חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

הרשתית מורכבת מתאים רבים היוצרים מעגלים עצביים מגוונים, המהווים את השלב הראשון של מסלול הראייה. כל מעגל מאופיין בתכונות ייחודיות ובמוליכים עצביים מובחנים, הקובעים את תפקידו ואת משמעותו התפקודית. בהתחשב בסוגי התאים המורכבים בתוך המבנה שלה, המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה. כדי לחקור טוב יותר מעגלי רשתית ודיבור צולב, כגון הקשר בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית מדויקת (מוליכים עצביים או נוירופפטידים), כגון נוכחות של חומר דמוי תגובתיות חיסונית דמוית P ברשתית העכבר, השתמשנו בשיטת מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM) להטמעה מראש (immuno-EM) כדי לחקור קשרים סינפטיים וארגון. גישה זו מאפשרת לנו לאתר קשרים סינפטיים בין-תאיים ספציפיים ולוקליזציה מולקולרית מדויקת, ויכולה למלא תפקיד מנחה בחקר תפקידה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל (1) הכנת קיבוע רשתית, (2) הטבעה מראש של אימונוסטיין, ו-(3) לאחר קיבוע והטבעה.

המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה, בהתחשב בסוגי התאים המגוונים בתוך המבנה שלה ^1,2. השלב הראשוני כולל זיהוי קשרים סינפטיים בין תאים שונים וקביעת הלוקליזציה התאית של נוירוטרנסמיטורים או נוירופפטידים ספציפיים. ככל שהביולוגיה המולקולרית מתקדמת מציגה חלבונים חדשים, לוקליזציה מדויקת ברשתית הופכת חיונית להבנת תפקודיהם ולניתוח מעגלי הרשתית והקשרים הסינפטיים ^3,4,5.

בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) משמש בדרך כלל כדי לזהות את המבנים התת-תאיים של תאי עצב. EM יש סיווגים שונים, עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור קונבנציונאלי (TEM) המשמש לצפייה אולטרה מבנים התא 6,7,8,9. מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM), המשלב את הרזולוציה המרחבית של EM עם יכולת הזיהוי הכימית של נוגדנים הנקשרים באופן ספציפי לחלבונים¹⁰, בולט כשיטה האופטימלית והבלעדית לחקר קשרים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים תת-תאיים ברשתית ^11,12.

ניתן לחלק את טכניקות האימונו-EM לשיטות קדם-הטבעה ופוסט-הטבעה המבוססות על סדר ההטבעה והדגירה של נוגדנים. בהשוואה לשיטת ההטבעה שלאחר ההטבעה, גישת קדם-הטבעה מסוגלת לזיהוי בקנה מידה גדול ולמרחקים ארוכים 13,14,15, ומציעה גישה אופטימלית לחקר תהליכים תאיים כמו אקסונים ודנדריטים. בנוסף, טכניקה זו מספקת אות חזק ושדה ראייה רחב, מה שהופך אותה ליתרון לחקירות מקיפות של ביטוי חלבונים ולוקליזציה מולקולרית בציטופלסמה. שיטה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב במיוחד בהבטחת מבנים מזוהים כימית הנראים לאורך כל הציטופלסמה, התאים או הרשתית.

עם זאת, שיטת ההטבעה שלאחר ההטבעה, אף שהיא בעלת חדירה או דיפוזיה נמוכה יותר בהשוואה לשיטת ההטבעה המוקדמת, אינה רגישה כל כך^16,17. במילים פשוטות, אם המטרה היא לחקור את הלוקליזציה של נוירוטרנסמיטורים ספציפיים בציטופלסמה או במסופים סינפטיים, ההטבעה מראש של immuno-EM היא השיטה המועדפת. לעומת זאת, לצורך זיהוי לוקליזציה של קולטני ממברנה, מומלץ יותר להשתמש ב- EM אימונוגולד לאחר הטבעה.

בהתחשב בשיקולים אלה, אנו בוחרים בשיטת ההטבעה מראש של immuno-EM כדי להתעמק במעגלי הרשתית, כולל האינטראקציה בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית, כגון התפלגות וארגון סינפטי של תגובתיות חיסונית דמוית P (SP-IR) ברשתית העכבר.

הטיפול והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי תקנה של ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו בהתאם להנחיות ARVO. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים (C57BL/6J, זכר ונקבה, בני 8 עד 12 שבועות). הציוד והריאגנטים הדרושים למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לקיבוע הרשתית

1. הרכיבו את החומרים והכלים הבאים: מיקרוסקופ נתיחה, שני מלקחיים עם קצוות עדינים מאוד, מספריים, מחט מזרק 1 מ"ל (גודל מחט: G26) ונייר סינון.
2. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 2,2,2-tribromoethanol במשקל גוף של 0.25 מ"ג/גרם. לאחר מכן, ערפו את ראשיהם של העכברים וחתכו את ראשיהם¹⁶.
3. חנכו את עיניהם במספריים למרפק והניחו אותן בכלי זכוכית המכיל 4% פרפורמלדהיד-0.2% חומצה פיקרית בחיץ פוספט 0.1M (PB; pH 7.4).
4. תחת המיקרוסקופ המנתח מנקבים חור בלימבוס הקרנית באמצעות מחט מזרק 1 מ"ל וחותכים את המקטע הקדמי במספריים, בעקבות החור. לאחר מכן, הסר את העדשה משטח הרשתית הפנימית באמצעות מלקחיים.
5. השתמשו בשתי מלקחיים כדי לקלף בזהירות את לובן העין עד שהרשתית מבודדת לחלוטין מהעין (רקמת הרשתית המופרדת לחלוטין מהכורואידים). לאחר מכן, לחתוך את הרשתית לארבעה חלקים.
6. תקן חלקים אלה ב-4% paraformaldehyde-0.2% picric acid ב-0.1 M PB (pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן העבר את הרקמה ל-4% paraformaldehyde ב-0.1 M PB (pH 10.4) למשך הלילה ב-4°C.

2. הטמעה מוקדמת של אימונוסטיישן

1. לאחר שטיפה של 0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, יש לדגור על רקמות הרשתית בנתרן בורוהידריד 1% (NaBH₄) ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך 30 דקות.
2. יש לשטוף את מקטעי הרשתית ב-0.01 M PBS (pH 7.4) לפחות שש פעמים. בינתיים, להסיר את הזגוגית עם נייר סינון ולאחר מכן לחתוך את הרשתית לפרוסות קטנות בין 100-300 מיקרומטר באמצעות סכין גילוח פיפיות.
3. לאחר חסימה עם 5% סרום עיזים תקין (NGS) ב 0.1 M PB (pH 7.4) במשך 1 שעה ב RT, לדגור את פרוסות הרשתית עם נוגדנים ראשוניים (נגד ארנב PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) יחד עם 2% NGS ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך שעתיים ב-RT על שייקר. לאחר מכן, לדגור במשך 96 שעות (5 ימים) ב 4 °C על שייקר.
4. לאחר שטיפה שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת ב-0.01 M PBS (pH 7.4), יש לדגור על פרוסות הרשתית עם הנוגדן המשני ב-1:200, כגון IgG נגד ארנב עיזים, יחד עם 2% NGS ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך שעתיים ב-RT על שייקר. לאחר מכן, לדגור במשך 48 שעות (2 ימים) ב 4 ° C על שייקר.
   הערה: נוגדנים משניים יושמו לבד בניסויי ביקורת.
5. יש לשטוף את פסי הרשתית ב-0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לפני הדגירה עם מגיב A וריאגנט B מערכת ABC ב-1:100 ב-0.01M PBS (pH 7.4) למשך יומיים ב-4°C. (גם מגיב A וגם מגיב B דוללו ב-0.01 M PBS. לדוגמה: פתרון: 6 μl; תמיסת B: 6 מיקרוליטר; 0.01 M PBS: 588 μl, סה"כ 600 μl).
6. יש לשטוף את פסי הרשתית בחיץ טריס של 0.05 מטר (pH 7.2) שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן, יש לדגור מראש על פסי הרשתית עם מגיב 5% 1 ו-5% מגיב 3 מערכת DAB במים מזוקקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. (היחס לדוגמה: מגיב 1: 50 μl; מגיב 3: 50 μl; מים מזוקקים: 900 μl, סך של 1000 μl).
7. מכתימים את פסי הרשתית עם DAB. הוסף את אותו נפח תמיסה משלושה צינורות בערכת DAB ברצף (מגיב 1-מגיב 2-מגיב 3). שימו לב למצב הצביעה באמצעות מיקרוסקופ הדיסקציה. עצור את הכתמים כאשר התאים הופכים חומים; תהליך זה אורך 10-20 דקות.
8. שטפו את פסי הרשתית עם חיץ 0.05 M Tris (pH 7.2) שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולאחר מכן שטפו ב-0.01 M PBS שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת.

3. לאחר קיבוע והטבעה

1. תקן את פסי הרשתית ב-2% גלוטראלדהיד למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן שטוף ב-0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
2. דגרו על פסי הרשתית עם 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄) ב-0.1 M PB למשך שעה אחת ב-RT ושמרו אותם במקום חשוך.
3. לאחר שטיפה במים מזוקקים (ddH₂O) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, לדגור על רקמות הרשתית עם אורניל אצטט במשך שעה אחת ב- RT ולשמור אותם במקום חשוך כדי להכתים רקמות אלה.
4. שים את רקמות הרשתית בתמיסות אצטון (50%, 70%, 80% ו- 90%) למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן ב- 100% פעמיים למשך 10 דקות כל אחת.
5. טבלו את רקמות הרשתית בתערובת המכילה את אותו נפח של אורניל אצטט ושרף אפוקסי למשך שעה אחת בתנור ייבוש של 37°C, ולאחר מכן תערובת המכילה אורניל אצטט ואת השרף (1:4) למשך הלילה בתנור ייבוש של 37°C.
6. מעבירים את רקמות הרשתית בעדינות באמצעות קיסם לתוך השרף החדש למשך שעה אחת בטמפרטורה של 45°C בתנור ייבוש, ולאחר מכן פס הרשתית המכוון מוטבע בצלחת ההטבעה עם השרף.
7. הכניסו את הדגימה לתנור ייבוש בטמפרטורה של 45 מעלות למשך 3 שעות ולתנור ייבוש בטמפרטורה של 65 מעלות למשך 48 שעות.
8. עצבו את קוביות ההטבעה לטרפזים וחתכו את הבלוק למקטעים בעובי 1 מיקרומטר עם אולטרה-מיקרוטום, צבעו חלקים אלה בכחול טולוידין, והקרינו מראש אזורים מעניינים תחת מיקרוסקופ אור.
9. אספו מקטעים דקים במיוחד (70-90 ננומטר) על רשתות נחושת וצפו בהם תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

איור 1 מראה דוגמאות לניסויי בקרה ללא דגירה של נוגדנים ראשוניים כנגד חלבון קינאז C אלפא (PKCα) או SP, שבהם לא נמצאה תגובתיות חיסונית (IR).

איור 2 מתאר את PKCα-IR ברשתית העכבר. PKCα משמש כסמן לכל תאי המוט הדו-קוטבי (RBC) ברשתית¹⁸. ברמת מיקרוסקופ האלקטרונים (EM), ניתן לזהות RBC באמצעות PKCα-IR, המודגם על ידי תוצר התגובה דיאמינובנזידין (DAB) עם צפיפות אלקטרונים גבוהה. איור 2A מדגים דנדריט RBC חיובי ל-PKCα שיוצר סינפסה עם מסוף מוט בשכבת הפרספקס החיצונית (OPL), ואילו איור 2B מראה סינפסת חרוט-RBC שבה דנדריט RBC חיובי ל-PKCα הוא פוסט-סינפטי למסוף חרוט. בנוסף, מוצר תגובת DAB מסייע בזיהוי הדקי RBC (איור 2C) ותהליכים אקסונליים (איור 2D) בשכבת הפרספקס הפנימית (IPL).

איור 3 מציג את הביטוי של חומר P (SP) בקשרים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים ב-IPL של רשתית העכבר. תאים אמקריניים SP-IR הם קדם-סינפטיים לתאים אמקריניים שליליים SP-שליליים (איור 3A), כמו גם תהליכים אמקריניים SP-IR (הנתונים אינם מוצגים). יתר על כן, תאי SP-IR amacrine הם פוסט-סינפטיים עד טרמינלים דו-קוטביים ברמות תת-שכבה 3 (S3) ותת-שכבה 5 (S5) של IPL, בהתאמה (איור 3B,C). המחקר הקודם שלנו מפרט את ניתוח הסינפסות שבהן תהליכים של תאים אמקריניים SP-IR יוצרים פלטים סינפטיים על תהליכים אחרים ב- IPL¹⁹. יש לציין כי הלוקליזציה התת-תאית של SP נמצאת בעיקר בשלפוחיות סינפטיות במסופים הקדם-סינפטיים (איור 3).

איור 1: מיקרוגרפים של אלקטרונים חיסוניים מניסויי בקרה. גם פדיקור חרוט (CP) עם שני סרטים (ראש חץ) (A) וגם מוט ספרול (RS) עם סרט אחד ב-OPL (B) לא הראו שום צביעה. פסי קנה מידה: 500 ננומטר (A), 200 ננומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקרוגרפים של אלקטרונים אימונו-אלקטרונים המסומנים בנוגדן PKCα ברשתית העכבר. (A) RS מתחבר עם RBC חיובי אחד ל-PKCα (חיצים מציינים תגובתיות חיסונית) ושני תאים אופקיים (H) ב-OPL. (B) CP מתחבר עם RBC חיובי PKCα ב-OPL. (C) ו-(D) מציגים את מסוף RBC חיובי PKCα ואת התהליך האקסונלי ב-IPL, בהתאמה. פסי קנה מידה: 200 ננומטר (A), 500 ננומטר (B), 500 ננומטר (C), 500 ננומטר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מיקרוגרפים של אלקטרונים אימונו-אלקטרונים המסומנים עם נוגדן SP ב-IPL של רשתית העכבר. (A) תא אמקריני SP-IR (A+) הוא קדם-סינפטי לתא אמקריני שלילי SP (A-). תאי SP-IR amacrine קיבלו קלט ממסופים דו-קוטביים ברמות S3 (B) ו-S5 (C) של IPL, בהתאמה. פסי קנה מידה: 200 ננומטר (A), 200 ננומטר (B), 200 ננומטר (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מאמר זה תיאר שלושה שלבים קריטיים לתצפית מוצלחת של מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים: (1) קיבוע מהיר וחלש, (2) הטבעה מוקדמת של אימונוסטיין, ו-(3) קיבוע והטבעה לאחר קיבוע.

אנו מציעים כי קיבוע הוא שלב המפתח לגישה מוצלחת של הטמעה מראש של immuno-EM. לפיכך, מודגשת כאן חשיבותו של קיבוע טרי ומהיר, המכנה עיקרון זה "עקרון 4F", שהוא חיוני להכנת רקמות. עם זאת, השגת חדירת נוגדנים משופרת וקיבוע יעיל מציבה אתגר²⁰. כדי לטפל בכך, גלוטראלדהיד הוחלף בחומצה פיקרית במהלך הקיבוע הראשוני כדי לשפר את חדירת הנוגדנים, שכן גלוטראלדהיד יכול לשבש גורמים אנטיגניים ולהשפיע על צביעה חיסונית²¹. חומצה פיקרית, לעומת זאת, שומרת טוב יותר על מבנה הממברנה ושלמות הרקמה²², אם כי עם פשרה ביעילות הקיבוע. בשלב השלישי, 2% גלוטראלדהיד שימש לאחר קיבוע כדי לייעל את קיבוע הרקמות.

עיקרי הפרוטוקול המוצג כאן כוללים חמישה שלבים: (1) קיבוע מוקדם: שימוש בחומצה פיקרית בשלב המוקדם לחדירת נוגדנים טובה יותר תוך מזעור ההפרעה לדטרמיננטים אנטיגניים. (2) לאחר קיבוע: שימוש ב-2% גלוטראלדהיד כדי לשפר את קיבוע הרקמה לאחר צביעה חיסונית. (3) טיפול בהפחתה: דגירה על רקמה ב-1% NaBH₄ ב-0.1 M PB (pH 7.4) למשך 30 דקות כדי לשחזר חלק גדול מהתגובתיות החיסונית ולשפר את התגובה החיסונית של אנטיגנים ונוגדנים, תוך הגברת אותות חיוביים²³. (4) הכנת רקמות: הסרת זגוגית וחיתוך רקמת רשתית לרצועות קטנות כדי להקל על דגירה יעילה של נוגדנים ולהבטיח אותות אחידים. (5) יתר על כן, הכרחי לטפל ברקמת הרשתית בזהירות מירבית, תוך הימנעות מכל נזק שעלול לסכן את התצפיות הבאות לאורך כל ההליך. מדדים אלה תורמים באופן קולקטיבי להצלחת שיטת ההטמעה מראש של immuno-EM, ומאפשרים לחקור היבטים מגוונים כגון סינפסות חרוט-RBC²⁴, לוקליזציה מולקולרית SP-IR¹⁹, והביטוי המדויק של α-Syn ברשתית העכבר²⁵.

לפני הדגירה על הנוגדן הראשון, חיוני לחסום רצועות רשתית עם 2% NGS כדי למנוע הפרעות אות לא ספציפיות. ריכוז הנוגדן הראשון חייב להיקבע על סמך הנוגדן עצמו, בדרך כלל גבוה יותר מזה המשמש להכתמת חתך קפוא, ויש לייעל אותו מראש. במהלך תקופת הדגירה הראשונית של הנוגדנים, יש צורך בסיבוב רציף של צינור המיקרוצנטריפוגה כדי להבטיח מגע מלא של רצועות הרשתית המוערמות עם הנוגדן, ולמנוע חדירה חלקית של חלקים מוערמים. כדי להגביר את האות, DAB הודגר מראש לפני צביעת DAB סטנדרטית, כאשר זמן הצביעה הספציפי נע בדרך כלל בין 10-20 דקות. אם הזמן קצר מדי, האות עשוי להיות חלש מדי לתצפית, ואם הוא ארוך מדי, זה יכול להוביל לאותות חיוביים כוזבים, המשפיעים על שיפוט מדויק. בדרך כלל, זמן הדגירה של הצבעים תלוי ישירות בצבע פני השטח של הרקמה (חום עד חום כהה).

בעוד ניסויים בוצעו עם רקמה קפואה בחנקן נוזלי כדי להגביר את האות, כאמור 18,26,27, שיטה זו אכן הגבירה אותות חיוביים אך הביאה למבנה קרום לקוי של תאי רשתית (נתונים לא מוצגים). השפלה מבנית זו הקשתה על זיהוי מדויק של סוגי התאים. בהתחשב בכך, רקמת הרשתית לא הוקפאה שוב ושוב. כדי לשפר את האות החיובי, זמן הדגירה של נוגדנים הוארך כראוי. הפרוטוקול המוצע משלב יתרונות קודמים, ומפשט שלבים בהשוואה להטמעת אגר. זה לא רק מגן על הגורמים האנטיגניים של חלבונים, אלא גם שומר על שלמות קרום התא. מטרת העל היא לחקור קשרים סינפטיים ולוקליזציה תאית של מוליכים עצביים לאורך כל המסלול. לכן, תוצרי תגובת DAB בפרוטוקול לא עברו טיפול בהגברת כסף, מה שהופך אותו מתאים יותר לחקר קשרים סינפטיים ספציפיים למוליכים עצביים ומסלולים²⁸.

נכון לעכשיו, ישנן שיטות מוגבלות לזיהוי כימי של מסלולים או נוירוטרנסמיטורים ברמה ultrastructural. שיטה אחת כזו היא מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתואם (CLEM)^29,30, אשר מוגבל לשטח קטן מאוד וחסר את היכולת לזהות קשרים לאורך כל המסלול. נקודות החוזק של הטמעה מראש של immuno-EM טמונות באות החזק, בטווח הרחב וביכולת שלו למיקום אנליטי למרחקים ארוכים ומעקב 13,14,15. עם זאת, שיטה זו יש גם מגבלות שלה, כגון אותות מפוזרים, מה שהופך אותם פחות ספציפיים. עבור לוקליזציה מדויקת של קולטני הממברנה, במיוחד אלה על הממברנה, זה עשוי להיות מתאים יותר להשתמש EM אימונוגולד לאחר הטבעה. טכניקה זו מאפשרת ספירה ישירה של חלקיקי זהב, ומקלה על ניתוח מספרם והשתנותם של קולטני ממברנה אלה¹⁶.

בעתיד, השילוב של טרום הטבעה של immuno-EM עם נפח EM טומן בחובו הבטחה כשיטה יעילה לחקר ארוך טווח של מעגלים עצביים מזוהים, המייצגים את נקודות המבט העתידיות לפיתוח נוסף של שיטה זו. נפח EM מתמקד בשחזור מבנים, תוך הסתמכות על מורפולוגיה לזיהוי מבנים ספציפיים, ללא זיהוי כימי מדויק^31,32. על ידי שילוב של הטבעה מראש של immuno-EM עם EM נפח, ניתן לזהות מבנים או חומרים ספציפיים במהלך שחזור תלת ממדי, מה שמספק גישה מקיפה יותר ואינטואיטיבית יותר מבחינה חזותית לזיהוי מעגלים עצביים.

למחברים אין גילויים.

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019).