי כוכב, קופולימרים לחסום או שרשרות השתלת moieties רצוי 18. האסטרטגיה לחץ זה מאפשר לשנות פולימרים לאחר פילמור להתאים אישית את מאפייני physicochemical בהתאם ליישום ביוכימיים הסופי. תנאי ניסוי CuAAC הם לשחזור בקלות (התגובה היא לא רגישה למים, ואילו חמצון נחושת עלול להתרחש מינימאלי), והמהותtriazole נוצר מבטיח יציבות של המוצר. השימוש מתכת נחושת יכול להיחשב נקודה קריטית, עקב השפעה רעילה הפוטנציאל שלה נגד תאים והן במיקרו-סביבה ביולוגית, אבל דיאליזה משמש כשיטה טיהור כדי לאפשר פינוי מוחלט של שאריות קטליטי. לבסוף, PAA שונה RGD משמש סינתזה הידרוג&#39;ל (איור 4) ואת מאפייני physicochemical של רשתות וכתוצאה נחקרות, על מנת לבדוק את הפונקציונליות הפוטנציאל של מערכות אלה כנשאים תאים או סמים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> איור 1: PAA שונה סינתזה אלקין סכימה של functionalization PAA עם קבוצת אלקין;. &quot;n&quot; מציין את מונומרים עם קבוצת carboxyl מגיבים עם propargylamine. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> איור 2:.. סינתזה-יזיד RGD הסינתזה של נגזרי RGD-יזידו <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> איור 3: לחץ תגובת תכנית תגובה קליק בין נגזרת RGD-יזיד ו-PAA אלקין.. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> איור 4: הידרוג&#39;ל synthesis. הליך סינתזת הידרוג&#39;ל פונקציונלי RGD. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="521">
	<tbody>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:183px;">Poly(acrylic acid) solution average Mw ~ 100,000, 35 wt % in H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">523925</td>
			<td style="width:145px;">CAS 9003-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 2,000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>84797</td>
			<td>CAS 25322-68-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbomeer 974P</td>
			<td>Fagron</td>
			<td>1387083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen Corp.</td>
			<td style="width:87px;">16500-500</td>
			<td>UltraPure Agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RGD peptide</td>
			<td style="width:108px;">abcam</td>
			<td>ab142698</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4-azidobutanoic acid</td>
			<td style="width:108px;">Aurum Pharmatech</td>
			<td style="width:87px;">Z-2421</td>
			<td>&#160;CAS 54447-68-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxalyl chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>O8801</td>
			<td>CAS 79-37-8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Propargylamine hydrochloride 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P50919</td>
			<td>CAS 15430-52-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Copper(I) iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3140</td>
			<td>CAS 7681-65-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0000039</td>
			<td>CAS 134-03-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;">Dialysis Membrane</td>
			<td style="width:108px;">Spectrum Laboratories, Inc.</td>
			<td>132725</td>
			<td style="width:145px;">Spectra/Por 3 Dialysis Membrane&#160; Standard RC Tubing&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MWCO: 3,5 kD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the synthesis of rgd-functionalized hydrogels as a tool for therapeutic applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

נגזר אלקין PAA הוא מסונתז ביעילות מחומצת polyacrylic ו propargylamine, כפי הראה באיור 1 כאשר n תוויות את מונומרים אשר קבוצות carboxyl מגיבים עם אמין. זהות המוצר אושר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR. איור 5 מראה 1 ספקטרום H-NMR של PAA שונה עם אג&quot;ח משולש. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig5.jpg" /> איור 5: 1 H-NMR ספקטרום של PAA שונה אלקין האות הקשורים מחצית אלקין מודגש.. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> האותות של שרשרת הפולימר ניתן לצפות בטווח 2.75-1.50 ppm; ואילו לשיא ב 2.8<html> 0 ppm, נציג של H של אלקין, ואת לשיא ב 4.20 ppm, הקשורים 2 H של -CH 2, לאפיין את מחצית propargyl. זו מאשרת כי PAA שונתה כראוי. הערכת מידת functionalization אלקין בוצע על ידי שילוב השטח מתחת פסגות PAA (מוגדר 3.00, בהתאם למספר של מימנים לכל מונומר) ואת מחצית propargyl, כפי שמודגם באיור 5. מידת f functionalization הוא מחושב: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54445/54445eq1.jpg" /><img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54445/54445eq2.jpg" /> מייצגת את האזור הנפרד שאריות propargyl, הסכום של שטח H של אלקין (שכותרתו <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54445/54445eq3.jpg" /> ) ואזור -CH 2 (מסומן כמו <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54445/54445eq4.jpg" /> ), ואילויון &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,445 / 54445eq5.jpg &quot;/&gt; מתייחס לאזור נפרד אותות פולימר. מידת functionalization מחושב כ- 10% וזה לשקול משביע רצון על פי סינתזה הידרוג&#39;ל, שם יש PAA להגיב באמצעות קבוצות carboxyl השייר שלו כדי ליצור את רשת 3D. תשואה כמותית מתקבלת עבור הפולימר השונה 16. באופן דומה, איור 6 מציג את ספקטרום 1 H-NMR של המוצר לאחר תגובת לחץ CuAAC בין PAA השונה אלקין ו-יזיד RGD. שיאם של triazole נוצר 8.15 ppm מאשר כי התגובה מתרחשת תשואת כמותיים RGD הוא מקושר חזק רשתות PAA. איור 6 מציגים את כל אותות המאפיין של שרשרת PAA ואת RGD. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig6.jpg" /> איור 6:הספקטרום 1 H-NMR של RGD צמוד PAA. האות של triazole מותווה (שכותרתו &quot;A&quot;). Functionalization פולימר RGD דרך התגובה לחץ CuAAC מתבצע. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הידרוג פונקציונליות RGD ערוכים דרך cross-linking הכימי של ארבעה פולימרים (PAA, carbomer, agarose ו PEG) על ידי פילמור רדיקלים חופשיים בסיוע מיקרוגל. חימום עד 80 מעלות צלזיוס מוביל ניידות macromer גבוהה, ובכך משפר את קשרים קצר טווח בין קבוצות carboxyl ו הידרוקסיל של הפולימרים. תגובת esterification מתקיימת בין קבוצות הפונקציונליות אלה ומייצרת רשתות מקומיות בשם &quot;microgels&quot;. ככל שמתקדם polycondensation, העליות צמיגות המערכת באופן רציף, wHile ההסתברות של אינטראקציה בין תגובתי אתרי macromer פוחתת. אף על פי כן, הקבוצות הפונקציונליות הקרוב עדיין אינטראקציה יעילה בשל ניידות איטית. תנאי physicochemical וכתוצאה מכך מאופיין &quot;ריתוך&quot; בין משטחי microgel שמייצר את macrostructure 3D הסופי של הידרוג&#39;ל. Esterification, מליטה מימן carboxylation להביא שרשראות הפולימר סטטיסטית קרוב, ובכך יצרו מבנה הטרוגני יציבה. המערכת וכתוצאה מפגין סול / התנהגות ג&#39;ל וזה מעבר מדינת ג&#39;ל בתוך 5 דקות. מרווח הזמן הזה הוא כפי שדווח זמן gelation. האופי הכימי של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמד באמצעות ניתוח FT-IR. איור 7 מציג את ההשוואה בין ספקטרה FT-IR של מתחם RGD-יזיד (קו ירוק), הידרוג המסונתז ללא functionalization RGD (קו שחור), ו הידרוג עם שינוי פפטיד (קו כחול). המפרט הידרוג&#39;לtra הן מאופיינות אות רחבה 3,600-3,200 -1 ס&quot;מ טווח, נציג רטט מתיחה של אג&quot;ח שיורית אה ודרך לשיא סביב 2,940 -1 ס&quot;מ של מתיחה CH. התיקוף כי esterification מתרחשת בין קבוצות פולימר carboxyl ו הידרוקסיל ניתן על ידי הפסגות סביב 1,600 -1 סנטימטר ו -1,400 -1 סנטימטר, מתאים, בהתאמה, על סימטריות סימטרי מתיחה של מחצית 2 CO. פסגות אלה גלויות יותר בספקטרום של הידרוג&#39;ל הלא הפונקציונלי, ואילו בספקטרום RGD-הידרוג&#39;ל הם מכוסים חלקית על ידי האותות הצביעו כפסים אמידים I ו- II. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig7.jpg" /> איור 7:. השוואה של ספקטרה FT-IR ספקטרה FT-IR של RGD (קו ירוק), הידרוג&#39;ל ללא functionalization RGD (קו שחור) ו RGD הידרוג&#39;ל הפונקציונלי (קו כחול). האות קשור האמיד RGD מותווה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מתיחה של C = O, שכותרתו כלהקה אמיד לי ( &quot;אמיד אני&quot; באיור 7), מציגה שיא 1,650 -1 ס&quot;מ בספקטרום tripeptide והוא עבר על 1,670 -1 ס&quot;מ במדגם RGD-הידרוג&#39;ל . התעקמות NH, הקשורים הלהקה אמיד השנייה ( &quot;אמיד השנייה&quot; באיור 7), ניתן להקליט עם האות סביב 1,550 -1 ס&quot;מ בספקטרום RGD וזה גם לזיהוי במדגם הידרוג&#39;ל, בסביבות 1,600 ס&quot;מ - 1. מכיוון שאין כאן שום רכיבים אמידים בניסוח הידרוג&#39;ל הרגיל, הנוכחות של פסגות בעלות אופי amidic עולה כי PAA הוא פונקציונלי באמת עם RGD והוא מסוגל לגבש הידרוג&#39;ל עם אתרי פפטיד בתוך הרשת פולימריים. הספקטרום הידרוג&#39;ל FT-IR גם מראה הפסגות הקשורים רטט מתיחה של COC של קשר גליקוזידי (900-1,000 ס&quot;מ -1 טווח) בין היחידות monosaccharide של agarose ואת קבוצות אסתר. כדי לקבל תובנה על המבנה 3D ותכונות פיזיקליות ומכניות של הידרוג אלה, ניתוח SEM, gelation, קינטיקה נפיחות מחקרים rheological מבוצעות, כפי שפורט קודם עובד 13,20. תוצאות SEM (איור 8) מראות כי הידרוג&#39;ל מאופיין מבנה מיקרוסקופי מורכב עם כמה נקבובי גדולות המכילים נקבוביים קטנה ובחלק מרשתות סיביות על הקירות הנקבוביים. בנוסף, רוב הנקבוביות קשורים זה בזה. המבנה הסבוך דומה לרשת 3D של הידרוג שהוכן באותו אופן אבל בלי functionalization RGD. מכך ניתן להסיק כי RGD אינו משנה את רשת פולימר. באמצעות הבדיקה ניתן מבחנה ההפוכה, של הידרוג&#39;למתמצק בשפע בתוך 5 דקות, כפי שנצפה במדגם הידרוג&#39;ל ללא functionalization RGD 21. זמן gelation קצר זה מדגיש את התאמתה יישומים ביו. <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig8.jpg" /> איור 8:.. ניתוח SEM SEM תמונות להראות את המורפולוגיה של מדגם הידרוג&#39;ל פונקציונלי RGD (א) ו הידרוג&#39;ל ללא functionalization (B) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54445/54445fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יחס שיווי משקל הנפיחות מציין את היכולת לספוג ולשמור כמות גדולה של מים וזה אחד המאפיינים המובילים של מערכות הידרוג&#39;ל 20,22. הדגימות נותחו מהר תפגין נפיחות קינטיקה והם מגיעים נפיחות שיווי משקל במהלך השעה הראשונה. להתנפח שלהםQ ערך שיווי משקל ing מדווח העבודה הקודמת שלנו 16 וזה דומה הערך המתקבל על ידי ניתוח של הידרוג ללא RGD, המאשר כי tripeptide משולב עם רשת הפולימרים ואינו יוצר מכשול גבוה לתהליך gelation. עם מחקרים rheological, מודולוס אחסון ג&#39;ל (G&#39;) יימצא כ הזמנה אחת של גודל גבוה יותר מודולוס הפסד (G&#39;&#39;), מה שמעיד על אלסטי ולא חומר צמיג 23 ושניהם הינם בלתי תלויים בעיקרם מתדר. ערכים דומים של G&#39;ו G&#39;&#39; נרשמים עם המדגם ג&#39;ל ללא שינוי פפטיד 16. מכך ניתן להסיק כי הנוכחות של RGD בתוך הרשת פולימריים אינה משפיעה על מאפייני rheological של החומר, שמירה על התכונות המשונות מתחרות למערכת להזרקה עבור יישומים ביו.

Watch this Scientific Journal Video about The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications at JoVE.com

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

the-synthesis-rgd-functionalized-hydrogels-as-tool-for-therapeutic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Views.  Politecnico di Milano. We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated. 

Video: The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

יישומים ללוחות תאורה בקוד פתוח מיקרופלייט

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

סינתזה של כמעט אינפרא-אדום פליטת מזהב ננו אשכולות עבור יישומים ביולוגיים

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...