Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée

Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.

La rétine comprend de nombreuses cellules formant divers circuits neuronaux, qui constituent la première étape de la voie visuelle. Chaque circuit est caractérisé par des caractéristiques uniques et des neurotransmetteurs distincts, déterminant son rôle et sa signification fonctionnelle. Étant donné la complexité des types de cellules au sein de sa structure, la complexité des circuits neuronaux de la rétine pose des défis pour l’exploration. Pour mieux étudier les circuits rétiniens et la diaphonie, tels que le lien entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire précise (neurotransmetteurs ou neuropeptides), comme la présence d’une immunoréactivité de type P dans la rétine de la souris, nous avons utilisé une méthode d’immunomicroscopie électronique pré-intégrée (immuno-EM) pour explorer les connexions synaptiques et l’organisation. Cette approche nous permet d’identifier des connexions synaptiques intercellulaires spécifiques et une localisation moléculaire précise et pourrait jouer un rôle guide dans l’exploration de sa fonction. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris (1) la préparation de la fixation de la rétine, (2) l’immunocoloration avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.

La complexité des circuits neuronaux de la rétine présente des défis pour l’exploration, compte tenu de la diversité des types de cellules au sein de sa structure ^1,2. La première étape consiste à identifier les connexions synaptiques entre différentes cellules et à déterminer la localisation cellulaire de neurotransmetteurs ou neuropeptides spécifiques. À mesure que les progrès de la biologie moléculaire introduisent de nouvelles protéines, une localisation précise dans la rétine devient cruciale pour comprendre leurs fonctions et analyser les circuits rétiniens et les connexions synaptiques ^3,4,5.

En raison de la résolution limitée de la microscopie optique, la microscopie électronique (EM) est couramment utilisée pour détecter les structures subcellulaires des cellules nerveuses. EM a différentes classifications, la microscopie électronique à transmission conventionnelle (MET) étant utilisée pour l’observation des ultrastructures^cellulaires 6,7,8,9. L’immunomicroscopie électronique (immuno-EM), qui combine la résolution spatiale des EM avec la capacité d’identification chimique des anticorps se liant spécifiquement aux protéines¹⁰, se distingue comme la méthode optimale et exclusive pour étudier les connexions synaptiques et la localisation des protéines subcellulaires dans la rétine^11,12.

Les techniques d’immuno-EM peuvent être divisées en méthodes de pré-intégration et de post-intégration en fonction de l’ordre d’intégration et d’incubation des anticorps. Par rapport à la méthode de post-intégration, l’approche de pré-intégration est capable d’une identification à grande échelle et à longue distance 13,14,15, offrant une approche optimale pour l’étude des processus cellulaires tels que les axones et les dendrites. De plus, cette technique fournit un signal fort et un large champ de vision, ce qui la rend avantageuse pour des études complètes de l’expression des protéines et de la localisation moléculaire dans le cytoplasme. Cette méthode s’avère particulièrement précieuse pour garantir des structures chimiquement identifiées qui sont visibles dans l’ensemble du cytoplasme, des cellules ou de la rétine.

Cependant, la méthode de post-intégration, bien qu’ayant une pénétration ou une diffusion plus faible par rapport à la méthode de pré-intégration, n’est pas aussi sensible^16,17. En termes simples, si l’objectif est d’explorer la localisation de neurotransmetteurs spécifiques dans le cytoplasme ou les terminaisons synaptiques, l’immuno-EM de pré-intégration est la méthode privilégiée. À l’inverse, pour identifier la localisation des récepteurs membranaires, il est plus recommandé d’utiliser l’immunogold EM post-intégration.

Compte tenu de ces considérations, nous optons pour la méthode immuno-EM de pré-intégration pour approfondir les circuits rétiniens, y compris l’interaction entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire, telle que la distribution et l’organisation synaptique de l’immunoréactivité de type P (SP-IR) dans la rétine de la souris.

Les soins et la manipulation des animaux ont été approuvés par le règlement du comité d’éthique de l’Université de médecine de Wenzhou conformément aux directives de l’ARVO. Des souris adultes (C57BL/6J, mâles et femelles, âgées de 8 à 12 semaines) ont été utilisées dans cette recherche. L’équipement et les réactifs nécessaires à l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation à la fixation de la rétine

1. Assemblez le matériel et les outils suivants : un microscope à dissection, deux pinces à pointes très fines, des ciseaux, une aiguille de seringue de 1 ml (taille de l’aiguille : G26) et du papier filtre.
2. Anesthésier profondément les souris par injection intrapéritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à 0,25 mg/g de poids corporel. Par la suite, décapitez les souris et coupez-leur la tête¹⁶.
3. Énucléez leurs yeux avec des ciseaux coudiques et placez-les dans un plat en verre contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,2 % d’acide picrique dans un tampon phosphate 0,1 M (PB ; pH 7,4).
4. Sous le microscope de dissection, percer un trou au niveau du limbe cornéen à l’aide d’une aiguille à seringue de 1 mL et couper le segment antérieur avec des ciseaux, en suivant le trou. Ensuite, retirez le cristallin de la surface interne de la rétine à l’aide d’une pince.
5. À l’aide de deux pinces, décollez soigneusement la sclérotique jusqu’à ce que la rétine soit complètement isolée de l’œilleton (le tissu rétinien en forme de cuisse se sépare complètement de la choroïde). Par la suite, coupez la rétine en quatre morceaux.
6. Fixez ces sections dans du paraformaldéhyde à 4 % et de l’acide picrique à 0,2 % dans 0,1 M PB (pH 7,4) pendant 2 h à température ambiante (RT), puis transférez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % dans 0,1 M PB (pH 10,4) pendant une nuit à 4 °C.

2. Immunomarquage pré-intégré

1. Après avoir lavé dans 0,01 M PBS (pH 7,4) six fois pendant 10 min chacune, incubez les tissus rétiniens dans du borohydrure de sodium à 1 % (NaBH₄) dans 0,01 M PBS (pH 7,4) pendant 30 min.
2. Laver les sections rétiniennes dans 0,01 M de PBS (pH 7,4) au moins six fois. Pendant ce temps, retirez le vitré avec du papier filtre, puis coupez la rétine en petites tranches entre 100 et 300 μm à l’aide d’une lame de rasoir à double tranchant.
3. Après avoir bloqué avec 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans 0,1 M PB (pH 7,4) pendant 1 h à RT, incuber les tranches rétiniennes avec des anticorps primaires (PKCα anti-lapin, 1:80 ; Anti-Rabbit SP, 1:100) avec 2% NGS dans 0,01 M PBS (pH 7,4) pendant 2 h à RT sur agitateur. Par la suite, incuber pendant 96 h (5 jours) à 4 °C sur un agitateur.
4. Après avoir lavé six fois pendant 10 minutes chacune dans 0,01 M de PBS (pH 7,4), incubez les tranches rétiniennes avec l’anticorps secondaire à 1:200, comme l’IgG anti-lapin de chèvre, ainsi que 2 % de NGS dans 0,01 M de PBS (pH 7,4) pendant 2 h à RT sur un agitateur. Ensuite, incuber pendant 48 h (2 jours) à 4 °C sur un agitateur.
   REMARQUE : Les anticorps secondaires ont été appliqués seuls dans les expériences de contrôle.
5. Laver les bandes rétiniennes dans du PBS 0,01 M (pH 7,4) six fois pendant 10 min chacune avant de les incuber avec le réactif A et le réactif B du kit ABC à 1:100 dans du PBS 0,01M (pH 7,4) pendant 2 jours à 4 °C. (Le réactif A et le réactif B ont été dilués avec 0,01 M de PBS. Par exemple : Une solution : 6 μl ; solution B : 6 μl ; 0,01 M PBS : 588 μl, total de 600 μl).
6. Lavez les bandes rétiniennes dans un tampon Tris 0,05 M (pH 7,2) trois fois pendant 10 min chacune. Ensuite, pré-incubez les bandes rétiniennes avec 5 % du réactif 1 et 5 % du réactif 3 du kit DAB dans de l’eau distillée pendant 1 heure à température ambiante. (Le rapport par exemple : réactif 1 : 50 μl ; réactif 3 : 50 μl ; eau distillée : 900 μl, total de 1000 μl).
7. Teindre les bandes rétiniennes avec du DAB. Ajouter le même volume de solution à partir de trois tubes du kit DAB dans l’ordre (réactif 1-réactif 2-réactif 3). Observez l’état de coloration à l’aide du microscope de dissection. Arrêter la coloration lorsque les cellules deviennent brunes ; Ce processus prend 10 à 20 min.
8. Lavez les bandes rétiniennes avec un tampon Tris 0,05 M (pH 7,2) trois fois pendant 10 min chacune, puis lavez-les six fois avec du PBS 0,01 M pendant 10 min chacune.

3. Post-fixation et intégration

1. Fixez les bandes rétiniennes dans du glutaraldéhyde à 2 % pendant 1 à 2 h à température ambiante (RT), puis lavez-les dans du PBS 0,01 M (pH 7,4) six fois pendant 10 minutes chacune.
2. Incuber les bandes rétiniennes avec 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO₄) dans 0,1 M PB pendant 1 h à RT et les conserver dans un endroit sombre.
3. Après s’être lavés à l’eau distillée (ddH₂O) six fois pendant 10 min chacune, incubez les tissus rétiniens avec de l’acétate d’uranyle pendant 1 h à RT et conservez-les dans un endroit sombre pour colorer ces tissus.
4. Mettez les tissus rétiniens dans des solutions d’acétone (50 %, 70 %, 80 % et 90 %) pendant 10 minutes chacune, puis dans 100 % deux fois pendant 10 minutes chacune.
5. Tremper les tissus rétiniens dans un mélange contenant le même volume d’acétate d’uranyle et une résine époxy pendant 1 h à une étuve de séchage à 37 °C, puis un mélange contenant de l’acétate d’uranyle et de la résine (1:4) pendant une nuit à une étuve de séchage à 37 °C.
6. Transférez doucement les tissus rétiniens à l’aide d’un cure-dent dans la nouvelle résine pendant 1 h à 45 °C dans une étuve de séchage, puis la bande rétinienne orientée est incorporée dans la plaque d’enrobage avec la résine.
7. Placez l’échantillon dans une étuve de séchage à 45 °C pendant 3 h et dans une éveuse de séchage à 65 °C pendant 48 h.
8. Façonnez les blocs d’enrobage en trapèzes et coupez le bloc en sections de 1 μm d’épaisseur avec un ultramicrotome, colorez ces sections avec du bleu de toluidine et pré-criblez les régions d’intérêt au microscope optique.
9. Prélever des coupes ultraminces (70-90 nm) sur des grilles de cuivre et les observer au microscope électronique.

La figure 1 montre des exemples d’expériences de contrôle sans incubation d’anticorps primaires contre la protéine kinase C alpha (PKCα) ou SP, dans lesquelles aucune immunoréactivité (IR) n’a été trouvée.

La figure 2 représente la PKCα-IR dans la rétine de la souris. PKCα sert de marqueur pour toutes les cellules bipolaires en bâtonnets (GR) de la rétine¹⁸. Au niveau de la microscopie électronique (EM), les GR peuvent être identifiés par PKCα-IR, visualisés par le produit de réaction de la diaminobenzidine (DAB) à haute densité électronique. La figure 2A illustre une dendrite de globules rouges PKCα positive formant une synapse avec une borne de bâtonnet dans la couche plexiforme externe (OPL), tandis que la figure 2B montre une synapse conique-globules rouges où une dendrite de globules rouges PKCα positive est post-synaptique à une terminaison conique. De plus, le produit de réaction DAB aide à identifier les terminaisons des globules rouges (figure 2C) et les processus axonaux (figure 2D) dans la couche plexiforme interne (IPL).

La figure 3 montre l’expression de la substance P (SP) dans les connexions pré et post-synaptiques dans l’IPL de la rétine de la souris. Les cellules amacrines SP-IR sont présynaptiques aux cellules amacrines SP-négatives (Figure 3A) ainsi qu’aux processus amacrines SP-IR (données non présentées). De plus, les cellules amacrines SP-IR sont post-synaptiques à bipolaires dans les niveaux de la sous-couche 3 (S3) et de la sous-couche 5 (S5) de l’IPL, respectivement (Figure 3B, C). Nos recherches précédentes détaillent l’analyse des synapses où les processus des cellules amacrines SP-IR forment des sorties synaptiques sur d’autres processus dans l’IPL¹⁹. Notamment, la localisation subcellulaire de SP se trouve principalement dans les vésicules synaptiques des terminaisons présynaptiques (Figure 3).

Figure 1 : Immunomicrographies électroniques issues d’expériences de contrôle. Le pédicule conique (CP) avec deux rubans (pointe de flèche) (A) et la sphérule de bâtonnet (RS) avec un ruban dans la LPO (B) n’ont montré aucune coloration. Barres d’échelle : 500 nm (A), 200 nm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Immunomicrographies électroniques marquées avec un anticorps PKCα dans la rétine de la souris. (A) RS se connecte à un GR PKCα positif (les flèches indiquent l’immunoréactivité) et à deux cellules horizontales (H) dans l’OPL. (B) CP se connecte avec des globules rouges PKCα positifs dans l’OPL. (C) et (D) montrent le processus terminal et axonal des globules rouges PKCα positifs dans l’IPL, respectivement. Barres d’échelle : 200 nm (A), 500 nm (B), 500 nm (C), 500 nm (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Immuno-micrographies électroniques marquées avec l’anticorps SP dans l’IPL de la rétine de souris. (A) La cellule amacrine SP-IR (A+) est présynaptique à une cellule amacrine SP-négative (A-). Les cellules amacrines SP-IR ont reçu des entrées de terminaux bipolaires dans les niveaux S3 (B) et S5 (C) de l’IPL, respectivement. Barres d’échelle : 200 nm (A), 200 nm (B), 200 nm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cet article a décrit trois étapes critiques pour l’observation réussie des circuits synaptiques et de la localisation des protéines : (1) la fixation rapide et faible, (2) l’immunomarquage avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.

Nous proposons que la fixation soit l’étape clé d’une approche immuno-EM réussie de pré-intégration. Ainsi, l’importance d’un fixateur frais et d’une fixation rapide est soulignée ici, nommant ce principe le « principe 4F », qui est crucial dans la préparation des tissus. Cependant, l’amélioration de la pénétration des anticorps et l’efficacité de la fixation posent un défi²⁰. Pour résoudre ce problème, le glutaraldéhyde a été remplacé par de l’acide picrique lors de la fixation initiale afin d’améliorer la pénétration des anticorps, car le glutaraldéhyde peut perturber les déterminants antigéniques et affecter l’immunocoloration²¹. L’acide picrique, en revanche, préserve mieux la structure de la membrane et l’intégrité des tissus²², bien qu’avec un compromis sur l’efficacité de la fixation. Dans la troisième étape, 2% de glutaraldéhyde a été utilisé pour la post-fixation afin d’optimiser la fixation tissulaire.

Les points clés du protocole présentés ici comprennent cinq étapes : (1) Fixation précoce : Utilisation de l’acide picrique à un stade précoce pour une meilleure pénétration des anticorps tout en minimisant la perturbation des déterminants antigéniques. (2) Post-fixation : Utilisation de glutaraldéhyde à 2 % pour améliorer la fixation des tissus après immunomarquage. (3) Traitement de réduction : Incubation de tissu dans 1% de NaBH₄ dans 0,1 M PB (pH 7,4) pendant 30 min pour restaurer une grande partie de l’immunoréactivité et améliorer la réactivité immunitaire des antigènes et des anticorps, intensifiant les signaux positifs²³. (4) Préparation des tissus : Enlever le vitré et couper le tissu rétinien en petites bandes pour faciliter l’incubation efficace des anticorps et assurer des signaux uniformes. (5) De plus, il est impératif de manipuler le tissu rétinien avec le plus grand soin, en évitant tout dommage qui pourrait compromettre les observations ultérieures tout au long de la procédure. Ces mesures contribuent collectivement au succès de la méthode immuno-EM de pré-intégration, permettant d’étudier divers aspects tels que les synapses cônes-globules rouges²⁴, la localisation moléculaire SP-IR¹⁹ et l’expression précise de α-Syn dans la rétine de souris²⁵.

Avant d’incuber le premier anticorps, il est essentiel de bloquer les bandelettes rétiniennes avec 2% de NGS pour éliminer les interférences de signal non spécifiques. La concentration du premier anticorps doit être déterminée sur la base de l’anticorps lui-même, généralement plus élevée que celle utilisée pour la coloration en section congelée, et doit être optimisée au préalable. Pendant la période d’incubation de l’anticorps primaire, une rotation continue du tube de microcentrifugation est nécessaire pour assurer un contact complet des bandelettes rétiniennes empilées avec l’anticorps, empêchant ainsi la pénétration incomplète des pièces empilées. Pour amplifier le signal, le DAB a été pré-incubé avant la coloration DAB standard, le temps de coloration spécifique allant généralement de 10 à 20 minutes. Si le temps est trop court, le signal peut être trop faible pour l’observation, et s’il est trop long, il peut conduire à des signaux faussement positifs, affectant un jugement précis. Généralement, le temps d’incubation des colorants dépend directement de la couleur de surface du tissu (brun à brun foncé).

Bien que des expériences aient été réalisées avec des tissus congelés dans de l’azote liquide pour améliorer le signal, comme mentionné précédemment 18,26,27, cette méthode a amplifié les signaux positifs mais a entraîné une mauvaise structure membranaire des cellules rétiniennes (données non présentées). Cette dégradation structurelle a rendu difficile l’identification précise des types de cellules. Compte tenu de cela, le tissu rétinien n’a pas été congelé à plusieurs reprises. Pour améliorer le signal positif, le temps d’incubation des anticorps a été prolongé de manière appropriée. Le protocole proposé combine les avantages précédents, simplifiant les étapes par rapport à l’enrobage de gélose. Cela permet non seulement de protéger les déterminants antigéniques des protéines, mais aussi de préserver l’intégrité des membranes cellulaires. L’objectif global est d’explorer les connexions synaptiques et la localisation cellulaire des neurotransmetteurs tout au long de la voie. Par conséquent, les produits de réaction DAB du protocole n’ont pas subi de traitement d’intensification de l’argent, ce qui le rend plus adapté à l’étude des connexions et des voies synaptiques spécifiques aux neurotransmetteurs²⁸.

À l’heure actuelle, il existe peu de méthodes d’identification chimique des voies ou des neurotransmetteurs au niveau ultrastructurel. L’une de ces méthodes est la microscopie optique et électronique corrélée (CLEM)^29,30, qui, cependant, est confinée à une très petite zone et n’a pas la capacité d’identifier les connexions tout au long de la voie. Les points forts de l’immuno-EM pré-intégré résident dans son signal robuste, sa large portée et sa capacité de positionnement et de suivi analytiques à longue distance 13,14,15. Cependant, cette méthode a aussi ses limites, comme les signaux diffus, qui les rendent moins spécifiques. Pour la localisation précise des récepteurs membranaires, en particulier ceux qui se trouvent sur la membrane, il peut être plus approprié d’utiliser l’immunogold EM post-intégration. Cette technique permet de compter directement les particules d’or, facilitant ainsi l’analyse du nombre et de la variabilité de ces récepteurs membranaires¹⁶.

À l’avenir, l’intégration de l’immuno-EM pré-intégrée avec l’EM volumique est prometteuse en tant que méthode efficace pour l’exploration à long terme des circuits neuronaux identifiés, représentant les perspectives futures pour le développement ultérieur de cette méthode. Le volume EM se concentre sur la reconstruction des structures, en s’appuyant sur la morphologie pour l’identification de structures spécifiques, en l’absence d’identification chimique précise^31,32. En combinant l’immuno-EM pré-intégrée avec l’EM volumique, des structures ou des substances spécifiques peuvent être identifiées lors de la reconstruction tridimensionnelle, offrant une approche plus complète et visuellement intuitive de l’identification des circuits neuronaux.

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de Chine (2022YFA1105503), du Laboratoire d’État clé de neurosciences (SKLN-202103) de la Fondation des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (Y21H120019).